Murine Mandibular Condyle के लिए एक Morphometric और सेलुलर विश्लेषण विधि
Summary
यह पांडुलिपि कुतर के mandibular condyle के भीतर morphometric और सेलुलर परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए विधियाँ प्रस्तुत करती है ।
Abstract
temporomandibular संयुक्त (TMJ) क्षमता बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अनुकूल है, और परिवर्तन लोड हो रहा है condyles की स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं, साथ ही साथ संरचनात्मक और सेलुलर घटकों के mandibular condylar उपास्थि (एमसीसी). इस पांडुलिपि इन परिवर्तनों का विश्लेषण और चूहों में TMJ की लोडिंग बदलने के लिए एक विधि के लिए तरीकों का वर्णन (यानी, संपीड़न स्थिर TMJ लोड हो रहा है) । संरचनात्मक मूल्यांकन यहां सचित्र एक सरल morphometric दृष्टिकोण है कि Digimizer सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है और छोटी हड्डियों के रेडियोग्राफ में किया जाता है । इसके अलावा, सेलुलर परिवर्तन के विश्लेषण कोलेजन अभिव्यक्ति, अस्थि remodeling, सेल विभाजन, और एमसीसी में proteoglycan वितरण में परिवर्तन करने के लिए अग्रणी वर्णन किया गया है । ऊतकीय वर्गों में इन परिवर्तनों का ठहराव-छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सकारात्मक फ्लोरोसेंट पिक्सल गिनती और दूरी मानचित्रण और Digimizer के साथ दाग क्षेत्र को मापने के द्वारा भी प्रदर्शन किया है । यहां दिखाए गए तरीकों murine TMJ तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन छोटे प्रयोगात्मक पशुओं के अतिरिक्त हड्डियों पर और endochondral हड्डी के अंय क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
TMJ एक अनूठा लोड असर craniofacial क्षेत्र में स्थित संयुक्त है और fibrocartilage का गठन किया है । TMJ के एमसीसी संयुक्त समारोह के लिए आवश्यक है, जबकि बोल और masticating बाधा जबड़े आंदोलन सहित, लेकिन यह आमतौर पर अपक्षयी रोगों,1सहित पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस से प्रभावित है । TMJ बाहरी उत्तेजनाओं और लोड हो रहा है परिवर्तन करने के लिए अनुकूल करने की क्षमता है, एमसीसी के घटकों के लिए संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तन करने के लिए अग्रणी2,3,4,5। लोड-एमसीसी के गुण असर अपने घटकों के बीच बातचीत द्वारा समझाया जा सकता है, पानी सहित, कोलेजन नेटवर्क, और घनी proteoglycans पैक । एमसीसी चार अलग सेलुलर क्षेत्रों है कि व्यक्त कोलेजन और गैर कोलेजन प्रोटीन के विभिंन प्रकार: 1) सतही या जोड़दार क्षेत्र; 2) प्रफलन क्षेत्र, विभेदित mesenchymal कोशिकाओं से बना है और है कि लोडिंग मांगों का जवाब; 3) prehypertrophic क्षेत्र, परिपक्व chondrocytes व्यक्त कोलेजन प्रकार 2 से बना; और 4) hypertrophic जोन, क्षेत्र जहां hypertrophic chondrocytes व्यक्त कोलेजन प्रकार 10 मरो और कड़ा से गुजरना । गैर खनिज क्षेत्र proteoglycans में समृद्ध है जो संपीड़न बल6के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं ।
वहां एमसीसी के hypertrophic क्षेत्र में निरंतर खनिज है, जहां chondrogenesis से आस्टियोजेनेसिस को संक्रमण होता है, subchondral mandibular के condyle हड्डी के मजबूत खनिज संरचना की गारंटी7। खनिज और खनिज क्षेत्र में सेलुलर परिवर्तन अंततः रूपात्मक और mandibular condyle और mandible में संरचनात्मक परिवर्तन के लिए नेतृत्व । एमसीसी के सभी सेलुलर क्षेत्रों और subchondral भाग के खनिज के homeostasis के रखरखाव के स्वास्थ्य के लिए आवश्यक हैं, भार असर क्षमता, और TMJ की अखंडता ।
एकाधिक कोलेजन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (के रूप में Utreja एट अल द्वारा वर्णित है.) 8 एक महान उपकरण के लिए कोलेजन अभिव्यक्ति में परिवर्तन समझ का उपयोग करें, क्योंकि सभी transgenes एमसीसी में व्यक्त कर रहे हैं । एक में गहराई ऊतकीय मूल्यांकन के लिए, ऊतकीय दाग मैट्रिक्स जमाव, खनिज, सेल प्रसार, और apoptosis, साथ ही साथ एमसीसी के विभिंन सेल परतों पर प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
इस पांडुलिपि में ऊतकीय और morphometric विश्लेषणों में चूहों के mandibular condyle के एमसीसी और subchondral की हड्डी में सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन किया जाता है. इसके अलावा, एक सेल ठहराव विधि, फ्लोरोसेंट ऊतकीय छवियों का विश्लेषण करने के लिए और प्रकाश माइक्रोस्कोप स्लाइड मानचित्रण के लिए, वर्णित है । संपीड़न स्थिर TMJ लोडिंग विधि है, जो एमसीसी और subchondral बोन9में सेलुलर और रूपात्मक परिवर्तन का कारण बनता है, यह भी हमारे तरीकों को मांय सचित्र है ।
यहां वर्णित विधियों का उपयोग mandibular condyle और mandible में morphometric और ऊतकीय परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है या endochondral हड्डी के अंय क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए और अतिरिक्त खनिज ऊतकों की आकृति विज्ञान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि murine mandibular condyles और mandibles के morphometric माप और सेलुलर विश्लेषण के लिए तरीकों का वर्णन किया । रेडियोग्राफिक morphometric मापन के लिए छोटे प्रायोगिक पशुओं से अन्य हड्डियों का विश्लेषण भी किया जा सकता है. इसके अलाव…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक कृपया ऊतकीय सहायता के लिए ट्रांसजेनिक चूहों और ली चेन प्रदान करने के लिए डॉ डेविड रोवे शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
इस प्रकाशन में दी गई रिसर्च को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड Craniofacial रिसर्च ऑफ हेल्थ के राष्ट्रीय संस्थान अवार्ड नंबर K08DE025914 के तहत और अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ Orthodontic फाउंडेशन द्वारा सुमित यादव को सपोर्ट किया गया ।
Materials
| MX20 Radiography System | Faxitron X-Ray LLC | ||
| Digimizer Image software | MedCalc Software | ||
| Shandon Cryomatrix embedding resin | Thermo Scientific | 6769006 | |
| Manual microscope Axio Imager Z1 | Carl Zeiss | 208562 | |
| yellow fluorescent protein filter – EYFP | Chroma Technology Corp | 49003 | |
| cyan fluorescent protein filter – ECFP | Chroma Technology Corp | 49001 | |
| red fluoresecent protein filter – Cy5 | Chroma Technology Corp | 49009 | |
| sodium acetate anhydrous | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| sodium L-tartrate dibasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 237213 | |
| ELF97 substrate | Thermo Fisher Scientific | E6600 | |
| ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit | Life Technologies | C10339 | includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Scientific | D1306 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems Incorporated | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Research Products International | P32080-100T | |
| CNA Beta III Nickel-Free Archwire | Ortho Organizers, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. |
References
- LeResche, L. Epidemiology of Temporomandibular Disorders: Implications for the Investigation of Etiologic Factors. Crit Rev Oral Biol Med. 8 (3), 291-305 (1997).
- Chen, J., et al. Altered functional loading causes differential effects in the subchondral bone and condylar cartilage in the temporomandibular joint from young mice. Osteoarthr Cartil. 17 (3), 354-361 (2009).
- Pirttiniemi, P., Kantomaa, T., Sorsa, T. Effect of decreased loading on the metabolic activity of the mandibular condylar cartilage in the rat. Eur J Orthod. 26 (1), 1-5 (2004).
- Chavan, S. J., Bhad, W. A., Doshi, U. H. Comparison of temporomandibular joint changes in Twin Block and Bionator appliance therapy: a magnetic resonance imaging study. Prog Orthod. 15 (57), (2014).
- Dutra, E. H., et al. Cellular and Matrix Response of the Mandibular Condylar Cartilage to Botulinum Toxin. PLoS ONE. 11 (10), 0164599 (2016).
- Benjamin, M., Ralphs, J. R. Biology of fibrocartilage cells. Int Rev Cytol. 233, 1-45 (2004).
- Shen, G., Darendeliler, M. A. The Adaptive Remodeling of Condylar Cartilage- A Transition from Chondrogenesis to Osteogenesis. J Dent Res. 84 (8), 691-699 (2005).
- Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
- Kaul, R., et al. The Effect of Altered Loading on Mandibular Condylar Cartilage. PLoS ONE. 11 (7), 0160121 (2016).
- Dyment, N. A., et al. High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues. J Vis Exp. , e54468 (2016).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).
- Hayman, A. R. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
