Summary
我々は、蛍光標識された抗体の逐次結合および溶出を用いて、単一分子精度で異種ナノ構造内の複数の分子をイメージングする方法を実証する。
Abstract
単一分子局在化顕微鏡法を用いた画像化異種細胞構造は、不適切な局在精度および多重化能力によって妨げられている。蛍光ナノダイヤモンド基準マーカーを使用して、単一分子局在化顕微鏡法で高精度を得るために必要なドリフト補正およびアライメント手順を説明する。さらに、蛍光抗体の逐次結合および溶出を用いて複数の分子が同じ細胞内で標的化される新しい多重化戦略madSTORMが記載されている。 madSTORMは、T細胞受容体マイクロクラスターと呼ばれる膜結合多タンパク質構造内の異なる成分の位置を視覚化するために、活性化されたT細胞上で実証される。さらに、madSTORMのマルチタンパク質構造の可視化のための一般的なツールとしての応用について議論する。
Introduction
光学顕微鏡の回折限界（約200nm）を克服するために、様々な超解像顕微鏡技術が開発されている。これらの中には、光活性化局在顕微鏡法（PALM）および確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）を含む単一分子局在化顕微鏡（SMLM）と呼ばれる技術のカテゴリーがある。 SMLM技術は、オン（蛍光）状態とオフ（ダーク/光スイッチ）状態との間で切り替えることができるフルオロフォアの使用を共有し、単一分子1,2,3からの蛍光の連続的な局在化を可能にする。
市販の染料や顕微鏡との互換性のため、直接STORM（dSTORM）は広く採用されたSMLM技術となっています4 。 dSTORMは、回折線の中心を計算する際の不確かさとして定義される、約10nmの定位精度を日常的に達成することができるイオン制限点広がり関数（PSF）。しかしながら、局在化アルゴリズム5,6,7を用いて推定された高い精度にもかかわらず、単一分子の実際の位置の正確な決定は、多くの問題によって妨げられてきた。第1に、画像取得中の顕微鏡ステージの機械的移動は、位置特定精度に重大な不確実性を加える。 SMLM画像が何千ものタイムラプスフレームにわたって得られるので、顕微鏡ステージのナノスケールの動きは、最終的な超解像画像8の精度を著しく損なう可能性がある。画像取得中のステージの動きを補償するために、ステージドリフトは、画像自体からのビニングされたローカライゼーションの回帰ベースのフィッティング（相互相関）または基準マーカからの連続的なローカライゼーション（基準補正）1,9から一般的に推定される。ハウヴェこれらの方法は、各画像スタックに対して複数のパラメータの最適化を必要とし、機械的振動などの短い時間スケールでステージの動きを説明することができない。金ナノ粒子と多色蛍光ビーズは、SMLMの基準マーカーとして使用されてきましたが、光安定性ではなく、ドリフト補正後に使用された窒素空孔中心蛍光ナノダイヤモンド（FND） madSTORM 10で 。
回折限界に加えて、光学顕微鏡法はスペクトル限界によってさらに制限される。複数のターゲットを同時に視覚化するには、重複しないスペクトルプロファイルを有する蛍光プローブが必要であり、一般に、蛍光ベースの光学顕微鏡法を6色に、SMLMを2-3色にそれぞれ制限する（4,11,12）。さらに、非線形色収差は、多色画像の不整合を引き起こし、w多色の基準マーカー8,13を用いて広範囲のアライメント手順を必要とする。これらの限界を克服するために、以前の研究では、連続的に結合した蛍光体14,15,16,17,18,19の繰り返しの光退色または化学的消光を用いて複数の標的を画像化した。これらの方法は顕微鏡法のスペクトル限界を克服することができるが、蛍光漂白は有毒なプロセス20であることが知られており、漂白または消光の長期化は架橋の損失などの望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。さらに、蛍光プローブの蓄積は、試料中の結合部位の立体的なブロッキングをもたらし、エピトープの大規模な多重化および頑強な標的化を妨げる可能性がある。このような立体的な干渉を避けるために、自由に拡散するタンパク質断片の確率的交換を用いて多重化を達成した21 。この方法は細胞構造の高密度標識化を可能にするが、ペプチド断片を単離するための広範な生化学的調製を必要とし、単一分子位置を特定することができず、市販のプローブを用いた大規模多重化を容易に促進しない。我々は、多重化、抗体サイズ限定dSTORM（madSTORM）イメージング、および正確なドリフト補正およびアライメントを達成するための蛍光ナノダイヤモンドの使用のための蛍光抗体の順次結合および溶出を記載する詳細なビデオプロトコルを提示する。
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Protocol
注意：使用前に関連するすべての物質安全性データシート（MSDS）を参照してください。このプロトコルで使用される化学物質のいくつかは有毒で発癌性があります。エンジニアリングコントロール（ヒュームフード、グローブボックス）および個人用保護具（安全眼鏡、手袋、ラボコート、全長ズボン、クローズトゥーシューズ）の使用を含む、プロトコールを実行する際は、適切なすべての安全プラクティスを使用してください。
活性化T細胞の多重化画像化
- Alexa 647抗体ラベリングキットを使用してAlexa-647（A647）色素と抗体を直接コンジュゲートします。製造元が提供するラベリングプロトコルに従ってください。
注：このステップの前に抗体標識効率を高めるために、1x PBS中の抗体溶液の透析を推奨します。 - 20,800 rcfで5分間標識した抗体をスピンし、上清を集めて凝集した抗体を除去する。
- 蛍光ナノダイヤモンド被覆カバーガラスの作製
- 1倍PBSで100 nm FNDの希釈液を調製する。様々な希釈液を試験して、ステップ1.2.7で十分なFNDが各視野に見えるようにします（メーカーが提供するFNDの1：200希釈を使用しています）。
- 希釈したFNDを1分間ボルテックスする。
- ハイパワー設定で30秒間FND上清を超音波処理する。
- 超音波処理されたFND上清をPLLコートした8ウェルカバースリップチャンバー中で室温で30分間インキュベートする。
- 1x PBSで5回洗浄し、TIRF顕微鏡で647 nmレーザー励起を使用してFND被覆チャンバーを視覚化します。理想的には、ステップ1.2.2でFNDを適切に希釈した場合、4〜10個の個別FNDを視野内に表示する必要があります（61 x 61μmの視野を得るために256 x 256カメラピクセル設定の100倍対物レンズを使用しています）と撮像フィールドの各象限に存在する少なくとも1つのFND。 FNDがクラスター化していると思われる場合（ すなわち 、周囲のFNDよりも著しく高いシグナルおよび200nmより大きい点広がり関数を有するFND）、FNDを6,800rcfで1分間遠心し、FND上清を用いてコーティング手順を繰り返す。
- 各ウェルに250μlの抗CD3抗体（10μg/ mL）を添加し、37℃で1時間、または4℃で一晩インキュベートする。
- 溶液を除去し、1×PBSを30秒間添加する。この洗浄ステップを5回（5回洗浄）繰り返す。
- Jurkat T細胞1 mlを800 rcfで6分間スピンし、300μlの1x HBS溶液に再懸濁する。 Jurkat T細胞は、スピンする前に、理想的には0.5〜1.0×10 6細胞/ mlの濃度でなければならない。 1x HBS溶液は、前述したように1％ウシ血清アルブミンを含むHEPES緩衝液生理食塩水からなる22 。
- 150μLを加える各ウェルに1×HBS溶液を加え、37℃で15分間インキュベートする。
- 各ウェルに50μLの再懸濁したJurkat T細胞を加え、37℃で3分間インキュベートする。
- 4％パラホルムアルデヒド300μLを各ウェルに添加し、37℃で30分間インキュベートする。
- 1x PBSで3回洗浄する。
- 250μLの0.1％Triton-X溶液を室温で5分間添加して細胞を透過させる。
- 1x PBSで3回洗浄する。
- 室温で30分間各ウェルに1×PBS中250μL1％魚ゼラチン溶液を添加する。
- 1x PBSで3回洗浄する。
- 固定化された細胞に0.1〜0.5μg/ mLの標識された抗体200μLを室温で1時間添加する。
- 1×PBSで5回洗浄する。
- STORM緩衝液1 mlを加え、ガラスカバースリップでチャンバーを覆い、空気への曝露を制限する。 STORMバッファは、先に10で説明した。私たちはmaSTORMバッファーを各回のイメージングに使用し、STORMバッファーを20,800 rcfで2分間回転させて沈殿物を除去する。
- TIRFモードで低647 nmレーザー出力を使用して、視野内に少なくとも3つのFNDを有する染色細胞を見つける。 FNDを配置するのを助けるために、568nmレーザを伴う励起を使用して、FND信号の輝度を増加させることができる。
注：セクション2.1で説明した平均フィデューシャル補正の性能は、より多くのFNDを含めると改善されます。 - 647 nmのレーザー出力を増加させ、画像を取得します。我々は、200ms露光、125mW 647nmレーザ、100倍TIRF対物レンズ（1.49NA）、100X EMゲイン（16MHzで5MHz、変換利得1）で10,000フレームを取得する。私たちのイメージングセットアップの詳細は、以前に説明されています10 。
- 1x TBSで5回洗浄する。
- 1 mlを加えて（3.5M MgCl 2、20mM PIPES、0.1％Tween-20、pH6.5）で洗浄し、室温で1分間インキュベートする。
- 溶出を3回繰り返します。 （正確な溶出条件およびシグナルを除去するために必要な溶出リンスの数は、使用する各抗体についてチェックする必要があります）。
- 1×TBSで3回洗浄し、1×PBS 1mlを加える。
- 暗所でA647色素を光活性化するために、2〜5mWの405nmレーザで高出力（125mW）で647nmレーザを使用する光漂白剤。溶出されていない抗体からの残りのシグナルが全て光退色するまで待つ。典型的には、これは2〜5秒のレーザー露光を要する。溶出および光退色後に1.3.5のSTORM設定を使用してサンプル画像（約100フレーム）を取得することを推奨します。
通常、この方法を使用して信号の99.8％を除去します。以前に示したようにmadSTORMで使用する前に各抗体の溶出効率を試験することを推奨します10 。 - 250μLの4％パラホルムアルデヒドを15分間添加する。このpr事象は、細胞内の固定分子の架橋を逆転させる。
- 1x PBSで3回洗浄する。
- 複数のターゲットを順次ラベリングする場合は、手順1.3.1-1.3.12を繰り返します。 図1は、madSTORMを用いて獲得した活性化Jurkat T細胞における複数の分子の複合画像を示す。
2.マルチプレックス画像スタックのドリフト補正とアライメント
- madSTORM画像スタックのドリフト補正
- ImageJを使用して画像を開きます。 ImageJで開く前に、イメージファイルをTIFF形式に変換することをお勧めします。単一のFNDを選択するには、矩形ROIを使用します。画像スタックのすべてのフレームでFNDが表示されるように、時間の経過を再生します。 ThunderSTORMプラグインでRun Analysisを使用して、FNDをローカライズします。 2.1.5で説明した平均基準補正法では、単一のFNDが各画像フレームに局在することが重要です（ つまり 、特定されたピークの数はeフレーム数に対するqual）。
- すべてのフレームでFNDが識別されない場合は、別のFNDを選択します。 1つのフレームに複数のピークがある場合は、前のピークから最も離れたピークを削除します。
- イメージスタック内の各FNDに対して2.1.2を繰り返します。一部のFNDはドリフト補正プロセスに含めてはならないので、ステップ2.1.7で説明したドリフト補正精度の独立ゲージとして機能させることができます。
- より速く精度の低いドリフト補正を行うには、ThunderSTORMに含まれる相互相関または基準補正アルゴリズムを使用してFND画像を補正します。典型的には、相互相関には100ビン、5倍、0.1軌道平滑化係数を使用し、基準距離補正には最大距離10、マーカー視認率0.1、軌道平滑化係数0.01を使用します。相互相関および基準補正は、ドリフト補正の精度をテストするために他のFNDに適用できる補正ファイルを生成します。
- もっと厳しく、より正確なドリフト補正を行うには、前述の10のような平均補正基準（AFC）アルゴリズムを使用します。このプロセスは、パラメータの最適化を必要とせず、SMLMローカリゼーションアルゴリズムによって予測されるよりも高いローカライゼーション精度をもたらす。しかし、平均ドリフト補正には、少なくとも4つのFNDが必要であり、FNDが画像スタックのすべてのフレームに局在する必要があります。 AFCドリフト補正は、FNDの数を増やすほど効果的です。これは、多数のローカライズされたFNDが、特定のフレームの外れ値ピークの歪み効果を軽減するためです。
- 以前に説明したようにThunderSTORMを使用して画像スタック内のポイントスプレッド機能をすべてローカライズする10 。我々は、100nmのピクセルサイズ、A / D数4.28、ベースレベルA / Dカウント100、EMゲイン100、PSF：統合ガウス局在、5ピクセルフィッティング半径、最尤フィッティング法、および1.3ピクセル初期シグマ。
- FNDから取得したドリフト補正係数を、画像スタック全体からローカライズに適用します。最終的な画像を視覚的に検査して、適切なドリフト補正が行われるようにします（ 図2 ）。得られたドリフト補正係数は、ドリフト補正精度のレベルを測定するために、AFC手順に含まれていないFNDについて独立してテストされるべきである。ドリフト補正された独立したFNDの精度は、ステップ2.1.6で使用されたローカリゼーションアルゴリズムから計算された平均精度/不確実性値に近くなければなりません。
- 順次標識された抗体のmadSTORMイメージスタックについては、2.1.1〜2.1.7の手順を繰り返します。各madSTORMイメージスタックに同じFNDセットをローカライズすることは、次のアライメント手順にとって重要です。
- madSTORM画像のアライメント
- 各madSTORM画像のドリフト補正FNDの重心位置を計算します。これを行うには、平均x軸とy軸を求めます。局所化された各FNDについての位置付け、および各madSTORM画像内のすべてのFNDの平均xおよびy位置の平均をとる。このステップの詳細なアルゴリズムは、先に説明した10 。 FND基準マーカーの重心位置を使用して連続madSTORM画像を整列させます。アラインメントを実行するには、2つ目のmadSTORM画像のFNDの重心位置を最初の位置から減算することによって、2つのローカライズされたmadSTORM画像間のオフセットを計算します。その後、2番目のmadSTORM画像内のすべてのローカリゼーションからオフセット量を減算します。
- 最初のmadSTORMイメージを参照イメージとして使用し、1番目と3番目、1番目と4番目などの間でこのアライメントステップを繰り返すことをお勧めします。アライメントプロセスに含まれていないFND間のオフセットを測定することによってアライメント精度をテストします。大きなオフセットは、シーケンシャルなmadSTORM画像の重心位置を計算する際に、異なるセットのFNDが使用されたことを示している可能性があります。
- そうであれば、ステップ2.2.1-2.2.2のステップ同一のFNDのセットを用いてアライメントを行うことが繰り返される。
注：AFCドリフト補正とアラインメント手順の両方のカスタムコードが提供されています。
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Representative Results
連続的な溶出および染色法を使用して、活性化されたJurkat T細胞（ 図1 、検査図のアライメント）におけるマイクロクラスターおよび他の構造の多重化madSTORM画像を作製した。各疑似カラー画像は、ステップ1.1.1〜1.3.13で取得したmadSTORM画像の1ラウンドを表します。前に説明したように、多重標的間のクロストークを避けるために、視野は前の溶出されていない抗体からの残留シグナルについてモニターされるべきである。さらに、溶出効率は抗体によって異なることがあるので、順次多重化の順序は、エピトープの立体ブロッキングを最小限に抑えるために、最良の溶出抗体から最悪の溶出抗体まで配置されるべきである。 図1の最後のmadSTORMイメージは、セクション2で説明したように、AFCとFNDの基準マーカーを使用してドリフトとアラインメントを修正しました。
図2A 、 2B ）および活性化されたJurkat T細胞（ 図2C 、 2D ）からの局在化についてAFCを実施するためにFNDを使用した。 AFCドリフト補正は、提供されたアルゴリズムを使用して、ステップ2.1.1〜2.1.8で説明したように行った。第1に、ドリフト補正アルゴリズムを適切に適用するために、ドリフト補正後の画像の視覚検査（ 図2C ）が推奨される。第2に、AFCの精度を確認するために、X軸とY軸の両方のローカライゼーションの標準偏差を測定することをお勧めします。以前に報告されたように、AFCは、通常、様々な位置特定アルゴリズムによって予想されるよりも高い精度をもたらす。
図1： （ A B ）A.スケールバーのボックス領域の拡大画像= 500nm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：平均Fiducial補正を用いたドリフト補正の前（ B ）と30,000画像フレーム（ A ）に局在する単一のFNDのSMLM画像。スケールバー= 20nm（AおよびB）。活性化されたJurkat T細胞のSMLM画像が染色された平均の基準補正を用いたドリフト補正の前と後の（ D ）の抗リン酸化SLP76（Y128）抗体およびFND基準マーカー（ C ）を示す。スケールバー=2μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
madSTORMのシーケンシャルマルチプレックス、ドリフト補正、アラインメントの手順により、細胞内の異種構造の正確かつ高度に多重化された可視化が可能になります。さらに、madSTORMは、非遠赤色色素9,12の色収差や準最適な光スイッチング/発光特性など、多色STORMの制限を回避します。溶出工程が逐次的に結合した抗体からの立体障害を有意に減少させるので、madSTORMを使用して、従来の技術9,15,21によって達成された6〜10ラウンドの多重イメージングを超える細胞サンプルの繰り返しイメージングを行うことができる。さらに、連続的な溶出および染色工程はSMLMに限定されず、共焦点顕微鏡法、SIMおよび2光子顕微鏡法などの他の画像法にも使用することができる。しかし、madSTORMは、逐次免疫染色法であり、この技術は各標的分子に対する抗体の利用可能性によって制限される。各抗体は、特異性、標識効率、および溶出能力を保証するために慎重に試験しなければならない。
madSTORMの取得設定は、個々の光スイッチングイベントの検出を最大限にするように選択されており、2.5nmの平均ローカライゼーション精度を達成できました。しかし、高精度は時間を犠牲にしており、前述のようにmadSTORMイメージングの各ラウンドに約3時間を要します10 。より低い位置精度（5~10nm）でより高速な画像取得を行うには、露光時間を短くし、EMゲインを高くすることを推奨します（ 例えば 20ms露光、EMゲイン300X、16ビットで17MHz、変換ゲイン3）。さらに、madSTORMイメージングの各ラウンドごとにマルチカラーイメージング（ 例えば、 Atto-488、Alexa-568、およびAlexa-647 nm）を実行して多重化の規模を拡大することができます色収差による位置合わせ精度の低下を招いてしまう。
このプロトコルを使用してmadSTORMイメージングを25回まで正常に実行しました。全体の手順は、顕微鏡ステージ上にマウントされたカバーガラスチャンバで実行されるので、同じ位置にカバーガラスチャンバを確保することが重要です。これを行うにはオートフォーカスモードを使用し、金属クランプを使用して顕微鏡ステージにチャンバーを取り付けます。有意なステージドリフトが生じた場合、細胞サンプルを再センタリングするために、FND基準マーカーの既知の位置を使用する。
位置合わせされたmadSTORM画像の同時視覚化は困難なことがあります。 7つ以下のmadSTORMイメージを同時に表示するには、ImageJのColor / merge channelsを使用して擬似カラー合成イメージを作成します。 8つ以上の画像の場合、madSTORM画像を異なるグループに分類し、各グループを合成画像にマージし、各合成画像に単一のLUTカラーを適用することをお勧めします。
23を印加することにより、発光強度をその場で〜50％まで減少させることができる。強度の減少は約500ガウスまでほぼ線形であり、その時点で、エフェクトtは飽和する。実際には、視野内のダイヤモンドの強度は、永久磁石を顕微鏡スライドに近づけることによって、所望の程度まで減少させることができる。
最後に、我々は、T細胞マイクロクラスターの分子成分を標的とする抗体の除去のために溶出バッファーを最適化した。 madSTORMはTCRマイクロクラスターに限定されないが、微小管、ミトコンドリア、F-アクチン、ビメンチンおよび他の分子構造がこの技術を用いて画像化されるので、 10 。他の細胞コンパートメントを標的とする抗体については、より高い温度、より低いpHおよび溶出緩衝液のより長いインキュベーションのようなエピトープ結合を破壊するための追加の工程が必要とされ得る。逆に、溶出緩衝液をTween-20なしで使用すると、高感度の膜構造を標的とし、非イオン性相互作用の破壊を防ぐことができます。我々は、将来の実験において、溶出緩衝液組成が個々の抗体tに適合することを予見するo溶出効率とサンプル保存を最適化します。さらに、活性化されたT細胞における適用を超えて、madSTORMは、インビトロ分子複合体、異なる細胞型および組織切片を含む他のシステムで実現可能であり得る。固定化、透過化、抗体染色、溶出バッファー組成などのmadSTORMプロトコールのさまざまなパラメーターは、各標的システムに対して調整する必要があります。
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Disclosures
私たちには何も開示するものはありません。
Acknowledgments
我々はSTORM顕微鏡へのアクセスのためにXufeng Wuに感謝します。この研究は、国立がん研究所（NCI）がん研究センターと国立心臓肺血液研究所（NHLBI）の教室内研究プログラムによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
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