Summary
Vi demonstrerar en metod för att bilda flera molekyler inom heterogena nanostrukturer vid enkel molekyls noggrannhet med användning av sekventiell bindning och eluering av fluorescensmärkta antikroppar.
Abstract
Imaging heterogena cellulära strukturer med användning av molekyl-lokaliseringsmikroskopi har hindrats av otillräcklig lokaliserings precision och multiplexeringsförmåga. Med hjälp av fluorescerande nano-diamantfiducialmarkörer beskriver vi driftkorrigerings- och anpassningsförfarandena som erfordras för att erhålla hög precision i enkelmolekyl lokaliseringsmikroskopi. Dessutom beskrivs en ny multiplexstrategi, madSTORM, i vilken multipla molekyler är riktade i samma cell med användning av sekventiell bindning och eluering av fluorescerande antikroppar. MadSTORM demonstreras på en aktiverad T-cell för att visualisera läget för olika komponenter i en membranbunden, multi-proteinstruktur kallad T-cellreceptormikroklusten. Dessutom diskuteras applicering av madSTORM som ett allmänt verktyg för visualisering av multi-proteinstrukturer.
Introduction
En mängd mikrosupplösningsmikroskopitekniker har utvecklats för att övervinna diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi (~ 200 nm). Bland dessa är en kategori av tekniker som kallas single molecule localization microscopy (SMLM) som inkluderar fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). SMLM-tekniker delar i användningen av fluoroforer som kan växlas mellan på (fluorescerande) och av (mörka / fotoomkopplade) tillstånd, vilket möjliggör sekventiell lokalisering av fluorescens från enskilda molekyler 1 , 2 , 3 .
På grund av dess kompatibilitet med kommersiellt tillgängliga färgämnen och mikroskop har direkt STORM (dSTORM) blivit en allmänt vedertagen SMLM-teknik 4 . DSTORM kan rutinmässigt uppnå ~ 10 nm lokaliserings precision, definierad som osäkerheten vid beräkning av centrum för en diffraktionJon-begränsad punktspridningsfunktion (PSF). Trots den höga precisionen som uppskattats med användning av lokaliseringsalgoritmerna 5 , 6 , 7 har emellertid en bestämd bestämning av den faktiska placeringen av enskilda molekyler hindrats av ett antal problem. För det första lägger mekanisk rörelse av mikroskopsteget under bildförvärv stor osäkerhet på lokaliserings precision. När SMLM-bilder erhålls över tusentals tidsramar kan nanoskala-rörelser i mikroskopsteget på ett väsentligt sätt kompromissa med precisionen hos den slutliga superupplösningsbilden 8 . För att kompensera för scenrörelse under bildförvärv beräknas stegdrift vanligtvis från regressionsbaserad montering av inåtpositioneringar från själva bilden (korskorrelation) eller sekventiella lokaliseringar från fiducialmarkörer (fiducial-korrektion) 1 , 9 . howevDet innebär att dessa metoder kräver optimering av flera parametrar för varje bildstapel och kan inte redovisa scenrörelser vid korta tidsskalor som mekanisk vibration. Guldnanopartiklar och flerfärgade fluorescerande pärlor har använts som fiducialmarkörer i SMLM, men de är inte fotostabila och resulterar i signifikant lägre precision efter driftskorrigering än de fluorescerande nanodiamanterna (FND) som används för kvävgascentraler. I madSTORM 10 .
Förutom diffraktionsgränsen är ljusmikroskopi ytterligare begränsad av spektralgränser. Samtidig visualisering av flera mål kräver fluorescerande sonder med icke-överlappande spektralprofiler, vilket i allmänhet begränsar fluorescensbaserad ljusmikroskopi till 6 färger och SMLM till 2-3 färger 4 , 11 , 12 . Dessutom orsakar icke-linjär kromatisk avvikelse felinriktning av mångfärgade bilder, wSom kräver omfattande anpassningsförfaranden med hjälp av flerfärgade fiducialmarkörer 8 , 13 . För att övervinna dessa gränser har tidigare studier avbildat flera mål med användning av repetitiv fotobildning eller kemisk släckning av sekventiellt bundna fluoroforer 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Medan dessa metoder kan övervinna de spektrala gränserna för mikroskopi, är fluorescensblekning känt för att vara en toxisk process 20 , och långvarig blekning eller släckning kan orsaka oönskade bieffekter såsom förlust av tvärbindning. Vidare kan ackumuleringen av fluorescerande prober leda till sterisk blockering av bindningsställen i provet, förhindrande av storskalig multiplexering och robust målning av epitoper. För att undvika sådan sterisk störning, en nyligen sTudy uppnådd multiplexering med användning av stokastisk utbyte av fritt diffunderande proteinfragment 21 . Medan denna metod tillåter tät märkning av cellulära strukturer krävs det omfattande biokemisk beredning för att isolera peptidfragment, kan inte lokalisera molekylpositioner och lättar inte lätt för storskalig multiplexering med användning av kommersiellt tillgängliga prober. Vi presenterar ett detaljerat videoprotokoll som beskriver sekventiell bindning och eluering av fluorescensantikroppar för multiplexerad, antikroppstorleksbegränsad dSTORM (madSTORM) avbildning och användning av fluorescerande nanodiamanter för att uppnå exakt driftskorrigering och anpassning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Vänligen se alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Flera av de kemikalier som används i detta protokoll är giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsmetoder vid genomförandet av protokollet, inklusive användning av tekniska kontroller (spishäll, handskfack) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, fulla längdbyxor, stängda tånskor).
1. Multiplexerad bildning av aktiverade T-celler
- Direktkonjugerade antikroppar med Alexa-647 (A647) färgämne med användning av Alexa 647-antikroppsmärkningssatsen. Följ märkningsprotokollet från tillverkaren.
OBS: Dialys av antikroppslösning i 1x PBS rekommenderas före detta steg för att öka antikroppsmärkningseffektiviteten. - Spin-märkta antikroppar i 5 min vid 20 800 rcf och samla supernatant för att avlägsna aggregerade antikroppar.
- Framställning av fluorescerande nanomantelbelagda täckglas
- Förbered utspädning av 100 nm FND i 1x PBS. Testa olika utspädningar för att säkerställa att tillräckligt med FNDs är synliga varje synfält i steg 1.2.7 (vi använder en 1: 200 utspädning av FND som tillhandahålls av tillverkaren).
- Vortex de utspädda FNDs i 1 min.
- Sonikera FND-supernatanten i 30 s vid hög effekt.
- Inkubera sonikerad FND-supernatanten i en PLL-belagd 8-brunns täckglaskammare under 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta 5x med 1x PBS och visualisera den FND-belagda kammaren med hjälp av 647 nm laser excitation på TIRF-mikroskopet. Ideellt sett bör 4-10 enskilda FNDs vara synliga i synfält med tanke på lämplig utspädning av FND i steg 1.2.2 (vi använder ett 100X-objekt med 256 x 256 kamera pixel inställning för att ge 61 x 61 μm synfält) Med påMinst en FND närvarande i varje kvadrant av bildfältet. Om FNDs verkar vara sammanslagna ( dvs FNDs med signifikant högre signal än omgivande FNDs och en punktspridningsfunktion större än 200 nm) centrifuger FNDs vid 6 800 rcf i 1 min och upprepar beläggningsförfarandet med användning av FND-supernatanten.
- Tillsätt 250 μl anti-CD3-antikropp (10 μg / ml) i varje brunn och inkubera i 1 h vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C.
- Ta bort lösningen och tillsätt 1x PBS i 30 sekunder. Upprepa detta tvättsteg 5 gånger (tvätt 5x).
- Spin 1 ml Jurkat T-celler vid 800 rcf under 6 minuter och resuspendera i 300 | il 1x HBS-lösning. Jurkat T-celler bör helst vara i en koncentration av 0,5-1,0 x 10 6 celler / ml innan de spolas. 1x HBS-lösning består av HEPES-buffertlösning med 1% bovint serumalbumin som beskrivits tidigare 22 .
- Tillsätt 150 μlAv 1x HBS-lösning i varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 15 minuter.
- Tillsätt 50 μl resuspenderad Jurkat T-celler till varje brunn och inkubera i 3 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 300 μl 4% paraformaldehyd till varje brunn och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
- Tvätta 3x med 1x PBS.
- Permeabilisera celler genom att tillsätta 250 | il av 0,1% Triton-X lösning under 5 min vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x med 1x PBS.
- Tillsätt 250 μL 1% fiskgelatinlösning i 1x PBS till varje brunn i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x med 1x PBS.
- Tillsätt 200 μl märkt antikropp vid 0,1-0,5 μg / ml till fixerade celler i 1 h vid rumstemperatur.
- Tvätta 5x med 1x PBS.
- Tillsätt 1 ml STORM-buffert och täck kammaren med ett glasskydd för att begränsa exponeringen för luft. STORM-bufferten har tidigare beskrivits 10 . Vi rekommenderar maKung ny STORM-buffert för varje bildrunda och spinning STORM-bufferten vid 20 800 rcf i 2 min för att avlägsna fällningar.
- Använd en låg 647 nm laserkraft i TIRF-läget, leta efter en färgad cell med minst 3 FND i synfältet. För att hjälpa till med att lokalisera FND, kan samtidig spänning med 568 nm laser användas för att öka ljusstyrkan hos FND-signalen.
ANMÄRKNING: Resultatet av den genomsnittliga fiducialkorrigeringen som beskrivs i avsnitt 2.1 förbättras med införandet av fler FND-enheter. - Öka 647 nm laserkraft och skaffa bilder. Vi förvärvar vanligtvis 10 000 ramar vid exponering på 200 ms, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objektivlins (1,49 NA), 100 x EM-förstärkning (5 MHz vid 16 bitar, omvandlingsförstärkning 1). Detaljer om vår bildbehandling har tidigare beskrivits 10 .
- Tvätta 5x med 1x TBS.
- Tillsätt 1 ml oF-elueringsbuffert (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) och inkubera vid rumstemperatur i 1 min.
- Upprepa elueringen 3 gånger. (Exakta elueringsförhållanden och antalet elueringsspolor som behövs för att ta bort signalen måste kontrolleras för varje antikropp som används).
- Tvätta 3x med 1x TBS och tillsätt 1 ml 1x PBS.
- Photobleach använder 647 nm laser vid hög effekt (125 mW) med 405 nm laser vid 2-5 mW för att fotoaktivera A647 färgämnen i mörkt tillstånd. Vänta tills all återstående signal från icke-eluerad antikropp är photobleached. Vanligtvis tar det 2-5 s av laserexponering. För att bekräfta avlägsnande av signalen rekommenderas att ta provbilder (~ 100 bilder) med STORM-inställningarna i 1.3.5 efter eluering och fotobildning.
Vi tar normalt bort 99,8% av signalen med den här metoden. Vi rekommenderar att du testar elueringseffektiviteten hos varje antikropp före användning i madSTORM som visats tidigare 10 . - Tillsätt 250 μl 4% paraformaldehyd i 15 minuter. Detta prHändelser omvänt tvärbindning av fasta molekyler i cellen.
- Tvätta 3x med 1x PBS.
- Upprepa steg 1.3.1-1.3.12 för sekventiell märkning av flera mål. Figur 1 visar en sammansatt bild av multipla molekyler i en aktiverad Jurkat T-cell som förvärvats med användning av madSTORM.
2. Driftkorrigering och justering av multiplexerade bildstackar
- Driftkorrigering av madSTORM bildstaplar
- Öppna bilder med ImageJ. Vi rekommenderar att konvertera bildfilerna till ett TIFF-format innan de öppnas i ImageJ. Använd rektangel ROI för att välja en enda FND. Spela tiden för att se till att FND är synlig i varje ram i bildstapeln. Använd Kör analys i ThunderSTORM-plugin för att lokalisera FND. För den genomsnittliga fiducial-korrektionsmetoden som beskrivs i 2.1.5 är det viktigt att en enda FND är lokaliserad i varje bildram ( dvs antalet identifierade toppar ska vara eKvalifiera till antal ramar).
- Om FND inte identifieras i varje ram, välj en annan FND. Om flera toppar finns i en enda ram, ta bort toppen som avviker mest från tidigare toppar.
- Upprepa 2.1.2 för varje FND i bildstapeln. Tänk på att vissa FND inte ska inkluderas i driftskorrigeringsprocessen, så att de kan fungera som en oberoende mätare för driftskorrektionsprecision som beskrivs i steg 2.1.7.
- För snabbare, mindre precision driftkorrigering, använd antingen korskorrelations- eller fiducialkorrigeringsalgoritmerna som ingår i ThunderSTORM för att korrigera FND-bilderna. Vanligtvis använder vi 100 fack, 5 förstoring och 0,1 bana utjämningsfaktor för korskorrelation och 10 max distans, 0,1 min markörs siktförhållande och 0,01 banautjämningsfaktor för fiducialkorrigering. Korskorrelation och fiducialkorrigering kommer att ge en korrigeringsfil som kan tillämpas på andra FNDs för att testa driftskorrektionsprecisionen.
- För strängare, mer exakt driftkorrigering, använd den genomsnittliga fiducialkorrektion (AFC) -algoritmen som beskrivits tidigare 10 . Denna process kräver inte optimering av parametrar och ger högre lokaliseringsprecision än vad som förutses av SMLM-lokaliseringsalgoritmer. En genomsnittlig driftskorrigering kräver emellertid minst 4 FND: er och för att FND: erna ska lokaliseras i varje ram i bildstapeln. AFC-driftskorrigering fungerar bättre med införandet av fler FND, eftersom ett stort antal lokaliserade FND-enheter kommer att minska den snedvridande effekten av en outlier-topp i en given ram.
- Lokalisera alla punktspridningsfunktioner i bildstapeln med ThunderSTORM som beskrivits tidigare 10 . Vi använder vanligtvis pixelstorlek på 100 nm, fotoelektroner per A / D-räknat på 4,28, basnivå A / D-tal på 100, EM-förstärkning på 100, PSF: Integrerad Gauss-lokalisering, 5 pixlar monteringsradie, Maximal sannolikhetspassningsmetod och 1,3 Pixel initial sigma.
- Applicera driftskorrigeringsfaktorn som förvärvats från FND till lokaliseringar från hela bildstapeln. Visuellt inspektera den slutliga bilden för att säkerställa korrekt driftskorrigering ( Figur 2 ). Den resulterande driftskorrigeringsfaktorn ska provas oberoende på FND som inte ingår i AFC-proceduren för att mäta nivån på driftskorrigeringsnoggrannheten. Precisionen för driftkorrigerade oberoende FND bör ligga nära det genomsnittliga precision / osäkerhetsvärdet beräknat från lokaliseringsalgoritmen som användes i steg 2.1.6.
- Upprepa steg 2.1.1-2.1.7 för madSTORM-bildstaplarna av sekventiellt märkta antikroppar. Tänk på att lokalisering av samma uppsättning FND i varje madSTORM-bildstapel är kritisk för följande anpassningsförfarande.
- Anpassning av madSTORM-bilder
- Beräkna centroidpositionen för de driftskorrigerade FND: erna i varje madSTORM-bild. För att göra detta, hitta den genomsnittliga x- och y-axeln poSitions för varje lokaliserad FND, och genomsnittsmedelvärdet för x och y för alla FND i varje madSTORM-bild. Den detaljerade algoritmen för detta steg har tidigare beskrivits 10 . Justera sekventiella madSTORM-bilder med hjälp av centroidpositionerna för FND-fiducialmarkörer. För att utföra justeringen beräknar du förskjutningen mellan två lokaliserade madSTORM-bilder genom att subtrahera centroidpositionen för FNDs i den andra madSTORM-bilden från den första. Därefter subtrahera offsetbeloppet från alla lokaliseringar i den andra madSTORM-bilden.
- Vi rekommenderar att du använder den första galstormbilden som en referensbild och upprepar det här inriktningssteget mellan första och tredje, första och fjärde osv. Testa justeringsprecisionen genom att mäta förskjutningen mellan FND som inte ingår i inriktningsprocessen. Stora offsets kan indikera att olika uppsättningar FNDs användes vid beräkning av centroidpositionerna i sekventiella madSTORM-bilder.
- Om så är fallet, steg 2.2.1-2.2.2 shouLd upprepas med samma uppsättning FNDs för att utföra inriktning.
OBS! Anpassade koder för både AFC-driftskorrigering och anpassningsförfaranden finns.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den sekventiella eluerings- och färgningsmetoden användes för framställning av den multiplexerade madSTORM-bilden av mikrokluster och andra strukturer i en aktiverad Jurkat T-cell ( Figur 1 , kontrollfigurinställningar). Varje pseudo-färgad bild representerar en runda av madSTORM-bildbehandling som erhållits i steg 1.1.1 till 1.3.13. Som beskrivits tidigare 10 bör synfältet övervakas för restsignalen från tidigare, icke-eluerad antikropp för att undvika krysskala mellan multiplexerade mål. Eftersom elueringseffektiviteten kan variera mellan antikroppar, bör ordningen av sekventiell multiplexering arrangeras från den bästa till den värsta eluerade antikroppen för att minimera sterisk blockering av epitoper. Den sista madSTORM-bilden i Figur 1 har korrigerats för drift och inriktning med hjälp av AFC och FND fiducial markörer som beskrivs i avsnitt 2.
Figur 2A , 2B ) och en aktiverad Jurkat T-cell ( Figur 2C , 2D ). AFC-driftskorrigeringen utfördes såsom beskrivs i steg 2.1.1-2.1.8 med användning av algoritmerna som tillhandahålls. För det första rekommenderas visuell inspektion av bilden efter driftskorrigering ( Fig. 2C ) för att säkerställa korrekt tillämpning av driftkorrigeringsalgoritmen. För det andra rekommenderas mätning av standardavvikelsen för lokaliseringar i både X- och Y-axeln för att bekräfta precisionen som uppnåtts av AFC. Som rapporterats tidigare 10 ger AFC vanligtvis bättre precision än vad som förväntas av olika lokaliseringsalgoritmer.
Figur 1: ( A B ) Utvidgad bild av boxad region i A. Skala bar = 500 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: SMLM-bild av en enda FND lokaliserad i 30 000 bildramar ( A ) före och ( B ) efter driftskorrigering med medelvärde för fiducialkorrigering. Skalstänger = 20 nm (A och B). SMLM-bild av en aktiverad Jurkat T-cellfärgad wiDe anti-fosforylerade SLP76 (Y128) antikroppen och FND fiducialmarkörer ( C ) före och ( D ) efter driftskorrigering med medelvärde fiducialkorrigering. Skala bar = 2 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sekventiella multiplexerings-, driftkorrigerings- och anpassningsförfarandena i madSTORM möjliggör exakt, högmultiplexerad visualisering av heterogena strukturer i celler. 10 Dessutom undviker madSTORM gränserna för multi-color STORM, såsom kromatisk aberration och suboptimal photowitching / emissionsegenskaper för icke-farfärgade färgämnen 9 , 12 . Eftersom elueringssteget signifikant minskar sterisk interferens från sekventiellt bundna antikroppar kan madSTORM användas för att utföra upprepad avbildning av cellprover bortom 6-10 rundorna av multiplexerad bildbehandling uppnådd genom tidigare tekniker 9 , 15 , 21 . Vidare är sekventiella eluerings- och färgningssteg inte begränsade till SMLM och kan användas för andra avbildningstekniker, såsom konfokalmikroskopi, SIM och tvåfotonmikroskopi. Men med tanke på att galnaTORM är en sekventiell immunostaining-teknik, denna teknik är begränsad av tillgängligheten av antikroppar för varje riktade molekyl. Varje antikropp ska noggrant testas för att säkerställa specificitet, märkningseffektivitet och elueringsförmåga.
Förvärvsinställningarna för madSTORM valdes för att maximera detektering av individuella fotomöjlighetshändelser, vilket gör att vi kan uppnå 2,5 nm genomsnittlig lokaliserings precision. Hög precision kommer emellertid på bekostnad av tiden, vilket kräver ~ 3 h för varje runda av madSTORM-avbildning som diskuterats tidigare 10 . För snabbare bildförvärv vid lägre lokaliseringsprecision (5-10 nm) rekommenderas en kortare exponeringstid och högre EM-förstärkning ( t.ex. 20 ms exponering, 300X EM-förstärkning, 17 MHz vid 16 bitar, omvandlingsförstärkning 3). Vidare kan multi-color imaging ( t.ex. Atto-488, Alexa-568 och Alexa-647 nm) utföras för varje runda av madSTORM-bildbehandling för att öka mångfalden, om än wiEn minskning av justeringsprecision på grund av kromatisk avvikelse.
Vi har framgångsrikt utfört upp till 25 rundor av madSTORM imaging med hjälp av detta protokoll. Eftersom hela proceduren utförs med täckkammaren monterad på mikroskopsteget, är det viktigt att fästa täckkammaren i samma position. För att göra detta använd autofokusläget och montera kammaren på mikroskopsteget med metallklämmor. Om betydande scendrift har inträffat, använd kända positioner av FND-fiducialmarkörer för att centrera cellprovet igen.
Samtidig visualisering av anpassade madSTORM-bilder kan vara utmanande. För att samtidigt visa 7 eller färre madSTORM-bilder, använd Color / Merge Channels i ImageJ för att skapa en pseudo-färgad kompositbild. För 8 eller fler bilder är det lämpligt att kategorisera de madSTORM-bilderna i olika grupper, slå samman varje grupp i en sammansatt bild och tillämpa en enda LUT-färg på varje kompositbild.
10 . Slutligen kan utsläppsintensiteten minskas med upp till ~ 50% in situ vid användning av ett statiskt magnetfält 23 för NV-lediga FND-enheter. Minskningen i intensiteten är ungefär linjär upp till ~ 500 Gauss vid vilken punkt effektenT mättade. I praktiken kan diamantens intensitet i synfältet minskas till önskad grad genom att föra en permanent magnet närmare mikroskopglaset från toppen.
Slutligen optimerade vi elueringsbufferten för avlägsnande av antikroppar som riktade mot molekylkomponenterna i T-cellens mikrokluster. MadSTORM är inte begränsad till TCR-mikrokluster, emedan mikrotubuli, mitokondrier, F-aktin, Vimentin och andra molekylära strukturer har avbildats med användning av denna teknik 10 . För antikroppar som riktar sig mot andra cellulära fack kan ytterligare steg erfordras för att störa epitopbindning, såsom högre temperatur, lägre pH och längre inkubering av elueringsbuffert. Omvänt kan elueringsbufferten användas utan Tween-20 för att rikta känsliga membranstrukturer, förhindrande av störningar av icke-joniska interaktioner. Vi förutser i framtida experiment att elueringsbuffertkompositionen kommer att skräddarsys för individuella antikroppar tO optimera elueringseffektivitet och provbevarande Vidare kan, utöver applikationen i aktiverade T-celler, madSTORM vara genomförbart med andra system innefattande in vitro molekylära komplex, olika celltyper och vävnadssektioner. Olika parametrar av madSTORM-protokollet, såsom fixering, permeabilisering, antikroppsfärgning och elueringsbuffertkomposition kommer att behöva justeras för varje riktade system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Xufeng Wu för åtkomst till STORM-mikroskopet. Denna forskning stöddes av Intramural Research Programmet från National Cancer Institute (NCI) Center for Cancer Research och National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
