Summary
نحن نبرهن على طريقة لصورة الجزيئات متعددة داخل نانو الهياكل غير متجانسة في دقة جزيء واحد باستخدام ملزم متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلورزنتلي المسمى.
Abstract
وقد عرقل التصوير الهياكل الخلوية غير متجانسة باستخدام جزيء واحد المترجمة المجهري من قبل عدم كفاية الدقة التعريب والقدرة على مضاعفة. باستخدام الفلورسنت نانو الماس علامات فيدوسيال، ونحن تصف تصحيح الانجراف وإجراءات المحاذاة المطلوبة للحصول على دقة عالية في جزيء واحد المترجمة المجهري. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف استراتيجية تعدد الإرسال الجديدة، مادستورم، التي تستهدف جزيئات متعددة في نفس الخلية باستخدام ملتزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة الفلورسنت. ويظهر مادستورم على خلية T تنشيط لتصور مواقع مكونات مختلفة داخل هيكل غشاء، متعدد البروتينات يسمى مستقبلات الخلايا الدقيقة T. وبالإضافة إلى ذلك، ويناقش تطبيق مادستورم كأداة عامة لتصور الهياكل متعددة البروتين.
Introduction
وقد وضعت مجموعة متنوعة من تقنيات فائقة الدقة المجهر للتغلب على حد حيود المجهر الضوئي (~ 200 نانومتر). من بين هذه هي فئة من التقنيات تسمى جزيء واحد المجهر توطين (سملم) الذي يتضمن الصورة تنشيط التنشيط المجهري (بالم) والموجات الدقيقة المجهر الضوئي العشوائي (ستورم). تقنيات سملم حصة في استخدام فلوروفوريس التي يمكن أن تنتقل بين (على الفلورسنت) وخارج (الظلام / صورة التبديل) الدول، مما يسمح توطين متتابعة من مضان من جزيئات واحدة 1 ، 2 ، 3 .
وبسبب توافقه مع الأصباغ والمجاهر المتاحة تجاريا، أصبح ستورم المباشر (دستورم) تقنية سملم المعتمدة على نطاق واسع 4 . دستورم يمكن أن يحقق بشكل روتيني ~ 10 نانومتر توطين الدقة، وتعرف بأنها عدم اليقين في حساب مركز من الانعكاسأيون محدود نقطة انتشار وظيفة (بسف). ومع ذلك، على الرغم من الدقة العالية المقدرة باستخدام خوارزميات توطين 5 ، 6 ، 7 ، وقد عرقل تحديد دقيق للموقع الفعلي من جزيئات واحدة من قبل عدد من القضايا. أولا، الحركة الميكانيكية للمرحلة المجهر أثناء الحصول على الصور يضيف عدم اليقين كبيرة لدقة التعريب. كما يتم الحصول على الصور سملم أكثر من الآلاف من الأطر الزمنية الفاصل الزمني، والحركات نانو على نطاق والمرحلة المجهر يمكن أن يضر بشكل كبير دقة الصورة النهائية فائقة الدقة 8 . للتعويض عن حركة المرحلة أثناء الحصول على الصور، ويقدر عادة الانجراف المرحلة من الانحدار القائم على تركيب التوطين بيند من الصورة نفسها (عبر الارتباط) أو التعريبات متتابعة من علامات فيدوسيال (تصحيح فيدوسيال) 1 ، 9 . Howevإيه، تتطلب هذه الأساليب التحسين من المعلمات متعددة لكل كومة الصورة، ولا يمكن أن تمثل لحركات المرحلة في جداول زمنية قصيرة مثل الاهتزاز الميكانيكي. وقد استخدمت جسيمات النانو الذهب وحبات الفلورسنت متعددة الألوان كعلامات فيدوسيال في سملم، ولكنها ليست مستقرة الصورة، وتؤدي إلى دقة أقل بكثير بعد تصحيح الانجراف من النيتروجين الشواغر مركز الفلورسنت نانو الماس (فندس) المستخدمة في مادستورم 10 .
بالإضافة إلى الحد من الحيود، والمجهر الضوئي أكثر تقييدا من قبل الحدود الطيفية. التصور في وقت واحد من أهداف متعددة يتطلب تحقيقات الفلورسنت مع التشكيلات الطيفية غير متداخلة، وتقييد عموما مضان الضوء القائم على المجهر إلى 6 ألوان و سملم إلى 2-3 ألوان 4 ، 11 ، 12 . وعلاوة على ذلك، انحراف لوني غير الخطية يسبب عدم اتساق الصور متعددة الألوان، ثهيش تتطلب إجراءات محاذاة واسعة باستخدام علامات متعددة الألوان فيدوسيال 8 ، 13 . للتغلب على هذه الحدود، وقد صورت الدراسات السابقة أهداف متعددة باستخدام فوتوبلاشينغ المتكررة أو التبريد الكيميائي من فلوروفوريس ملزمة بالتتابع 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 ، 19 . في حين أن هذه الأساليب يمكن التغلب على الحدود الطيفية للمجهر، ومن المعروف تبييض مضان لتكون عملية سامة 20 ، والتبييض لفترات طويلة أو التبريد قد يسبب آثار جانبية غير مرغوب فيها مثل فقدان التشابك. وعلاوة على ذلك، فإن تراكم تحقيقات الفلورسنت يمكن أن يؤدي إلى حجب ستيريك من مواقع الربط في العينة، ومنع تعدد الإرسال على نطاق واسع واستهداف قوي من الحواتم. ولتجنب مثل هذا التداخل الاستباقي، حدث مؤخراتيودي تحقيق تعدد الإرسال باستخدام تبادل مؤشر ستوكاستيك من شظايا البروتين نشر بحرية 21 . في حين أن هذا الأسلوب يسمح وضع العلامات كثيفة من الهياكل الخلوية، فإنه يتطلب إعداد البيوكيميائية واسعة لعزل شظايا الببتيد، لا يمكن تحديد مواقع جزيء واحد، ولا يسهل بسهولة متعددة النطاق على نطاق واسع باستخدام تحقيقات المتاحة تجاريا. نقدم بروتوكول فيديو مفصل يصف ملزمة متتابعة وشطف من الأجسام المضادة فلوريسنتلي لمضاعفة، والأضداد محدودة الحجم دستورم (مادستورم) التصوير، واستخدام الفلورسنت نانو الماس لتحقيق تصحيح الانجراف الدقيق والمحاذاة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبیھ: یرجی الرجوع إلی جمیع صحائف بیانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة ومسرطنة. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ البروتوكول بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان، علبة القفازات) ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر، والسراويل طول كامل، وأحذية مغلقة اصبع القدم).
1. التصوير المضاعف من خلايا T المنشط
- مباشرة اقتران الأجسام المضادة مع اليكسا-647 (A647) صبغ باستخدام اليكسا 647 الأجسام المضادة وسم كيت. اتبع بروتوكول وضع العلامات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: ينصح غسيل الكلى من محلول الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني 1X قبل هذه الخطوة لزيادة كفاءة وسم الأجسام المضادة. - تدور الأجسام المضادة المسمى لمدة 5 دقائق في 20،800 رسف وجمع طاف لإزالة الأجسام المضادة المجمعة.
- إعداد الفلورسنت نانو الماس كوفرسليبس المغلفة
- إعداد التخفيف من 100 نانومتر فندس في برنامج تلفزيوني 1X. اختبار التخفيفات المختلفة لضمان ما يكفي من فندس مرئية كل حقل من وجهة نظر في الخطوة 1.2.7 (نحن نستخدم التخفيف 1: 200 من فندز المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
- دوامة المخفف فندس لمدة 1 دقيقة.
- يصوتن طاف فند لمدة 30 ثانية في إعداد عالية الطاقة.
- احتضان طاف فند سونيكاتد في بل المغلفة 8 جيدا غرفة ساترة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 5X مع برنامج تلفزيوني 1X وتصور الغرفة المغلفة فند باستخدام 647 نانومتر الإثارة الليزر على المجهر تيرف. من الناحية المثالية، 4-10 فندز الفردية يجب أن تكون مرئية في مجال الرؤية نظرا للتخفيف المناسب من فندس في الخطوة 1.2.2 (نحن نستخدم هدف 100X مع 256 × 256 بكسل بكسل الإعداد لإنتاج 61 × 61 ميكرون مجال الرؤية) مع فيواحدة على الأقل فند موجودة في كل رباعي من مجال التصوير. إذا كان فند يبدو أن متجمعة ( أي فندس مع إشارة أعلى بكثير من المحيطة فند ودالة انتشار نقطة أكبر من 200 نانومتر)، أجهزة الطرد المركزي فندس في 6،800 رسف لمدة 1 دقيقة، وكرر إجراء الطلاء باستخدام طاف فند.
- إضافة 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD3 (10 ميكروغرام / مل) في كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الحل وإضافة برنامج تلفزيوني 1X لمدة 30 ثانية. كرر هذه الخطوة غسل 5 مرات (غسل 5X).
- تدور 1 مل من الخلايا جوركات T في 800 رسف لمدة 6 دقائق و ريسوسبيند في 300 ميكرولتر حل هبس 1X. يجب أن تكون الخلايا جوركات T مثالي في تركيز 0.5-1.0 × 10 6 خلايا / مل قبل الغزل. يتكون حل هبس 1X من هيبيس العازلة المالحة مع 1٪ ألبومين المصل البقري كما هو موضح سابقا 22 .
- إضافة 150 ميكرولترمن 1X حل هبس في كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 50 ميكرولتر معلق الخلايا جوركات T لكل بئر واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
- بيرمابيليز الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون-X الحل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 250 ميكرولتر 1٪ حل الجيلاتين الأسماك في برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المسمى في 0.1-0.5 ميكروغرام / مل إلى خلايا ثابتة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل 5X مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 1 مل من العازلة ستورم وتغطية الغرفة مع ساترة الزجاج للحد من التعرض للهواء. وقد تم وصف المخزن المؤقت ستورم سابقا 10 . نوصي بماالملك الجديد ستورم العازلة لكل جولة من التصوير والغزل العازلة ستورم في 20،800 رسف لمدة 2 دقيقة لإزالة الرواسب.
- باستخدام منخفضة 647 نانومتر قوة الليزر في وضع تيرف، حدد خلية ملون مع ما لا يقل عن 3 فندس في مجال الرؤية. للمساعدة في تحديد موقع فندس، يمكن أن تستخدم الإثارة المصاحبة مع 568 نانومتر ليزر لزيادة سطوع إشارة فند.
ملاحظة: يحسن أداء التصحيح فيدوسيال المتوسط الموصوف في القسم 2.1 مع إدراج المزيد من فند. - زيادة 647 نانومتر طاقة الليزر والحصول على الصور. نحن عادة الحصول على 10،000 إطارات في التعرض 200 مللي ثانية، 125 ميغاواط 647 نانومتر ليزر، 100X تيرف عدسة موضوعية (1.49 نا)، 100X إم كسب (5 ميغاهرتز في 16 بت، كسب التحويل 1). وقد وصفت تفاصيل الإعداد التصوير لدينا سابقا 10 .
- غسل 5X مع تبس 1X.
- إضافة 1 مل س(3.5 M مغكل 2 ، 20 ملي أنابيب، 0.1٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.5) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
- كرر شطف 3 مرات. (شروط شطف الدقيق وعدد الشطف شطف اللازمة لإزالة إشارة يجب التحقق من كل الأجسام المضادة المستخدمة).
- غسل 3X مع تبس 1X وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
- فوتوبلاش باستخدام الليزر 647 نانومتر في الطاقة العالية (125 ميغاواط) مع ليزر 405 نانومتر في 2-5 ميغاواط إلى الصورة-تنشيط A647 الأصباغ في حالة مظلمة. انتظر حتى كل إشارة المتبقية من الأجسام المضادة غير إلوتد هو فوتوبلاشد. وعادة ما يستغرق ذلك من 2 إلى 5 ثانية من التعرض للليزر. الحصول على عينة الصور (~ 100 إطارات) باستخدام إعدادات ستورم في 1.3.5 بعد شطف و فوتوبلاشينغ يوصى لتأكيد إزالة إشارة.
نحن عادة إزالة 99.8٪ من إشارة باستخدام هذه الطريقة. نوصي اختبار كفاءة شطف كل الأجسام المضادة قبل الاستخدام في مادستورم كما هو موضح سابقا 10 . - إضافة 250 ميكرولتر 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة. هذا بيأرالأحداث عكس تشابك الجزيئات الثابتة في الخلية.
- غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
- كرر الخطوات من 1.3.1-1.3.12 لوضع علامات متتابعة لأهداف متعددة. ويبين الشكل 1 صورة مركبة من جزيئات متعددة في خلية جوركات T تنشيط المكتسبة باستخدام مادستورم.
2. الانجراف تصحيح ومحاذاة مداخن صورة متعددة
- تصحيح الانجراف من مداخن صورة مداخن
- فتح الصور باستخدام إيماجيج. نوصي بتحويل ملفات الصور إلى تنسيق تيف قبل فتح في إيماجيج. استخدام عائد الاستثمار المستطيل لتحديد فند واحد. لعب الفاصل الزمني للتأكد من أن فند مرئية في كل إطار من كومة الصورة. استخدام تحليل تشغيل في البرنامج المساعد ثوندرستورم لتوطين فند. وبالنسبة إلى أسلوب التصحيح الإيقاعي المتوسط الموصوف في الفقرة 2.1.5، من المهم أن تكون فند واحدة مترجمة في كل إطار صورة ( أي عدد القمم المحددة ينبغي أن يكون eكم لعدد الإطارات).
- إذا لم يتم التعرف على فند في كل إطار، حدد فند آخر. إذا كانت قمم متعددة تقع في إطار واحد، إزالة الذروة التي تنحرف أكثر من القمم السابقة.
- كرر 2.1.2 لكل فند في كومة الصورة. نضع في اعتبارنا أن بعض فندس لا ينبغي أن تدرج في عملية التصحيح الانجراف بحيث يمكن أن تكون بمثابة مقياس مستقل لدقة تصحيح الانجراف كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
- ولتصحيح الانحراف الأسرع والأقل دقة، استخدم إما خوارزميات التصحيح المتقاطع أو التصحيح الإملائي المتضمنة في ثوندرستورم لتصحيح صور فند. عادة، ونحن نستخدم 100 صناديق، 5 التكبير، و 0.1 عامل تجانس مسار لصلات الصليب و 10 مسافة كحد أقصى، 0.1 دقيقة نسبة علامة علامة، و 0.01 مسار عامل تمهيد للتصحيح فيدوسيال. وسوف يؤدي الترابط المتقاطع والتصحيح اللفظي إلى ملف تصحيحي يمكن تطبيقه على فند أخرى لاختبار دقة تصحيح الانجراف.
- ولتصحيح الانجراف الأكثر صرامة وأكثر دقة، استخدم خوارزمية التصحيح الإحيائي المتوسط (أفك) كما هو موضح سابقا 10 . ولا تتطلب هذه العملية تحسين المعلمات وتؤدي إلى دقة توطين أعلى مما توقعته خوارزميات توطين سملم. ومع ذلك، يتطلب تصحيح الانحراف المتوسط متوسطا لا يقل عن 4 ضواحي فند ولتوضع فندس في كل رتل من كومة الصورة. ويتحقق تصحيح الانجراف أفك بشكل أفضل مع إدراج المزيد من شبكات الدفاع الجوي الوطنية لأن عددا كبيرا من شبكات الدفاع الجوي المحلية المترجمة سوف يقلل من التأثير المشوه للذروة الخارجة في إطار معين.
- توطين جميع وظائف انتشار نقطة داخل كومة الصورة باستخدام ثوندرستورم كما هو موضح سابقا 10 . نحن عادة استخدام حجم بكسل 100 نانومتر، الضوئية لكل A / D العد من 4.28، مستوى قاعدة A / D عدد 100، إم كسب 100، بسف: التوطين غاوس المتكاملة، 5 دائرة نصف قطرها تركيب المناسب، وأقصى طريقة المناسب احتمال، و 1.3 بكسل سيغما الأولي.
- تطبيق عامل تصحيح الانجراف المكتسبة من فندز إلى توطين من كومة الصورة بأكملها. تفقد بصريا الصورة النهائية لضمان تصحيح الانجراف السليم ( الشكل 2 ). وينبغي اختبار عامل تصحيح الانجراف الناتج على نحو مستقل على الشبكات دون المعطيات غير المدرجة في الإجراء أفك لقياس مستوى دقة تصحيح الانجراف. وينبغي أن تكون دقة المعطيات المستقيمة المصححة بالإنجراف قريبة من متوسط قيمة الدقة / عدم التيقن المحسوبة من خوارزمية التوطين المستخدمة في الخطوة 2-1-6.
- كرر الخطوات 2.1.1-2.1.7 لمداخن صورة مادستورم من الأجسام المضادة المسمى بالتسلسل. نضع في اعتبارنا أن توطين نفس مجموعة من فندز في كل كومة صورة مادستورم أمر بالغ الأهمية لإجراء المحاذاة التالية.
- محاذاة الصور مادستورم
- حساب موقف سينترويد من فند تصحيحها الانجراف في كل صورة مادستورم. للقيام بذلك، والعثور على متوسط x و y محور بولكل من فند المترجمة، ومتوسط متوسط x و y مواقف جميع فند في كل صورة مادستورم. تم وصف الخوارزمية التفصيلية لهذه الخطوة سابقا 10 . محاذاة الصور مادستورم متتابعة باستخدام مواقف سينترويد من علامات فند فند. لإجراء المحاذاة، وحساب الإزاحة بين اثنين من الصور مادستورم المترجمة عن طريق طرح موقف سينترويد من فندس في الصورة مادستورم الثاني من الأول. ثم طرح مبلغ الإزاحة من جميع التعريبات في صورة مادستورم الثانية.
- نوصي باستخدام صورة مادستورم الأولى كصورة مرجعية وتكرار هذه الخطوة محاذاة بين الأول والثالث، الأول والرابع، الخ اختبار دقة المحاذاة عن طريق قياس الإزاحة بين فندس غير المدرجة في عملية المحاذاة. قد تشير إزاحة كبيرة إلى أن مجموعات مختلفة من فند تم استخدامها عند حساب مواقف سينترويد من الصور مادستورم متتابعة.
- إذا كان الأمر كذلك، الخطوات 2.2.1-2.2.2 شويتم تكرار لد باستخدام نفس مجموعة من فندز لإجراء المحاذاة.
ملاحظة: يتم توفير رموز مخصصة لكل من التصحيح الانجراف أفك وإجراءات المحاذاة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام طريقة الشطف والتلطيخ المتسلسل لإنتاج صورة مادستورم المضاعفة للميكروسترات وغيرها من الهياكل في خلية T جوركات المنشطة ( الشكل 1 ، والتحقق من التحالفات الرقم). كل صورة شبه الزائفة تمثل جولة واحدة من التصوير مادستورم المكتسبة في الخطوات 1.1.1 إلى 1.3.13. كما هو موضح سابقا 10 ، ينبغي رصد مجال الرؤية للإشارة المتبقية من السابق، غير إلوتد الأجسام المضادة لتجنب الحديث المتبادل بين الأهداف المضاعفة. وعلاوة على ذلك، كما كفاءة شطف يمكن أن تختلف بين الأجسام المضادة، وينبغي ترتيب ترتيب مضاعفة متتابعة من أفضل إلى أسوأ الأجسام المضادة التزوير للحد من حجب ستيريك من الحواتم. تم تصحيح الصورة مادستورم النهائية في الشكل 1 للانجراف والمحاذاة باستخدام علامات فك و فند فيدوسيال كما هو موضح في القسم 2.
هين-بادج = "1"> تم استخدام فندز لتنفيذ أفك على التعريب من واحد، مستقل فند ( الشكل 2A ، 2B ) وخلايا جوركات T تنشيط ( الشكل 2C ، 2D ). تم إجراء تصحيح الانجراف أفك كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.8 باستخدام الخوارزميات المقدمة. أولا، ويوصى التفتيش البصري للصورة بعد تصحيح الانجراف ( الشكل 2C ) لضمان التطبيق السليم للخوارزمية تصحيح الانجراف. ثانيا، يوصى بقياس الانحراف المعياري للترجمات في كل من المحورين X و Y لتأكيد الدقة التي حققتها أفك. كما ذكرت سابقا 10 ، أفك ينتج عادة دقة أفضل مما كان متوقعا من قبل خوارزميات توطين مختلفة.
الشكل 1: ( أ B ) صورة موسعة من المنطقة محاصر في A. شريط مقياس = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة سملم ل فند واحدة مترجمة في 30000 إطار الصورة ( A ) قبل و ( B ) بعد تصحيح الانجراف مع تصحيح فيدوسيال متوسط. مقياس الحانات = 20 نانومتر (A و B). صورة سملم من جوركات T خلية ملون تنشيط واي(Y128) و فند فيدوسيال علامات ( C ) قبل و ( D ) بعد تصحيح الانجراف مع تصحيح فيدوسيال متوسط. شريط مقياس = 2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتتيح عمليات تعدد الإرسال المتتابعة، وتصحيح الانحراف، وإجراءات المحاذاة في مادستورم تصورا دقيقا ومتعدد الإرسال للغاية للهياكل غير المتجانسة في الخلايا. 10 بالإضافة إلى ذلك، مادستورم يتجنب القيود من متعدد الألوان ستورم مثل انحراف لوني والخصائص دون المستوى الأمثل فوتوسويتشينغ / الانبعاثات من الأصباغ غير بعيدة الأحمر 9 ، 12 . كما خطوة شطف يقلل بشكل كبير من التداخل ستيريك من الأجسام المضادة ملزمة بالتتابع، مادستورم يمكن استخدامها لإجراء التصوير المتكرر لعينات الخلية وراء جولات 6-10 من التصوير المتعدد الإرسال التي تحققت من قبل التقنيات السابقة 9 ، 15 ، 21 . وعلاوة على ذلك، لا تقتصر شطف متتابعة وخطوات تلطيخ ل سملم ويمكن استخدامها لتقنيات التصوير الأخرى مثل المجهري متحد البؤر، سيم واثنين من الفوتون المجهري. ومع ذلك، بالنظر إلى أن مادستورم هو تقنية إمونوستينينغ متتابعة، وتقتصر هذه التقنية من توافر الأجسام المضادة لكل جزيء المستهدفة. يجب اختبار كل جسم مضاد بعناية لضمان الخصوصية، وكفاءة وضع العلامات، والقدرة على شطف.
تم اختيار إعدادات الاستحواذ ل مادستورم لتحقيق أقصى قدر من الكشف عن الأحداث فوتوسويتشينغ الفردية، مما يسمح لنا لتحقيق 2.5 نانومتر دقة التوطين المتوسط. ومع ذلك، فإن دقة عالية تأتي على حساب الوقت، والتي تتطلب ~ 3 ساعة لكل جولة من التصوير مادستورم كما نوقش سابقا 10 . للحصول على سرعة الحصول على الصور في دقة أقل توطين (5-10 نانومتر)، يوصى وقت التعرض أقصر وكسب إم أعلى ( مثل التعرض 20 مللي ثانية، وكسب 300X إم، 17 ميغاهرتز في 16 بت، وكسب التحويل 3). وعلاوة على ذلك، والتصوير متعدد الألوان (على سبيل المثال أتو-488، اليكسا-568، واليكسا-647 نانومتر) يمكن أن يؤديها لكل جولة من التصوير مادستورم لزيادة حجم تعدد الإرسال، وإن كان واي ث انخفاض في الدقة المحاذاة بسبب انحراف لوني.
لقد نجحت في تنفيذ ما يصل إلى 25 طلقة من التصوير مادستورم باستخدام هذا البروتوكول. كما يتم تنفيذ الإجراء بأكمله مع غرفة ساترة شنت على مرحلة المجهر، فمن المهم لتأمين غرفة ساترة في نفس الموقف. للقيام بذلك استخدام وضع التركيز التلقائي وجبل الغرفة على مرحلة المجهر باستخدام المشابك المعدنية. إذا حدث الانجراف مرحلة كبيرة، واستخدام المواقف المعروفة من علامات فند فند لإعادة مركز عينة الخلية.
التصور في وقت واحد من الصور مادستورم الانحياز يمكن أن يكون تحديا. لعرض في وقت واحد 7 أو أقل من الصور مادستورم، استخدم اللون / دمج القنوات في إيماجيج لإنشاء صورة مركب شبه الزائفة. ل 8 أو أكثر من الصور، فمن المستحسن أن كاتاغوريز الصور مادستورم إلى مجموعات مختلفة، ودمج كل مجموعة في صورة مركبة، وتطبيق لون لوت واحد لكل صورة مركبة.
"jove_content"> استخدمنا 100 نانومتر النيتروجين الشاغر مركز نانو الماس بسبب سطوعهم والتمسك بل-كوفرسليبس المغلفة. فندس أصغر من 80 نانومتر لم تلتزم بشكل جيد ل كوفرسليبس المغلفة بل، و فندس أكبر من 100 نانومتر كانت أكثر إشراقا بشكل ملحوظ من اليكسا-647 صبغ عندما متحمس باستخدام الليزر 647 نانومتر، مما يحد من الاستفادة المثلى من إعدادات اكتساب الكاميرا لانبعاث اليكسا-647. نوصي بتجريب أحجام أو ألوان فند مختلفة إذا كان 100 نانومتر النيتروجين الشغور مركز فندس ليست الأمثل لإعداد التصوير الخاص بك. بدلا من ذلك، يمكن استخدام جزيئات نانو الذهب أو الخرز الفلورسنت كعلامات فدوسيال، ولكنها ليست الأمثل لإجراء تصحيح النقطة المتوسطة المستخدمة أدناه في القسم 2.1 10 . وأخيرا، ل نف - الشواغر فندس، يمكن خفض كثافة الانبعاثات بنسبة تصل إلى ~ 50٪ في الموقع من خلال تطبيق حقل مغناطيسي ثابت 23 . الانخفاض في شدة الخطية تقريبا تصل إلى ~ 500 غاوس عند هذه النقطة إفيكt تشبع. في الممارسة العملية، يمكن تخفيض كثافة الماس في مجال الرؤية إلى الدرجة المطلوبة من خلال جلب المغناطيس الدائم أقرب إلى شريحة المجهر من أعلى.
وأخيرا، قمنا بتحسين المخزن المؤقت شطف لإزالة الأجسام المضادة التي تستهدف المكونات الجزيئية للالخلايا الدقيقة T الخلية. مادستورم لا يقتصر على المتر الصغيرة تر، ومع ذلك، كما تم تصوير الأنابيب الدقيقة، الميتوكوندريا، F- أكتين، فيمينتين والهياكل الجزيئية الأخرى باستخدام هذه التقنية 10 . للأجسام المضادة التي تستهدف المقصورات الخلوية الأخرى، قد تكون هناك حاجة خطوات إضافية لتعطيل ربط حاتمة مثل درجة حرارة أعلى، وانخفاض درجة الحموضة واحتضان أطول من المخزن المؤقت شطف. على العكس من ذلك، يمكن استخدام المخزن المؤقت شطف دون توين 20 لاستهداف هياكل غشاء الحساسة، ومنع تعطيل التفاعلات غير الأيونية. ونحن نتوقع في التجارب المستقبلية أن تكوين العازلة شطف سيتم مصممة للأجسام المضادة الفردية رo تحسين كفاءة شطف والحفاظ على عينة. وعلاوة على ذلك، خارج التطبيق في الخلايا التائية تفعيلها، قد تكون مادستورم ممكنا مع النظم الأخرى بما في ذلك المجمعات الجزيئية في المختبر ، وأنواع الخلايا المختلفة، وأقسام الأنسجة. المعلمات المختلفة للبروتوكول مادستورم، مثل التثبيت، بيرمابيليزاتيون، تلطيخ الأجسام المضادة، وتكوين العازلة شطف سوف تحتاج إلى تعديل لكل نظام المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشف عنه.
Acknowledgments
نشكر شوفنغ وو للوصول إلى المجهر ستورم. وقد تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمركز الوطني للسرطان معهد (نسي) لأبحاث السرطان والمعهد الوطني لرئة القلب والدم (نهلبي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
