Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus
Summary
Dieses Manuskript stellt Methoden für die Analyse morphometrische und zelluläre Veränderungen innerhalb des Unterkiefers Kondylus von Nagetieren.
Abstract
Das Kiefergelenk (TMJ) hat die Fähigkeit zur Anpassung an äußere Reize und laden Änderungen beeinflussen die Position der Kondylen sowie die strukturelle und zellulären Komponenten des Unterkiefers kondylären Knorpels (MCC). Dieses Manuskript beschreibt Methoden für die Analyse dieser Veränderungen und eine Methode für das Laden des Kiefergelenks in Mäusen (d. h. zusammenpressende statische TMJ laden) zu verändern. Die strukturellen Bewertung hier abgebildete ist eine einfach morphometrische Ansatz, der nutzt die Digimizer-Software und wird in Röntgenaufnahmen kleiner Knochen durchgeführt. Darüber hinaus die Analyse der zellulären ändert führt zu Veränderungen im Kollagen Ausdruck, Knochenaufbau, Zellteilung und Proteoglykan Verteilung im MCC beschrieben. Die Quantifizierung dieser Änderungen in histologischen Abschnitten – durch zählen der positiven fluoreszierenden Pixeln mit Software und messen die Entfernung Zuordnung von Bildern und gefärbten Bereich mit Digimizer – wird auch demonstriert. Die hier gezeigten Methoden beschränken sich nicht auf das murine TMJ, aber auf zusätzliche Knochen der kleinen Versuchstieren und in anderen Regionen der Endochondral Verknöcherung verwendet werden konnte.
Introduction
Kiefergelenk ist ein einzigartiges tragende Gelenk in der kraniofazialen Region gelegen und besteht aus Faserknorpel gebildet. Die MCC des Kiefergelenks ist unerlässlich für die Funktion der Gelenke, einschließlich ungehindert Kieferbewegung beim sprechen und arbeiten, aber es ist häufig von degenerativen Erkrankungen wie Arthrose1betroffen. Kiefergelenk hat die Fähigkeit zur Anpassung an äußere Reize und laden Umbauten, führt zu strukturellen und zellulären Veränderungen auf die Komponenten des MCC2,3,4,5. Die tragenden Eigenschaften des MCC lässt sich durch die Wechselwirkungen zwischen seinen Bestandteilen, einschließlich Wasser, das Kollagennetz und dicht gepackte Proteoglykane. Der MCC hat vier verschiedene zelluläre Zonen, die verschiedene Arten von Kollagen und nicht-Kollagen Proteine ausdrücken: 1) der oberflächlichen oder artikuläre Zone; (2) die proliferative Zone, bestehend aus undifferenzierten mesenchymalen Zellen und das reagiert auf Anforderungen laden; (3) die prehypertrophic Zone, bestehend aus Reife Chondrozyten Kollagen Typ 2 zum Ausdruck zu bringen; und 4) die hypertrophen zone, die Region, wo die hypertrophen Chondrozyten auszudrücken Kollagen Typ 10 sterben, und Verkalkung zu unterziehen. Die nicht mineralisierten Region ist reich an Proteoglykanen, die Resistenz gegen Druckkräfte6zur Verfügung zu stellen.
Gibt es kontinuierliche Mineralisierung in der hypertrophen Zone des MCC, wo der Übergang von werden zur Osteogenesis auftritt, garantiert die robuste mineralische Struktur des subchondralen Knochens des Unterkiefers Kondylus7. Zellveränderungen in den Regionen Latein und mineralisierten führen letztlich zu morphologischen und strukturelle Veränderungen in den Unterkiefer Kondylus und Unterkiefer. Aufrechterhaltung der Homöostase der alle zellulären Regionen des MCC und die Mineralisierung des subchondralen Teils sind unerlässlich für die Gesundheit, die Tragfähigkeit und die Integrität des Kiefergelenks.
Die mehrere Kollagen transgenen Mausmodell (wie von Utreja Et Al.beschrieben) 8 ist ein großartiges Werkzeug verwenden, um Veränderungen im Kollagen Ausdruck zu verstehen, weil alle transgene im MCC ausgedrückt werden. Für eine eingehende histologische Bewertung werden histologische Flecken zur Matrix Deposition, Mineralisierung, Zellproliferation, Apoptose, sowie Protein-Expression in den verschiedenen Zellschichten des MCC zu studieren.
In diesem werden Manuskript, histologische und morphometrische Analysen zur zelluläre und strukturelle Veränderungen in der MCC und subchondralen Knochen des Unterkiefers Kondylus von Mäusen zu bewerten. Darüber hinaus wird eine Zelle Quantifizierungsmethode, für die Analyse von fluoreszierenden histologische Bilder und für die Zuordnung von leichten Objektträger, beschrieben. Zusammenpressende statische Kiefergelenk laden-Methode, die zelluläre und morphologische Veränderungen an der MCC und subchondralen Knochen9verursacht, wird auch veranschaulicht, um unsere Methoden zu überprüfen.
Die hier beschriebenen Methoden einsetzbar, morphometrische und histologische Veränderungen im Unterkiefer Kondylus und Unterkiefer von Nagetieren zu bestimmen oder zu anderen Regionen der Endochondral Verknöcherung und die Morphologie der zusätzlichen mineralisierten Gewebe zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschriebenen Verfahren zur Messung der morphometrische und zelluläre Analyse der murinen mandibulares Kondylen und Mandibeln. Die radiologischen morphometrische Maße können auch verwendet werden, andere Knochen aus kleinen Versuchstieren zu analysieren. Darüber hinaus die zelluläre Analyse (Zelle Quantifizierung und Knorpel Entfernung Zuordnung) beschränken sich nicht auf das Nagetier mandibulares Kondylus, sondern kann zur histologischen Abschnitte von zahlreichen Geweben zu quantifizieren.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Dr. David Rowe danken, dass freundlicherweise die transgene Mäuse und Li Chen für die histologische Unterstützung.
Die Forschung berichtet in dieser Publikation wurde vom nationalen Institut der Dental & Craniofacial Forschung von den National Institutes of Health unter Preis Anzahl K08DE025914 und der amerikanischen Vereinigung der kieferorthopädischen Foundation zur Sumit Yadav unterstützt.
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
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