Summary
Här beskriver vi en innovativ metod för att bestämma komplementreceptor 1 (CR1) längdpolymorfismer för användning i flera applikationer, särskilt bedömningen av mottaglighet för sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom (AD). Denna metod kan vara användbar för att bättre förstå rollen av CR1-isoformer i patogenesen av AD.
Abstract
Komplementreceptor 1 (CR1), ett transmembran glykoprotein som spelar en nyckelroll i det medfödda immunsystemet, uttrycks på många celltyper, men speciellt på röda blodkroppar (RBC). Som en receptor för komplementkomponenterna C3b och C4b reglerar CR1 aktiveringen av komplementkaskaden och främjar fagocytosen av immunkomplex och cellulär skräp, såväl som amyloid-beta (Ap) -peptiden i Alzheimers sjukdom (AD). Flera studier har bekräftat AD-associerade enkla nukleotidpolymorfier (SNP), såväl som en kopiantalvariation (CNV) i CRl- genen. Här beskriver vi en innovativ metod för att bestämma CRM-receptorens längdpolymorfism. Receptorn innefattar tre domäner, kallade långa homologa upprepningar (LHR) -LHR-A, LHR-C och LHR-D- och en n-domän, LHR-B, där n är ett heltal mellan 0 och 3. Användande av ett par Av specifika primrar, används det genetiska materialet för att amplifiera ett första fragment av LHR-B-domänen (thE-variant amplicon B) och ett andra fragment av LHR-C-domänen (det invarianta ampliconet). Variant amplicon B och invariant amplicon uppvisar skillnader vid fem nukleotider utanför hybridiseringsområdena av nämnda primrar. Antalet variantamplikoner B och av invarianta ampliconer härledas med användning av ett kvantitativt verktyg (HRM-kurvor) med hög upplösning och förhållandet mellan variant amplicon B och det invarianta amplikonet skiljer sig i enlighet med CRl-längdpolymorfismen. Denna metod ger flera fördelar jämfört med den kanoniska fenotypmetoden, eftersom det inte kräver nytt material och är billigare, snabbare och därför tillämpligt på större populationer. Användningen av denna metod bör således vara till hjälp för att bättre förstå rollen av CR1-isoformer i patogenesen av sjukdomar såsom AD.
Introduction
AD, den vanligaste orsaken till demens, påverkar mer än 30 miljoner människor runt om i världen och är ett stort folkhälsoproblem 1 . Kliniskt präglas AD av neurokognitiva störningar som leder till en progressiv förlust av autonomi 2 . AD karakteriseras av två neuropatologiska kännetecken, nämligen extracellulära amyloidavsättningar och intracellulära neurofibrillära tanglar 3 .
Traditionellt, enligt sjukdomens ålder, klassificeras AD i två former. Först är den tidiga början AD (EOAD), där uppkomsten oftast inträffar före 65 års ålder. Denna blankett står för mindre än 5% av AD-ärenden. Det är en sällsynt, autosomal dominant form av AD, vilket resulterar i fullständigt penetrerande mutationer antingen i amyloidprekursorproteinet ( APP) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 eller presenilin 2 ( PSEN2 )> 6 gener. För det andra kallas den mer vanliga formen av sjukdomen (> 90% av AD-fall) "sporadisk" sena början AD (LOAD) och förekommer oftast hos individer i åldern 65 år eller äldre. Det härrör från flera genetiska och miljömässiga riskfaktorer 7 . I LOAD är den 4 allelen av apolipoprotein E ( APOE ) -genen den huvudsakliga genetiska riskfaktorn 8 , 9 . Vidare har mer än 20 gen-loci identifierats genom genom-breda associeringsstudier (GWAS) som förknippade med risken för AD, varav den ena är komplementkomponent (3b / 4b) receptor 1 ( CR1 ) genen 10 , lokaliserad på Kromosom 1q32 i ett kluster av komplementrelaterade proteiner. CR1- genen kodar för komplementreceptortyp 1 (CRl) -proteinet, en komponent av komplementaktivitetsregulatorerna.
CR1 (C3b / C4b-receptorn, CD35), ett transmembran glykoprotein approximativtEly 200 kDa 11 , binder till C3b, C4b, C3bi, Clq, mannanbindande lektin (MBL) och ficolin-komplementproteiner 12 . Den biologiska funktionen av CR1 varierar med celltyperna i vilka den uttrycks. Hos människor finns 90% av den totala cirkulerande CR1 i röda blodkroppar (RBC) 13 . Närvarande vid ytan av RBC, binder CR1 till C3b- eller C4b-opsoniserade mikroorganismer eller immunkomplex, vilket underlättar deras clearance från cirkulationen. Komplex som är bundna till CR1 överförs faktiskt till fagocyter när RBCs går igenom levern och mjälten 11 , 14 . Genom att begränsa avsättningen av C3b och C4b kan CR1 förhindra överdriven komplementaktivering. Därför betraktas uttrycket av CR1 på RBC som ett väsentligt element i skyddet av vävnader, såsom det cerebrala nervsystemet, mot immunkomplex avsättning och de resulterande sjukdomarna. CR1 på RBC är också känd förSpela en viktig roll vid patogen infektion 15 , 16 . Dessutom är CR1 som en nyckelaktör i medfödd immunitet inblandad i reglering av komplementkaskaden och vid transport och clearance av immunkomplex. CR1 utövar denna aktivitet genom att binda C3b- och C4b-fragment och dissociera klassiska och alternativa konverteraser (dissociation av C2a från C4b2a-komplexet och dissociation av C3b från C3bBb-komplexet). Som en kofaktor för plasmaserinproteasfaktorn I (FI) hämmar CR1 de klassiska och alternativa komplementvägarna genom att öka klyvningen av C4b och C3b med FI, en egenskap som är känd som kofaktoraktivitet (CA) och genom att hämma C3-amplifieringsslingan , Vilket i sin tur förhindrar ytterligare komplementaktivering. Rogers och kollegor ger bevis för att Ap-peptiden kan binda och aktivera komplementvägen i frånvaro av antikroppar 17 och föreslå att Ap-peptiden är clEared från cirkulation via komplementberoende vidhäftning till CRl uttryckt på RBCs 18 .
CR1 uppvisar tre typer av polymorfier: struktur- eller längdpolymorfismer, densitetspolymorfismer och Knops blodgruppspolymorfismer 11 , 19 . Den strukturella polymorfismen är relaterad till en variation i antalet långa homologa upprepningar (LHR) och definierar således fyra isoformer. Faktum är att den extracellulära domänen i CR1-proteinet består av en serie upprepande enheter, som kallas korta konsensusrepetitioner (SCR) eller komplementkontrollrepetitioner (CCP). Dessa SCR har visats från komplement-deoxiribonukleinsyran (cDNA) som kodar för CR1. SCR: erna är anordnade i tandemgrupper av sju, kända som LHRs. CR1 är inrättad i fyra LHR, betecknade som LHR-A, -B, -C och -D, som härrör från duplicering av en sju-SCR-enhet 19 , 20 ,21 .
I ökande frekvensordning är dessa CR1-isoformer bestämda av Western blot (WB) CR1 * 1 (A / F) (snabb migrering på gelelektrofores), CR1 * 2 (B / S) (långsam migrering på gelelektrofores), CR1 * 3 (C / F ') och CR1 * 4 (D). De två vanligaste isoformerna CR1 * 1 (A / F) och CR1 * 2 (B / S) består av fyra respektive fem LHR, medan CR1 * 3 (C / F ') och CR1 * 4 (D ) Består av 3 respektive 6 LHR. Den vanligaste isoformen (CR1 * 1), bestående av 30 SCR, innehåller tre C4b-bindningsställen (SCRs 1-3, 8-10 och 15-17) och två C3b-bindningsställen (SCRs 8-10 och 15-17) , Medan SCR 22-28 binder Clq, ficoliner och MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Således innehåller CR1 * 2 en ytterligare C3b / C4b bindningsplats jämförtD till CR1 * 1. Figur 1 illustrerar strukturerna, nomenklaturerna och molekylvikterna av de fyra olika isoformerna av CRl.
Täthetspolymorfismen motsvarar en stabil fenotyp som representerar nivån av konstitutivt uttryck av CRl på RBC. I friska kaukasiska ämnen har det visat sig att antalet CR1-molekyler per RBC kan variera med upp till en faktor tio (varierande från 150 till 1200 molekyler per cell) 26 . RBC i Helgeson-fenotypen har en mycket låg CR1-densitet, vilken visades vara lägre än 150 molekyler per cell 27 , 28 . CR1-densiteten på RBC är genetiskt associerad med ett autosomalt kodominant bialleliskt system på CR1- genen, korrelerat med en Hin dIII-restriktionsfragmentlängdspolymorfism (RFLP) 29 . En enkelpunktsmutation i Intron 27 i CR1-genen, mellan exoner som kodar för den andraSCR i LHR-D, resulterar i genereringen av ett polymorft Hindlll-stället inom denna region 30. Genomiskt Hindlll-fragment av 7,4 och 6,9 kDa identifiera alleler associerade med hög (H-allel) eller låg (L allel) CR1 densitet på RBC, respektive. Emellertid observerades ingen korrelation mellan CRl-densitet på RBC och Hin dIII-polymorfismer i vissa västafrikanska populationer 31 , 32 . Mekanismen länknings CR1 densitetsreglering till en icke-kodande Hindlll polymorfism förblir okänd. Bland flera polymorfier har Q981H i SCR16 och P1786R i SCR28 rapporterats vara kopplade till CR1-densiteten på RBCs 30 , 33 .
Knoppens (KN) polymorfism, enligt den internationella nomenklaturen, är det 22: e blodgruppssystemet som ska indexeras av International Society of Blood Transfusion. Den innehåller 9 antigenspecifikaFiciteter uttryckta av CR1 på RBC, inklusive tre antitetiska antigenpar, KN1 / KN2, KN3 / KN6 och KN4 / KN7, såväl som 3 isolerade antigener, KN5, KN8, KN9. KN1-, KN3-, KN4- och KN5-antigenerna är högfrekventa antigener i KN-systemet ( dvs. uttryckt i mer än 99% av den allmänna befolkningen). Emellertid återstår denna polymorfis roll i AD att bestämmas 13 .
Protokollet som beskrivs i detta arbete var utformat för att bestämma CR1-längdpolymorfismens genotyper involverade i mottaglighet för flera sjukdomar, såsom AD, systemisk lupus erythematosus och malaria. Vår metod för bestämning av CRl-längd polymorfism utnyttjar antalet LHR-Bs innefattande CRl-isoformema och av sekvensskillnaderna mellan LHR-B och LHR-C ( Figur 2 ).
Protocol
Protokollet för humant blodinsamling och hantering har granskats och godkänts av regionala etiska kommittén (CPP Est II) och protokollet är 2011-A00594-37.
OBS! Följande protokoll beskriver hanteringen av humant blod. Var god följ de institutionella riktlinjerna när du kasserar biologiskt farligt material. Laboratoriesäkerhetsutrustning, såsom labbrockar och handskar, bör bäras. Ett flödesschema som beskriver protokollet visas i Figur 3 .
1. Blood and Body Fluid DNA Extraction
- Pipa 20 μl proteinas K (15 μg / μl) i botten av ett 1,5 ml rör.
- Tillsätt 200 μL prov till 1,5 ml röret. Använda upp till 200 mikroliter av helblod, plasma, serum, buffy coat, eller kroppsvätskor, eller upp till 5 x 10 6 lymfocyter i 200 | il av PBS.
- Tillsätt 200 μl lysisbuffert till provet. Blanda med pulsvirvel i 15 s.
- Inkubera vid 56 ° C i 10 min i ett vattenbad.
- Centrifugera 1,5 ml röret för att ta bort dropparna från lockets insida.
- Tillsätt 200 μl etanol (96-100%) till provet och blanda igen med pulsvirvel under 15 s. Efter blandning centrifugera 1,5 ml röret för att ta bort dropparna från lockets insida.
- Applicera försiktigt blandningen från steg 1.6 till membrankolonnen (i ett 2 ml uppsamlingsrör). Utan att fukta fälgen, stäng locket och centrifugera vid 6 000 xg under 1 min. Placera membrankolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera röret som innehåller filtratet.
- Öppna försiktigt membrankolonnen och tillsätt 500 μl tvättbuffert 1 utan att fukta fälgen. Stäng locket och centrifugera vid 6 000 xg under 1 min. Placera membrankolonnen i ett rent 2 ml uppsamlingsrör och kassera röret som innehåller filtratet.
- Öppna försiktigt membrankolonnen och tillsätt 500 μl tvättbuffert 2 utan att fuktasE rand. Stäng locket och centrifugera med full hastighet (20 000 xg) i 3 min.
- Placera membrankolonnen i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör och kassera uppsamlingsröret med filtratet. Centrifugera vid 20 000 xg under 1 min.
- Placera membrankolonnen i ett rent 1,5 ml rör och kassera uppsamlingsröret som innehåller filtratet.
- Öppna försiktigt membrankolonnen och tillsätt 200 μl destillerat vatten. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter och centrifugera sedan vid 6000 xg under 1 min.
- Fortsätt till bestämningen av DNA-koncentrationssteget eller frys DNA-proverna vid -20 ° C
2. Bestämning av DNA-koncentrationen
OBS: Se figur 4 .
- Tryck 1 för att välja DNA-läge på en spektrofotometer. Välj en längd på 5 mm med hjälp av vänster och högerpil. Välj en utspädningsfaktor på 1 med vänster och högerpil.
- Välj enheten (μg / ml) med hjälp av thE vänster och höger pilar. Välj en faktor 50 med vänster och högerpil. Tryck på OK .
- Pipa 10 μl destillerat vatten in i kyvetten. Sätt kyvetten i spektrofotometern. Tryck på OA / 100% T- knappen.
- Pipettera 10 μl av DNA-provet (1/4 spädning i destillerat vatten) i kyvetten. Sätt kyvetten i spektrofotometern. Tryck på den gröna knappen (läs / start). Notera koncentrationen.
- Frys DNA-provet vid -20 ° C.
3. HRM-PCR-protokoll
- Tina DNA-proverna. Späd DNA-proverna i 1,5 ml rör med vatten för att justera dem till en koncentration av 10 ng / μl
OBS: Den totala volymen av utspätt DNA bör ligga mellan 2 μl och 10 μl. - Tina primerlösningarna. Torka primerlösningarna i 1,5 ml rör med vatten för att justera dem till samma koncentration av 6 μM.
OBS: Primersekvenserna och reaktionsbetingelserna tillhandahålls i TKunna 1.
Tabell 1: Primers och parametrar som används i smältanalysen med hög upplösning.
- Tina HRM-PCR-satslösningarna och blanda noggrant genom vortexing för att säkerställa återhämtning av allt innehåll. Snurra kort de tre injektionsflaskor innehållande den enzymatiska blandningen med DNA-bindande färgämne, MgCl 2, och vatten i en mikrocentrifug innan öppnar dem. Förvara dem vid rumstemperatur.
- I ett 1,5 ml rör vid rumstemperatur, förbered PCR-blandningen för en 20 μl reaktion genom att tillsätta följande komponenter i följande ordning:
- 10 | il enzymatisk blandning med DNA-bindande färgämne;
- 2 mikroliter av 25 mM MgCl2;
- 1 | il primer 1, 6 | iM (slutkoncentration: 300 nM);
- 1 jil primer 2, 6 jjM (slutkoncentration: 300nM); och
- 5 | il vatten.
OBS! För att förbereda PCR-blandningen för mer än en reaktion multiplicera volymerna ovan med antalet reaktioner som ska köras plus en ytterligare reaktion.
- Blanda försiktigt med vortexing.
- Pipett 19 μl PCR-blandning, framställd ovan, i varje brunn i en vit multiwellplatta.
- Tillsätt 1 μl koncentrationsjusterad DNA-mall, framställd i steg 3.1.
OBS! För kontrollreaktioner, kör alltid en negativ kontroll med proven. För att förbereda en negativ kontroll, ersätt mall-DNA med vatten. - Tät den vita multiwellplattan med tätningsfolien.
- Placera den vita multiwellplattan i centrifugen och balansera den med en lämplig motvikt ( dvs en annan multiwellplatta). Centrifugera i 1 minut vid 1 500 xg i en standard sväng-centrifuge innehållande en rotor för multiwellplattor med lämpliga adaptrar.
- Ladda den vita multiwellplattan i HRM-PCR-instrumentet.
- Starta HRM-PCR-programmet med följande PCR-förhållanden:
Denaturering: 95 ° C i 10 min; 1 cykel.
Amplifikation: 95 ° C under 10 s, 62 ° C i 15s och 72 ° C i 20s; 47 cykler.
Smältningskurva: 95 ° C; Ramphastighet: 0,02 ° C / s; 25 förvärv per ° C; 1 cykel.
Kylning: 40 ° C i 30 s; Ramphastighet 2,2 ° C / s; 1 cykel.
4. HRM-analys för att bestämma CR1-längdspolymorfismen
OBS! Metoden som beskrivs ( Figur 5 ) är specifik för vår programvara (Se materialet ), även om andra programvarupaket kan användas.
- Öppna en genscanningsprogramvara för att utföra CR1-längdpolymorfismsökningsanalysen.
- Öppna experimentet som innehåller amplifieringsprogrammet och smältkurvan.
- Klicka på Sample Editor i modulfältet och välj sedan SKonserveringsflöde .
- Definiera egenskaperna hos proven ( dvs. namn, okänd eller negativ kontroll).
- Klicka på Analys i modulfältet .
- Välj Genskanning i listan Skapa ny analys .
- Klicka på fliken Normalisering för att normalisera smältkurvorna.
- Klicka på fliken Temperaturförskjutning för att återställa smältkurvens temperaturaxel (x-axel).
OBS: Nedre grafen visar smältkurvor som både normaliseras och temperaturskiftas. - Klicka på knappen Beräkna för att analysera resultaten och bestämma grupperingen.
- Klicka på fliken Difference plot i diagramområdet för att visa Normaliserad och Shifted smältkurvor och Normaliserad och Temperaturförskjuten skillnadsplot .
Representative Results
Figur 6 A visar fenotypen av CRl-längdpolymorfismen av WB. Figur 6 B och C visar kurvorna som erhålles under HRM-PCR-analys, vilket möjliggör bestämning av CRl-längdpolymorfismen. Analys av fusionskurvorna med användning av mjukvaran efter högupplösnings-smältning av de PCR-härledda ampliconerna från det genomiska DNA hos personer med olika CR1-isoformer ger kurvor som diskriminerar individer enligt deras allotypiska CR1-expressionsfenotyper.
Figur 6 B visar ett första presentationsläge, kallat "Normaliserade och Shifted Smältkurvor", medan Figur 6 C visar ett andra presentationsläge, kallat "Normaliserad och Temp-Shifted Difference Plot."
Figur 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Och (CR1 * 2, CR1 * 4). Detta möjliggör genotypen av CR1-längdpolymorfismen med användning av denna nya molekylärbiologimetod.
Figur 1: Schematisk representation av strukturen och polymorfierna av komplementreceptor 1-proteinet. Varje kort konsensusupprepning (SCR) eller komplementkontrollprotein (CCP) representeras av en cirkel. SCR: erna är grupperade i en repetitiv struktur med högre ordning som heter LHR. Från den extracellulära domänen till cellmembranet är LHR: LHR-A, -B, -C, -D och -S (extra eller extra LHR). I den vanligaste CR1 isoformen(CR1 * 1), är bindningsstället för C4b / sönderfallaccelerationsaktivitet (DAA) lokaliserat vid LHR-A (SCRs 1-3, gröna cirklar), C3b / C4b / kofaktoraktivitets (CA) -bindningsstället är beläget i 3 N-terminala SCR av LHR-B (SCRs 8-10, röda cirklar) och LHR-C (SCRs 15-17, lila cirklar) och bindningsstället för C1q / MBL och ficolin återfinns i LHR-D (SCR 22-28, blå cirklar). De homologa strukturerna är färgade identiskt. CR1 * 2 (S) isoformen presenterar en ytterligare LHR (LHR-S) och innehåller således en ytterligare C3b / C4b bindningsplats. KDa, kilodalton. NRC, icke-reducerade förhållanden. RC, reducerade tillstånd. TM, transmembran domän. Denna siffra var anpassad från Brouwers et al. 36 med tillstånd från Nature Publishing Group. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
"/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
Figur 2 : Schematisk representation av CR1-isoformstrukturen med sekvensampliconpositioner erhållna genom HRM-PCR. Varje ruta representerar en SCR. SCR: erna är grupperade i LHR: LHR-A, -B, -C och -D. De homologa strukturerna är färgade identiskt. CR1 * 2 och CR1 * 4 isoformerna presenterar ytterligare LHR (LHR-B) och innehåller sålunda ett ytterligare ampliconområde (amplicon B, i rött). CR1 * 3 saknar LHR-B och innehåller mindre ampliconområde (saknar amplicon B). Nukleotidskillnader mellan amplicon B (196 bp) och invariant amplicon (197 bp) avbildas i rött och blått. Skillnader i förhållandet: (amplicon B, i röd / invariant amplicon, i blått) mellan varje CR1-isoform bestäms av HRM-PCR, vilket möjliggör genotypning. CN3- och CN3re-primersekvenserna är understrukna. TM, transmembran domän. CYT, cytoplasmatisk svans.Pg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Flödesschema för protokollet för genotypning av CR1-längdpolymorfismen från humana blodprover. Samla ett humant DNA-prov. Extrakt DNA för att erhålla ett DNA-blodprov. Bestäm DNA-koncentrationen och späd för att erhålla DNA-koncentrationen vid 10 ng / μl. Använd HRM-PCR för att erhålla genen av CR1-längd polymorfism. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : Skärmbilder av spektrofotometern oss Ed för att bestämma DNA-koncentrationen. Tryck 1 ( A ) för att välja DNA-läge på spektrofotometern. Välj en längd på 5 mm längd ( B ) med vänster och högerpil ( C ). Välj enheten (μg / mL) ( D ) med vänster och högerpil ( C ). Välj utspädningsfaktor 1 ( E ) med vänster och högerpil ( C ). Välj en faktor 50 ( F ) med vänster och högerpil. Tryck på OK ( G ). Pipa 10 μl destillerat vatten in i kyvetten. Sätt kyvetten i spektrofotometern ( H ). Tryck på OA / 100% T- knappen ( I ). Pipettera 10 μl DNA-prov (1/4 spädning i destillerat vatten) i kyvetten. Sätt kyvetten i spektrofotometern ( K ). Tryck på den gröna knappen (läs / start) ( L ). Notera koncentrationen ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Skärmdumpar av det grafiska gränssnittet för programvaran som används i steg 4 i protokollet. ( A ) Öppna genscanningsprogrammet. ( B ) Förstärkningsprogram och smältkurva-program. ( C ) Klicka på Sample Editor i modulfältet . ( D ) Välj skanning . ( E ) Definiera egenskaperna hos proven. ( F ) Klicka på Analys i modulfältet . ( G ) Klicka på fliken Normalisering för att normalisera smältkurvorna. ( H ) Klicka på fliken Temperaturförskjutning för att visa smältkurvorna som är bådaNormaliserad och temperaturskiftad. ( I ) Klicka på knappen Beräkna för att analysera resultaten och bestämma grupperingen. ( J ) Klicka på fliken Difference plot för att se Normaliserade och Shifted Smältkurvor och Normaliserad och Temperaturförskjuten Difference Plot . ( K ) Färgad gruppering av proven i enlighet med CR1-längdgenotyperna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Fenotypning av CR1-längdpolymorfierna observerade i WB och deras motsvarande profilkurvor erhållna genom HRM-PCR. ( A ) Fenotypning av CRl-längdpolymorfierna med användning av WB. ( B C ) Genotypning av CRl-längdpolymorfier med användning av HRM-PCR-analys. HRM-kurvanalys av PCR-amplikoner erhållna från det genomiska DNAet av ämnen som uppvisar olika CR1-isoformer ledde till identifieringen av specifika kurvprofiler: (CR1 * 3, CR1 * 1) (lila); (CR1 * 1, CR1 * 2) (blå); CR1 * 1 (grön); CR1 * 2 (röd); Och (CR1 * 2, CR1 * 4) (grå). Dessa motsvarar CR1-längd polymorfism alleler. Såsom visas av de två presentationssätten, "Normaliserade och Shifted Smeltkurvor" (B) och "Normaliserad och Temp-Shifted Difference Plot" (C), fördelas kurvprofilerna enligt (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Och (CR1 * 2, CR1 * 4) grupper. Denna figur anpassades från Mahmoudi et al. 38 med tillstånd från Elsevier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Här beskriver vi en allmänt tillgänglig metod för att studera CR1-längdpolymorfier. Molekylbiologiteknikerna för amplifiering eller segmental hybridisering har aldrig kunnat ge tillfredsställande resultat som möjliggör bestämning av CRl-längdpolymorfismer hos alla individer. Detta beror på den repetitiva strukturen hos CR1-genen ( dvs de högt repetitiva SCR: erna av CR1). Den molekylärbiologiska metod som beskrivs här utnyttjar den kvantitativa fördelningen av LHR-B i CRl-molekylen. CR1-molekylen innefattar n LHR-B-domäner, där n är ett tal mellan O och 3 och endast en LHR-C-domän, såsom beskrivs och illustreras i figur 2 . Kvantitativ domän B-detektering gör det möjligt att fullständigt diskriminera en ytterligare eller saknad domän B.
Från det extraherade genetiska materialet amplifieras ett första DNA-fragment från LHR-B genom PCR med användning av ett enda par specifika primrar, representerarTing en karakteristisk variant av LHR-B kallad "variant amplicon B." Ett andra DNA-fragment, kallat "invariant amplicon" och som tillhör LHR-C, amplifieras också. Detta andra DNA-fragment är ett fragment av LHR-C, men ett annat invariant fragment av LHR-A eller -D kan också användas.
De två DNA-fragmenten, variant amplicon B och det invarianta ampliconet amplifieras av samma primrar och uppvisar fem skillnader i nukleotidsekvenser. Denna egenskap gör det möjligt att i det efterföljande steget bestämma antalet variant amplicon B och antalet invarianta amplikoner med användning av ett kvantitativt molekylärbiologiskt verktyg, HRM, vilket var anpassat för detta ändamål. Förhållandet mellan antalet amplicon B och det invarianta amplikonet (förhållande: amplicon B / invariant amplicon) varierar beroende på längden av CRl-molekylen. Faktum är att CR1 * 4 visar 3 amplicon B-enheter till 1 invariant amplicon, CR1 * 2 visar 2 amplicon B-enheter till 1 invariant amplicon, CRi * 1 visar 1 amplicon B till 1 invariant amplicon, och CR1 * 3 visar 0 amplicon B enheter till 1 invariant amplicon ( Figur 2 ). Således möjliggör denna HRM-PCR-metod genotypen av CRl-längdpolymorfismen.
I studiens början kräver emellertid denna teknik användningen av referensämnen vars CR1-fenotyper redan är kända ( dvs tidigare etablerad av WB) för att kunna fastställa genotypen av CR1 i enlighet med referensprofilen för kurvor som erhållits Av HRM-PCR. Två typer av representation, nämligen "Normaliserade och Shifted Smältkurvor" och "Normaliserade och Temp-Shifted Difference Plot" är tillgängliga. De uppvisar separata grupper av kurvprofiler färgade enligt CR1-längdpolymorfismfenotypen erhållen av WB ( Figur 6 ). Från steget "Normaliserad och Skiftad Smältning" gör vår metod det möjligt att diskrimineraE distinkta kurvor som motsvarar isoformerna av CR1, grupperade efter färg. Den "Normaliserade och Temp Shifted Difference Plot", som motsvarar en annan matematisk representation, tillåter emellertid den enklare visualiseringen av de olika kurvorna. Även om tillverkarens programvara användes rutinmässigt i denna studie, kan annan programvara (som uANALYSE) användas som ett datautvinningsprogram för kurvanalys.
Hittills är WB-analystekniken den ursprungliga tekniken som möjliggör identifiering av de olika CR1-längdpolymorfierna vid proteinets nivå. Emellertid har denna teknik ett antal nackdelar. I synnerhet kan proteinanalys av WB endast utföras efter extraktion av cellmembranen. Som ett resultat är det komplext och mycket tidskrävande. Vidare kräver denna teknik att man erhåller ett nytt blodprov under lämpliga betingelser vid början av förfarandet för att uppnå användbar resÜLTS. Tvärtom gör HRM-PCR utförd på DNA det möjligt att använda jämnt torra fläckar eller prover efter långvarig lagring. HMR-PCR kräver ett specialiserat DNA-smältinstrument, antingen ett dedikerat instrument eller en HMR-kapacitets-termocykler med HRM-programvara. SNP-detektering är beroende av flera faktorer: i) SNP som ingår i stora PCR-fragment är svårare att detektera än samma SNP i små PCR-fragment; Ii) SNP som hör till klasserna III och IV är svårare att upptäcka än klasserna I och II 34 ; Och iii) SNPs som flankeras av närmaste grannbassymmetri ( t.ex. 5'-G (G / C) C-3 ') kan inte sorteras genom smältning oavsett HMR-plattformens upplösningskraft. Det kan vara användbart att testa de förutsagda PCR-fragmenten som innehåller SNP av intresse med uMELT-mjukvaran 35 för att bedöma analysens validitet. Slutligen är HMR-PCR en analog metod, vilket betyder att likheten hos smältkurvorna satsarWeen en referens och en mall betyder inte nödvändigtvis att mallsekvensen är identisk med referensen, eftersom mallsekvensen kan vara annorlunda än referens men termodynamiskt ekvivalent. Dessa begränsningar gäller emellertid inte för den metod som beskrivs här, vilken är baserad på smältningen av en blandning av amplikoner som skiljer sig i termer av 5 nukleotidsekvenser.
Dessutom har tekniken som beskrivs här, baserat på analysen av HRM, många fördelar. Först bestäms CR1-längdpolymorfismerna snabbare, eftersom resultaten erhålles inom ca 2 timmar när utdragningen av det genetiska materialet har utförts. Omvänt kräver traditionella biokemiska tekniker baserade på WB proteinanalys steg som är relativt långa: elektroforesen av cellmembranekstrakter genom en akrylamidgel, ett steg för att överföra proteiner till ett nitrocellulosa eller polyvinylidenfluorid (PVDF) -membran och ett steg för att identifiera Isoformer avCR1-molekylen genom immunokemiluminescens. För det andra har HRM-PCR-tekniken fördelen att det inte är för dyrt, vilket är särskilt viktigt för en metod som kan tillämpas på många individer ( dvs storskala) för att bestämma deras mottaglighet för utvecklingen av patologier såsom Alzheimers sjukdom, Lupus eller malaria.
Nyligen har vi och andra visat att CR1 * 2 isoformen, som innehåller ytterligare en C3b / C4b bindningsplats, associerades med AD 36 , 37 , 38 . I vår tidigare publicerade studie var CR1-längdpolymorfierna vid genens nivå och proteinet konsekventa hos 98,9% av individerna 38 . De obestridliga resultat som erhölls vid jämförelse av längdpolymorfier erhållna genom HRM-PCR med de som erhölls av WB, motsvarade personer med en genotypprofil (CR1 * 1, CR1 * 2) bestämd av HRM (gen) men exPressar endast CR1 * 1 isoformen vid ytan av erytrocyten enligt WB (protein). I vår studie var bristen på CR1 * 2-isoformuttryck (individer som bär en tyst allel) reproducerbar när WB utfördes med en längre exponeringstid och kunde förklaras av förekomsten av en tyst CR1-allel (CR1 * 2), beskriven I litteraturen av Helgeson 39 . Trots detta behövs ytterligare studier om större populationer för att stödja denna hypotes.
Det bör noteras att privata SNP (SNPs som endast förekommer i en liten familjegrupp eller ens i en enskild individ) ledde till tydliga kurvprofiler som ska dechiffreras med referensfenotypbestämning (WB) men som inte kan förväxlas med kanonprofilen för att undvika Någon fel tolkning av CR1-längd polymorfismgenotypen.
Disclosures
Författarna är uppfinnarna av ett patent som ägs av University of Reims Champagne-Ardenne (URCA) (patentnummer WO 2015166194)
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar av Plateforme Regionale de Biologie Innovante, personalen vid Immunologiska institutionen, och personalen vid institutionen för internmedicin och geriatri, som bidragit till att optimera och validera protokollet. Detta arbete finansierades av Reims Universitetssjukhus (bidragsnummer AOL11UF9156). Vi tackar också Fiona Ecarnot (EA3920, Universitetssjukhuset Besancon, Frankrike) för redaktionell hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
References
- Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
- McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
- Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T.
- Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
- Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
- Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
- Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
- Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
- Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
- Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
- Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
- Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
- Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
- Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
- Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
- Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
- Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
- Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
- Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
- Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
- Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
- Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
- Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
- Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
- Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
- Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
- Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).
