Summary
Her beskriver vi en nyskabende metode til bestemmelse af komplementreceptor 1 (CR1) -længdepolymorfier til anvendelse i flere anvendelser, især vurderingen af modtagelighed for sygdomme som Alzheimers sygdom (AD). Denne metode kan være nyttig til bedre at forstå rollen af CR1-isoformer i AD-patogenesen.
Abstract
Komplementreceptor 1 (CR1), et transmembran glycoprotein, der spiller en nøglerolle i det medfødte immunsystem, udtrykkes på mange celletyper, men især på røde blodlegemer (RBC'er). Som en receptor for komplementkomponenterne C3b og C4b regulerer CR1 aktiveringen af komplementkaskaden og fremmer fagocytosen af immunkomplekser og cellulære affald, såvel som amyloid-beta (Ap) peptidet i Alzheimers sygdom (AD). Flere undersøgelser har bekræftet AD-associerede enkelt nukleotidpolymorfier (SNP'er), såvel som en kopi-nummervariation (CNV) i CR1- genet. Her beskriver vi en innovativ metode til bestemmelse af CRM-receptorens længdepolymorfisme. Receptoren indbefatter tre domæner kaldet lange homologe gentagelser (LHR) -LHR-A, LHR-C og LHR-D og et n-domæne, LHR-B, hvor n er et helt tal mellem 0 og 3. Brug af et enkelt par Af specifikke primere, anvendes det genetiske materiale til at amplificere et første fragment af LHR-B-domænet (thE-variant amplicon B) og et andet fragment af LHR-C-domænet (det invariante amplicon). Variant amplicon B og invariant amplicon viser forskelle ved fem nukleotider uden for hybridiseringsområderne af primrene. Antallet af variant amplikoner B og af invariant ampliconer udledes ved anvendelse af et kvantitativt værktøj (HRM) kurver) og forholdet mellem variant amplicon B og den invariante amplicon varierer i overensstemmelse med CR1 længde polymorfisme. Denne metode giver flere fordele i forhold til den kanoniske phenotype metode, da det ikke kræver frisk materiale og er billigere, hurtigere og derfor anvendelig for større populationer. Anvendelsen af denne metode bør således være nyttig for bedre at forstå rollen af CR1-isoformer i patogenesen af sygdomme som AD.
Introduction
AD, den mest almindelige årsag til demens, påvirker mere end 30 millioner mennesker over hele verden og er et stort folkesundhedsproblem 1 . Klinisk er AD karakteriseret ved neurokognitive sygdomme, der fører til et progressivt tab af autonomi 2 . AD karakteriseres af to neuropatologiske kendetegn, nemlig ekstracellulære amyloide aflejringer og intracellulære neurofibrillære tangles 3 .
Traditionelt er AD, ifølge sygdomsalderen, klassificeret i to former. For det første er tidlig begyndelse AD (EOAD), hvor indtræden oftest forekommer før 65 år; Denne form tegner sig for mindre end 5% af AD-sager. Det er en sjælden autosomal dominant form for AD, som resulterer i fuldt penetrerende mutationer enten i amyloidprecursorproteinet ( APP) 4 , presenilin 1 ( PSEN1 ) 5 eller presenilin 2 ( PSEN2 )> 6 gener. For det andet kaldes den mere almindelige form for sygdommen (> 90% af AD-tilfælde) "sporadisk" forsinket AD (LOAD) og forekommer oftest hos personer over 65 år eller derover. Det skyldes flere genetiske og miljømæssige risikofaktorer 7 . I LOAD er 4 allelen af apolipoprotein E ( APOE ) genet den største genetiske risikofaktor 8 , 9 . Endvidere er mere end 20 gen loci blevet identificeret ved genomgående associeringsundersøgelser (GWAS) som værende forbundet med risikoen for AD, hvoraf den ene er komplementkomponent (3b / 4b) receptor 1 ( CR1 ) gen 10 , der er placeret på Kromosom 1q32 i en klynge af komplement-relaterede proteiner. CR1 genet koder for komplementreceptor type 1 (CR1) protein, en komponent af komplementaktivitetsregulatorerne.
CR1 (C3b / C4b-receptoren, CD35), et transmembran glycoprotein på ca.Ely 200 kDa 11 binder til C3b, C4b, C3bi, C1q, mannanbindende lectin (MBL) og ficolin-komplementproteiner 12 . Den biologiske funktion af CR1 varierer med celletyperne, hvori den udtrykkes. Hos mennesker findes 90% af den totale cirkulerende CR1 i røde blodlegemer (RBC'er) 13 . Til stede ved overfladen af RBC'er binder CR1 til C3b- eller C4b-opsoniserede mikroorganismer eller immunkomplekser, hvilket letter deres clearance fra omsætning. Komplekser bundet til CR1 overføres faktisk til fagocytter, når RBC'er går gennem leveren og milten 11 , 14 . Ved at begrænse aflejringen af C3b og C4b kan CR1 forhindre overdreven komplementaktivering. Derfor betragtes udtrykket af CR1 på RBC'er som et væsentligt element i beskyttelsen af væv, såsom det cerebrale nervesystem, mod immunkompleksaflejring og de resulterende sygdomme. CR1 på RBC'er er også kendt forSpille en vigtig rolle i patogen infektion 15 , 16 . Derudover er CR1 som en nøglespiller i medfødt immunitet involveret i reguleringen af komplementkaskade og i transport og clearance af immunkomplekser. CR1 udøver denne aktivitet ved at binde C3b- og C4b-fragmenter og dissociere klassiske og alternative konverteraser (dissociation af C2a fra C4b2a-komplekset og dissociation af C3b fra C3bBb-komplekset). Som en cofaktor for plasmaserinproteasefaktor I (FI) hæmmer CR1 de klassiske og alternative komplementveje ved at forøge spaltningen af C4b og C3b ved FI, en egenskab kendt som cofaktoraktivitet (CA) og ved at hæmme C3-amplifikationssløjfen , Der igen forhindrer yderligere komplementaktivering. Rogers og kollegaer beviser, at Ap-peptidet kan binde og aktivere komplementvejen i fravær af antistoffer 17 og foreslå, at Ap-peptidet er clEared fra omsætning via komplementafhængig vedhæftning til CR1 udtrykt på RBCs 18 .
CR1 udviser tre typer af polymorfier: struktur- eller længdepolymorfier, densitetspolymorfier og Knops blodgruppe polymorfier 11 , 19 . Den strukturelle polymorfisme er relateret til en variation i antallet af lange homologe gentagelser (LHR'er) og definerer således fire isoformer. Faktisk er det ekstracellulære domæne af CR1-proteinet sammensat af en serie af gentagende enheder, kaldet korte konsensusreceptater (SCR'er) eller komplementkontrolreceptater (CCP'er). Disse SCR'er er blevet påvist fra komplement-deoxyribonukleinsyren (cDNA), som koder for CR1. SCR'erne er arrangeret i tandemgrupper på syv, kendt som LHR'er. CR1 er indrettet i fire LHR'er betegnet LHR-A, -B, -C og -D, der stammer fra duplikationen af en syv-SCR-enhed 19 , 20 ,21 .
I stigende rækkefølge af frekvens er disse CR1-isoformer bestemt ved Western blot (WB) CR1 * 1 (A / F) (hurtig migrering på gelelektroforese), CR1 * 2 (B / S) (langsom migration på gelelektroforese), CR1 * 3 (C / F ') og CR1 * 4 (D). De to mest almindelige isoformer, CR1 * 1 (A / F) og CR1 * 2 (B / S) består af henholdsvis fire og fem LHR'er, mens CR1 * 3 (C / F`) og CR1 * 4 ) Er sammensat af henholdsvis 3 og 6 LHR'er. Den mest almindelige isoform (CR1 * 1), der består af 30 SCR'er, indeholder tre C4b bindingssteder (SCRs 1-3, 8-10 og 15-17) og to C3b bindingssteder (SCRs 8-10 og 15-17) , Mens SCR 22-28 binder Clq, ficoliner og MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Således indeholder CR1 * 2 et yderligere C3b / C4b bindingssted sammenlignetD til CR1 * 1. Figur 1 illustrerer strukturer, nomenklaturer og molekylvægte af de fire forskellige isoformer af CR1.
Tæthedspolymorfien svarer til en stabil fænotype, der repræsenterer niveauet af konstitutiv ekspression af CR1 på RBC'er. I raske kaukasiske emner har det vist sig, at antallet af CR1-molekyler pr. RBC kan variere med op til en faktor på ti (varierende fra 150 til 1.200 molekyler pr. Celle) 26 . RBC'er af Helgeson-fænotypen har en meget lav CR1-tæthed, som viste sig at være lavere end 150 molekyler pr. Celle 27 , 28 . CR1-densiteten på RBC'er er genetisk forbundet med et autosomalt codominant biallelisk system på CR1- genet, korreleret med en Hin dIII-restriktionsfragmentlængdepolymorfisme (RFLP) 29 . En enkeltpunktsmutation i Intron 27 i CR1-genet, mellem de exoner, der koder for det andetSCR i LHR-D resulterer i dannelsen af et polymorft Hin dIII-sted inden for dette område 30 . Genomisk Hindlll-fragmenter på 7,4 og 6,9 kDa identificere alleler forbundet med høj (H-allel) eller lav (L-allel) CR1 tæthed på RBC henholdsvis. Imidlertid blev der ikke fundet nogen korrelation mellem CR1-densitet på RBC'er og Hin dIII-polymorfier i nogle vestafrikanske populationer 31 , 32 . Mekanismen linking CR1 tæthed regulering til en ikke-kodende HindIII polymorfisme fortsat ukendt. Blandt flere polymorfier er Q981H i SCR16 og P1786R i SCR28 blevet rapporteret at være forbundet med CR1-densiteten på RBCs 30 , 33 .
Knops (KN) polymorfien er ifølge den internationale nomenklatur den 22. blodgruppesystem, der skal indekseres af International Society of Blood Transfusion. Den indeholder 9 antigenspecifikkeFicities udtrykt af CR1 på RBC'er, herunder tre antitetiske antigenpar, KN1 / KN2, KN3 / KN6 og KN4 / KN7 samt 3 isolerede antigener, KN5, KN8, KN9. KN1-, KN3-, KN4- og KN5-antigenerne er højfrekvente antigener af KN-systemet ( dvs. udtrykt i mere end 99% af befolkningen). Imidlertid er denne polymorfis rolle i AD fortsat bestemt 13 .
Protokollen beskrevet i dette værk var designet til at bestemme CR1-længdepolymorfismens genotyper involveret i modtagelighed for adskillige sygdomme, såsom AD, systemisk lupus erythematosus og malaria. Vores metode til bestemmelse af CR1-længdepolymorfisme udnytter antallet af LHR-Bs omfattende CR1-isoformerne og af sekvensforskellene mellem LHR-B og LHR-C ( figur 2 ).
Protocol
Protokollen til indsamling og håndtering af humant blod blev gennemgået og godkendt af det regionale etiske udvalg (CPP Est II), og protokolnummeret er 2011-A00594-37.
BEMÆRK: Følgende protokol beskriver håndtering af humant blod. Følg institutionelle retningslinjer, når du bortskaffer biohazard materiale. Laboratoriesikkerhedsudstyr, som lab coat og handsker, bør bæres. Et flowdiagram der beskriver protokollen vises i figur 3 .
1. Blood and Body Fluid DNA Extraction
- Pipet 20 μl proteinase K (15 μg / μl) i bunden af et 1,5 ml rør.
- Tilsæt 200 μL prøve til 1,5 ml rør. Brug op til 200 μL fuldblod, plasma, serum, buffycoat eller kropsvæsker eller op til 5 x 106 lymfocytter i 200 μl PBS.
- Tilsæt 200 μl lysisbuffer til prøven. Bland ved puls-vortexing i 15 s.
- Inkuber ved 56 ° C i 10 minutter i et vandbad.
- Centrifuger 1,5 ml røret kort for at fjerne dråberne fra lågets inderside.
- Tilsæt 200 μl ethanol (96-100%) til prøven og bland igen ved puls-vortexing i 15 s. Efter blanding, centrifuger kort 1,5 ml røret for at fjerne dråberne fra lågets inderside.
- Anvend forsigtigt blandingen fra trin 1.6 til membrankolonnen (i et 2 ml kollektionsrør). Uden fugtning af fælgen lukkes hætten og centrifugeres ved 6000 xg i 1 min. Anbring membrankolonnen i et rent 2 ml opsamlingsrør og kassér røret, der indeholder filtratet.
- Åbn forsigtigt membrankolonnen og tilsæt 500 μl vaskebuffer 1 uden at væde fælgen. Luk hætten og centrifuger ved 6000 xg i 1 min. Anbring membrankolonnen i et rent 2 ml opsamlingsrør og kassér røret, der indeholder filtratet.
- Åbn membrankolonnen forsigtigt og tilsæt 500 μl vaskebuffer 2 uden at væde thE rand. Luk hætten og centrifuger ved fuld hastighed (20.000 xg) i 3 min.
- Anbring membrankolonnen i et nyt 2 ml opsamlingsrør og kassér opsamlingsrøret med filtratet. Centrifuge ved 20.000 xg i 1 min.
- Anbring membrankolonnen i et rent 1,5 ml rør og kassér opsamlingsrøret, der indeholder filtratet.
- Åbn membrankolonnen forsigtigt og tilsæt 200 μl destilleret vand. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter og centrifuger derefter ved 6000 xg i 1 min.
- Fortsæt til bestemmelsen af DNA-koncentrationstrin eller frys DNA-prøverne ved -20 ° C
2. Bestemmelse af DNA-koncentration
BEMÆRK: Se figur 4 .
- Tryk på 1 for at vælge DNA-tilstand på et spektrofotometer. Vælg en 5 mm sti længde ved hjælp af venstre og højre pil. Vælg en fortyndingsfaktor på 1 ved hjælp af venstre og højre pil.
- Vælg enheden (μg / mL) ved hjælp af thE venstre og højre pile. Vælg en faktor på 50 ved hjælp af venstre og højre pil. Tryk på OK .
- Pipet 10 μl destilleret vand ind i kuvetten. Sæt kuvetten i spektrofotometeret. Tryk på knappen OA / 100% T.
- Pipetter 10 μl af DNA-prøven (1/4 fortynding i destilleret vand) i kuvetten. Sæt kuvetten i spektrofotometeret. Tryk på den grønne knap (læs / start). Bemærk koncentrationen.
- Frys DNA-prøven ved -20 ° C.
3. HRM-PCR-protokol
- Optø DNA-prøverne. Fortynd DNA-prøverne i 1,5 ml rør med vand for at justere dem til en koncentration på 10 ng / μl
BEMÆRK: Det samlede volumen fortyndet DNA skal være mellem 2 μl og 10 μl. - Tør primeropløsningerne. Fortynd primeropløsningerne i 1,5 ml rør med vand for at justere dem til den samme koncentration på 6 μM.
BEMÆRK: Primersekvenserne og reaktionsbetingelserne er tilvejebragt i TStand 1.
Tabel 1: Primers og parametre anvendt i højopløsnings-smelteanalysen.
- Tør HRM-PCR-kit-opløsningerne og bland omhyggeligt ved vortex for at sikre genopretning af alt indhold. Kortvarigt dreje tre hætteglas indeholdende den enzymatiske blanding med DNA-bindende farvestof, MgCl2 og vand i en mikrocentrifuge før åbning dem. Opbevar dem ved stuetemperatur.
- I et 1,5 ml rør ved stuetemperatur fremstilles PCR-blandingen til en 20 μl reaktion ved at tilføje følgende komponenter i nedenstående rækkefølge:
- 10 μl enzymatisk blanding med DNA-bindingsfarvestof;
- 2 pi 25 mM MgCl2;
- 1 μl primer 1, 6 μM (slutkoncentration: 300 nM);
- 1 μl primer 2, 6 μM (slutkoncentration: 300nM); og
- 5 μl vand.
BEMÆRK: For at forberede PCR-blandingen til mere end en reaktion multipliceres mængderne ovenfor med antallet af reaktioner, der skal køres, plus en yderligere reaktion.
- Bland forsigtigt ved vortexing.
- Pipet 19 μl PCR-blanding, fremstillet ovenfor, i hver brønd af en hvid multiwellplade.
- Tilsæt 1 μl koncentrationsjusteret DNA-skabelon, fremstillet i trin 3.1.
BEMÆRK: For kontrolreaktioner skal der altid udføres en negativ kontrol med prøverne. For at forberede en negativ kontrol skal du erstatte template DNA med vand. - Tæt den hvide multiwellplade med forseglingsfolie.
- Placer den hvide multiwellplade i centrifugen og balancér den med en passende modvægt ( dvs. en anden multiwellplade). Centrifuger i 1 minut ved 1.500 xg i en standard swing-bucket centrifuge indeholdende en rotor til multiwell plader med passende adaptere.
- Læg den hvide multiwellplade i HRM-PCR-instrumentet.
- Start HRM-PCR-programmet med følgende PCR-forhold:
Denaturering: 95 ° C i 10 minutter; 1 cyklus.
Amplifikation: 95 ° C i 10 s, 62 ° C i 15s og 72 ° C i 20s; 47 cyklusser.
Smeltekurve: 95 ° C; Rampehastighed: 0,02 ° C / s; 25 opkøb pr. 1 cyklus.
Afkøling: 40 ° C i 30 s; Rampehastighed 2,2 ° C / s; 1 cyklus.
4. HRM analyse til bestemmelse af CR1 længde polymorphism
BEMÆRK: Den beskrevne metode ( Figur 5 ) er specifik for vores software (Se Materialebordet ), selv om andre softwarepakker kan bruges.
- Åbn en genscanning software til at udføre CR1 længde polymorphism scanningsanalyse.
- Åbn eksperimentet indeholdende amplifikationsprogrammet og smeltekurveprogrammet.
- Klik på Sample Editor i modullinjen og vælg derefter SKonserves arbejdsgang .
- Definer egenskaberne af prøverne ( dvs. navn, ukendt eller negativ kontrol).
- Klik på Analyse i modullinjen .
- Vælg Genskanning i listen Opret ny analyse .
- Klik på fanen Normalisering for at normalisere smeltekurverne.
- Klik på fanen Temperaturforskydning for at nulstille temperaturaksen (x-akse) for smeltekurverne.
BEMÆRK: Den nederste graf viser smeltekurver, der både normaliseres og temperaturforskydes. - Klik på knappen Beregn for at analysere resultaterne og bestem grupperingen.
- Klik på fanen Forskellen i diagrammet for at få vist de normaliserede og skiftede smeltekurver og den normaliserede og temperaturforskydte forskel .
Representative Results
Figur 6 A viser fænotypen af CR1-længdepolymorfien af WB. Figur 6 B og C viser kurverne, der opnås under HRM-PCR-analyse, hvilket gør det muligt at bestemme CR1-længdepolymorfien. Analyse af fusionskurverne ved anvendelse af softwaren efter højopløsningssmeltningen af de PCR-afledte amplikoner fra det genomiske DNA hos personer med forskellige CR1-isoformer frembringer kurver, der diskriminerer forsøgspersoner i overensstemmelse med deres allotype CR1-ekspressionsfænotyper.
Figur 6 B viser en første præsentationsform, kaldet "Normaliseret og Shifted Smeltingskurver", mens Figur 6 C viser en anden præsentationsform, kaldet "Normaliseret og Temp-Shifted Difference Plot."
figur 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Og (CR1 * 2, CR1 * 4). Dette muliggør genotypen af CR1-længdepolymorfien ved anvendelse af denne nye molekylærbiologi metode.
Figur 1: Skematisk repræsentation af strukturen og polymorfierne af komplementreceptor 1-proteinet. Hver kort konsensusreaktion (SCR) eller komplementstyringsprotein (CCP) er repræsenteret ved en cirkel. SCR'erne er grupperet i en gentagne, højere ordens strukturer kaldet LHR'er. Fra det ekstracellulære domæne til cellemembranen er LHR'erne: LHR-A, -B, -C, -D og -S (supplerende eller yderligere LHR). I den mest almindelige CR1 isoform(CR1 * 1), er C4b / decay-accelerationsaktivitets (DAA) bindingsstedet placeret ved LHR-A (SCRs 1-3, grønne cirkler), C3b / C4b / cofactoraktivitets (CA) bindingsstedet er placeret i 3 N-terminale SCR'er af LHR-B (SCR 8-10, røde cirkler) og LHR-C (SCRs 15-17, lilla cirkler) og bindingsstedet for C1q / MBL og ficolin findes i LHR-D (SCRs 22-28, blå cirkler). De homologe strukturer er farvet identisk. CR1 * 2 (S) isoformen præsenterer en yderligere LHR (LHR-S) og indeholder således et yderligere C3b / C4b bindingssted. KDa, kilodalton. NRC, ikke-reducerede betingelser. RC, reducerede betingelser. TM, transmembrane domæne. Denne figur blev tilpasset fra Brouwers et al. 36 med tilladelse fra Nature Publishing Group. Klik her for at se en større version af denne figur.
"/files/ftp_upload/56012/56012fig2.jpg" />
Figur 2 : Skematisk repræsentation af CR1-isoformstrukturen med sekvensampliconpositioner opnået ved HRM-PCR. Hver boks repræsenterer en SCR. SCR'erne er grupperet i LHR'er: LHR-A, -B, -C og -D. De homologe strukturer er farvet identisk. CR1 * 2 og CR1 * 4 isoformerne præsenterer yderligere LHR'er (LHR-B) og indeholder således et yderligere ampliconareal (amplicon B, i rødt). CR1 * 3 mangler LHR-B og indeholder mindre ampliconområde (mangler amplicon B). Nucleotidforskelle mellem amplicon B (196 bp) og den invariante amplicon (197 bp) er afbildet i henholdsvis rød og blå. Forskelle i forholdet: (amplicon B, i rød / invariant amplicon, i blåt) mellem hver CR1 isoform bestemmes af HRM-PCR, hvilket muliggør genotyping. CN3- og CN3re-primer-sekvenserne er understreget. TM, transmembrane domæne. CYT, cytoplasmatisk hale.Pg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flowchart for protokollen til genotypning af CR1-længdepolymorfien fra humane blodprøver. Indsamle en human DNA-prøve. Ekstraher DNA'et for at opnå en DNA-blodprøve. Bestem DNA-koncentrationen og fortynd for at opnå DNA-koncentrationen ved 10 ng / μl. Brug HRM-PCR til opnåelse af CR1-længdepolymorfismens genotype. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 : Skærmbilleder af spektrofotometeret os Ed for at bestemme DNA-koncentrationen. Tryk på 1 ( A ) for at vælge DNA-tilstand på spektrofotometeret. Vælg en 5 mm sti længde ( B ) ved hjælp af venstre og højre pil ( C ). Vælg enheden (μg / mL) ( D ) ved hjælp af venstre og højre pil ( C ). Vælg fortyndingsfaktor 1 ( E ) ved hjælp af venstre og højre pil ( C ). Vælg en faktor på 50 ( F ) ved hjælp af venstre og højre pil. Tryk på OK ( G ). Pipet 10 μl destilleret vand ind i kuvetten. Sæt kuvetten i spektrofotometeret ( H ). Tryk på OA / 100% T knappen ( I ). Pipetter 10 μL DNA-prøve (1/4 fortynding i destilleret vand) i kuvetten. Sæt kuvetten i spektrofotometeret ( K ). Tryk på den grønne knap (læs / start) ( L ). Bemærk koncentrationen ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Skærmbilleder af den grafiske grænseflade af softwaren, der anvendes i trin 4 i protokollen. ( A ) Åbn genscanningsprogrammet. ( B ) Forstærkningsprogram og smeltekurveprogram. ( C ) Klik på Sample Editor i modullinjen . ( D ) Vælg scanning . ( E ) Definer egenskaberne af prøverne. ( F ) Klik på Analyse i modullinjen . ( G ) Klik på fanen Normalisering for at normalisere smeltekurverne. ( H ) Klik på fanebladet Temperaturforskydning for at vise smeltekurverne, der begge erNormaliseret og temperaturforskydet. ( I ) Klik på knappen Beregn for at analysere resultaterne og bestem grupperingen. ( J ) Klik på fanebladet Difference plot for at få vist de normaliserede og skiftede smeltekurver og den normaliserede og temperaturforskydte forskellen . ( K ) Farvet gruppering af prøverne i overensstemmelse med CR1-længdegenotyperne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fenotyping af CR1-længdepolymorfierne observeret i WB og deres tilsvarende profilkurver opnået ved HRM-PCR. ( A ) Phenotyping af CR1-længdepolymorfierne ved anvendelse af WB. ( B C ) Genotyping af CR1-længdepolymorfier ved anvendelse af HRM-PCR-analyse. HRM-kurveanalyse af PCR-amplikoner opnået fra det genomiske DNA hos forsøgspersoner, der udviser forskellige CR1-isoformer, førte til identifikation af specifikke kurveprofiler: (CR1 * 3, CR1 * 1) (lilla); (CR1 * 1, CR1 * 2) (blå); CR1 * 1 (grøn); CR1 * 2 (rød); Og (CR1 * 2, CR1 * 4) (grå). Disse svarer til CR1-længdepolymorfisme alleler. Som vist ved de to fremstillingsformer - "Normaliserede og Shifted Smeltingskurver" (B) og "Normaliseret og Temp-Shifted Difference Plot" (C) - Kurveprofilerne fordeles i henhold til (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; Og (CR1 * 2, CR1 * 4) grupper. Denne figur blev tilpasset fra Mahmoudi et al. 38 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Her beskriver vi en bredt tilgængelig metode til at studere CR1-længdepolymorfier. Molekylbiologiteknikkerne til amplifikation eller segmental hybridisering har aldrig været i stand til at give tilfredsstillende resultater, der tillader bestemmelse af CR1-længdepolymorfier hos alle individer. Dette skyldes den gentagne struktur af CR1 genet ( dvs. de meget gentagne SCR'er af CR1). Den her beskrevne molekylærbiologimetode udnytter den kvantitative fordeling af LHR-B i CR1-molekylet. CR1-molekylet indbefatter n LHR-B-domæner, hvor n er et tal mellem 0 og 3 og kun et LHR-C-domæne som beskrevet og illustreret i figur 2 . Kvantitativ domæne B-detektion gør det muligt at diskriminere fuldstændigt et yderligere eller manglende domæne B.
Fra det ekstraherede genetiske materiale amplificeres et første DNA-fragment fra LHR-B ved hjælp af PCR under anvendelse af et enkelt par specifikke primere, repræsentereTing en karakteristisk variant af LHR-B kaldet "variant amplicon B." Et andet DNA-fragment, der kaldes "invariant amplicon" og tilhører LHR-C, amplificeres også. Dette andet DNA-fragment er et fragment af LHR-C, men et andet invariant fragment af LHR-A eller -D kunne også anvendes.
De to DNA-fragmenter, variant amplicon B og det invariante amplicon amplificeres af de samme primere og udviser fem forskelle i nukleotidsekvenser. Denne karakteristik gør det muligt i det efterfølgende trin at bestemme antallet af variant amplicon B og antallet af invariant ampliconer ved anvendelse af et kvantitativt molekylærbiologi værktøj, HRM, som var tilpasset til dette formål. Forholdet mellem antallet af amplicon B og det invariante amplicon (forhold: amplicon B / invariant amplicon) varierer afhængigt af længden af CR1 molekylet. Faktisk viser CR1 * 4 3 amplicon B-enheder til 1 invariant amplicon, CR1 * 2 viser 2 amplicon B-enheder til 1 invariant amplicon, CR1 * 1 viser 1 amplicon B til 1 invariant amplicon, og CR1 * 3 viser 0 amplicon B enheder til 1 invariant amplicon ( Figur 2 ). Således muliggør denne HRM-PCR-metode genotypen af CR1-længdepolymorfismen.
Ikke desto mindre kræver denne teknik i begyndelsen af undersøgelsen anvendelse af referencemedier, hvis CR1-fænotyper allerede er kendt ( dvs. tidligere etableret af WB) for at kunne etablere genotypen af CR1 i overensstemmelse med referenceprofilen for de opnåede kurver Ved HRM-PCR. To typer repræsentation, nemlig "Normaliserede og Shifted Smeltkurver" og "Normaliseret og Temp-Shifted Difference Plot" er tilgængelige. De viser forskellige grupper af kurveprofiler, der er farvet i overensstemmelse med CR1-længdepolymorfismefænotypen opnået ved WB ( figur 6 ). Fra trin "Normaliseret og Shifted Smeltingskurver" gør vores metode det muligt at diskriminere thE forskellige kurvkurver svarende til isoformerne af CR1, grupperet efter farve. Men den "Normaliserede og Temp Shifted Difference Plot", som svarer til en anden matematisk repræsentation, muliggør en lettere visualisering af de forskellige kurver. Selvom producentens software blev anvendt rutinemæssigt i dette studie, kunne anden software (som uANALYSE) bruges som et dataudvindingsprogram til kurveanalyse.
Hidtil er WB-analyseteknikken den oprindelige teknik, som muliggør identifikation af de forskellige CR1-længdepolymorfier på proteinets niveau. Denne teknik har imidlertid en række ulemper. Især kan proteinanalyse af WB kun udføres efter udvinding af cellemembraner. Som følge heraf er det komplekst og meget tidskrævende. Desuden kræver denne teknik at opnå en frisk blodprøve under passende betingelser ved begyndelsen af proceduren for at opnå nyttig resÜLTS. Tværtimod gør HRM-PCR udført på DNA det muligt at anvende lige tørblodspots eller prøver efter langtidsopbevaring. HMR-PCR kræver et specialiseret DNA smelteinstrument, enten et dedikeret instrument eller en HMR-kapacitet termocykler med HRM software. SNP-detektion er afhængig af flere faktorer: i) SNP'er inkluderet i store PCR-fragmenter er vanskeligere at detektere end de samme SNP'er i små PCR-fragmenter; Ii) SNP'er, der tilhører klasse III og IV, er vanskeligere at påvise end klasserne I og II 34 ; Og iii) SNP'er, der flankeres af nærmeste nabosidssymmetri ( f.eks. 5'-G (G / C) C-3 ') kan ikke sorteres ved smeltning uanset opløsningsmakten på HMR-platformen. Det kan være nyttigt at teste de forudsagte PCR-fragmenter indeholdende SNP af interesse med uMELT-softwaren 35 for at vurdere validiteten af analysen. Endelig er HMR-PCR en analog metode, hvilket betyder at ligheden mellem smeltekurverne væddesEn reference og en skabelon betyder ikke nødvendigvis, at skabelon-sekvensen er identisk med referencen, da skabelon-sekvensen kan være forskellig fra referencen, men termodynamisk ækvivalent. Disse begrænsninger gælder imidlertid ikke for den her beskrevne fremgangsmåde, som er baseret på smelten af en blanding af ampliconer, der adskiller sig i form af 5 nukleotidsekvenser.
Desuden har teknikken beskrevet her, baseret på analysen af HRM, mange fordele. For det første bestemmes CR1-længdepolymorfierne hurtigere, da resultaterne opnås i ca. 2 timer, når ekstraktionen af det genetiske materiale er blevet udført. Omvendt kræver traditionelle biokemiske teknikker baseret på WB-proteinanalyse trin, der er relativt lange: elektroforese af cellemembranekstrakter gennem en acrylamidgel, et trin til overførsel af proteiner til en nitrocellulose- eller polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) -membran og et trin for at identificere Isoformer afCR1 molekyle ved immunokemiluminescens. For det andet har HRM-PCR-teknikken også den fordel, at det ikke er for dyrt, hvilket er særligt vigtigt for en metode, som sandsynligvis vil blive anvendt på mange individer ( dvs. i stor grad) for at bestemme deres modtagelighed for udviklingen af patologier som Alzheimers sygdom, Lupus eller malaria.
For nylig har vi og andre vist, at CR1 * 2 isoformen, som indeholder et yderligere C3b / C4b bindingssted, var associeret med AD 36 , 37 , 38 . I vores tidligere offentliggjorte undersøgelse var CR1-længdepolymorfierne på niveauet af genet og proteinet konsistente hos 98,9% af forsøgspersonerne 38 . De uoverensstemmende resultater opnået ved sammenligning af længdepolymorfier opnået ved HRM-PCR med dem opnået ved WB svarede til forsøgspersoner med en (CR1 * 1, CR1 * 2) genotypeprofil bestemt ved HRM (gen), men exPresser kun CR1 * 1 isoformen på overfladen af erythrocyten ifølge WB (protein). I vores undersøgelse var manglen på CR1 * 2-isoform-ekspression (personer med en tavs allel) reproducerbar, når WB blev udført med en længere eksponeringstid og kunne forklares ved eksistensen af et tavt CR1-allel (CR1 * 2), beskrevet I litteraturen af Helgeson 39 . Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser af større populationer for at understøtte denne hypotese.
Det skal bemærkes, at private SNP'er (SNP'er, der kun forekommer i en lille familiegruppe eller endog i et enkelt individ) førte til forskellige kurveprofiler, der skal dechifreres ved brug af referencefænotype-bestemmelse (WB), men det kan ikke forveksles med den kanoniske profil for at undgå Enhver fejlfortolkning af CR1-længdepolymorfismens genotype.
Disclosures
Forfatterne er opfinderne af et patent ejet af University of Reims Champagne-Ardenne (URCA) (patent nummer WO 2015166194)
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmerne af Plateforme Régionale de Biologie Innovante, personale hos Immunologisk Institut og personale hos Institut for Inden Medicin og Geriatri, der har bidraget til at optimere og validere protokollen. Dette arbejde blev finansieret af Reims Universitetssygehus (bevillingsnummer AOL11UF9156). Vi takker også Fiona Ecarnot (EA3920, Universitetshospital Besancon, Frankrig) til redaktionel bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab coat | protection | ||
| SensiCareIce powder-free Nitrile Exam gloves | Medline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA | 486802 | sample protection |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 0,5-10µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000024 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 20-100µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000059 | sample pipetting |
| Eppendorf Reference 2 pipette, 100-1000µL | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4920000083 | sample pipetting |
| TipOne 10µL Graduated, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1121-3810 | sample pipetting |
| TipOne 1-100µL bevelled, filter tip | Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, Germany | S1120-1840 | sample pipetting |
| ART 1000E Barrier Tip | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 2079E | sample pipetting |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 0030120086 | mix |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USA | SI-0236 | mix |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 51306 | DNA Extraction |
| Buffer AL | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19075 | Lysis buffer |
| QIAamp Mini Spin Column | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 1011706 | DNA binding |
| Buffer AW1 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19081 | Wash buffer |
| Buffer AW2 | Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, France | 19072 | Wash buffer |
| Biowave DNA spectrophotometer | Biochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, England | 80-3004-70 | DNA concentration |
| Mikro 200 centrifuge | Hettich Zentrifugen, D-78532, Germany | 0002020-02-00 | centrifugation |
| Multipette E3 | Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France | 4987000010 | distribution |
| Light Cycler 480 multiwell plate 96, white | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04729692001 | reaction place |
| Light Cycler 480 sealing foil | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04429757001 | coverage |
| Heraeus Megafuge 11R centrifuge | Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France | 75004412 | centrifugation |
| LightCycler 480 Instrument II, 96-well | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 05015278001 | high resolution melting polymerase chain reaction |
| LightCycler 480 High Resolution Melting Master | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | 04909631001 | reaction reagents |
| light cycler 480 SW 1.5.1 software | Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germany | software used for HRM PCR CR1 polymorphism data analysis | |
| CN3 primer: 5'ggccttagacttctcctgc 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent | |
| CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3' | Eurogentec Biologics Division, B- 4102 Seraing, Belgium | reaction reagent |
References
- Prince, M., et al. World Alzheimer Report 2015, The Global Impact of Dementia: An analysis of prevalence, incidence, cost and trends. Alzheimer's Disease International. , (2015).
- McKhann, G. M., et al. The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease: recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 7 (3), 263-269 (2011).
- Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., Hyman, B. T.
- Goate, A., et al. Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature. 349 (6311), 704-706 (1991).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature. 375 (6534), 754-760 (1995).
- Levy-Lahad, E., et al. A familial Alzheimer's disease locus on chromosome 1. Science. 269 (5226), 970-973 (1995).
- Mayeux, R., Stern, Y. Epidemiology of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (8), (2012).
- Corder, E. H., et al. Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. Science. 261 (5123), 921-923 (1993).
- Yu, J. T., Tan, L., Hardy, J. Apolipoprotein E in Alzheimer's disease: an update. Annu Rev Neurosci. 37, 79-100 (2014).
- Lambert, J. C., et al. Genome-wide association study identifies variants at CLU and CR1 associated with Alzheimer's disease. Nat Genet. 41 (10), 1094-1099 (2009).
- Liu, D., Niu, Z. X. The structure, genetic polymorphisms, expression and biological functions of complement receptor type 1 (CR1/CD35). Immunopharmacol Immunotoxicol. 31 (4), 524-535 (2009).
- Jacquet, M., et al. Deciphering complement receptor type 1 interactions with recognition proteins of the lectin complement pathway. J Immunol. 190 (7), 3721-3731 (2013).
- Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
- Cosio, F. G., Shen, X. P., Birmingham, D. J., Van Aman, M., Hebert, L. A. Evaluation of the mechanisms responsible for the reduction in erythrocyte complement receptors when immune complexes form in vivo in primates. J Immunol. 145 (12), 4198-4206 (1990).
- Krych-Goldberg, M., Moulds, J. M., Atkinson, J. P. Human complement receptor type 1 (CR1) binds to a major malarial adhesin. Trends Mol Med. 8 (11), 531-537 (2002).
- Cohen, J. H., Geffriaud, C., Caudwell, V., Kazatchkine, M. D. Genetic analysis of CR1 (the C3b complement receptor, CD35) expression on erythrocytes of HIV-infected individuals. Aids. 3 (6), 397-399 (1989).
- Rogers, J., et al. Complement activation by beta-amyloid in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (21), 10016-10020 (1992).
- Rogers, J., et al. Peripheral clearance of amyloid beta peptide by complement C3-dependent adherence to erythrocytes. Neurobiol Aging. 27 (12), 1733-1739 (2006).
- Krych-Goldberg, M., Atkinson, J. P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev. 180, 112-122 (2001).
- Klickstein, L. B., et al. Human C3b/C4b receptor (CR1). Demonstration of long homologous repeating domains that are composed of the short consensus repeats characteristics of C3/C4 binding proteins. J Exp Med. 165 (4), 1095-1112 (1987).
- Hourcade, D., Miesner, D. R., Atkinson, J. P., Holers, V. M. Identification of an alternative polyadenylation site in the human C3b/C4b receptor (complement receptor type 1) transcriptional unit and prediction of a secreted form of complement receptor type 1. J Exp Med. 168 (4), 1255-1270 (1988).
- Krych, M., Hourcade, D., Atkinson, J. P. Sites within the complement C3b/C4b receptor important for the specificity of ligand binding. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (10), 4353-4357 (1991).
- Krych-Goldberg, M., et al. Decay accelerating activity of complement receptor type 1 (CD35). Two active sites are required for dissociating C5 convertases. J Biol Chem. 274 (44), 31160-31168 (1999).
- Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
- Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. J Exp Med. 192 (12), 1797-1808 (2000).
- Cornillet, P., Philbert, F., Kazatchkine, M. D., Cohen, J. H. Genomic determination of the CR1 (CD35) density polymorphism on erythrocytes using polymerase chain reaction amplification and HindIII restriction enzyme digestion. J Immunol Methods. 136 (2), 193-197 (1991).
- Moulds, J. M., Nickells, M. W., Moulds, J. J., Brown, M. C., Atkinson, J. P. The C3b/C4b receptor is recognized by the Knops, McCoy, Swain-langley, and York blood group antisera. J Exp Med. 173 (5), 1159-1163 (1991).
- Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sang. 62 (4), 230-235 (1992).
- Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. J Exp Med. 164 (1), 50-59 (1986).
- Wong, W. W., et al. Structure of the human CR1 gene. Molecular basis of the structural and quantitative polymorphisms and identification of a new CR1-like allele. J Exp Med. 169 (3), 847-863 (1989).
- Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in Caucasian and African American populations. Clin Immunol Immunopathol. 87 (2), 176-183 (1998).
- Rowe, J. A., et al. Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans; implications for studies on malaria susceptibility. Genes Immun. 3 (8), 497-500 (2002).
- Birmingham, D. J., et al. A polymorphism in the type one complement receptor (CR1) involves an additional cysteine within the C3b/C4b binding domain that inhibits ligand binding. Mol Immunol. 44 (14), 3510-3516 (2007).
- Venter, J. C., et al. The sequence of the human genome. Science. 291 (5507), 1304-1351 (2001).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Brouwers, N., et al. Alzheimer risk associated with a copy number variation in the complement receptor 1 increasing C3b/C4b binding sites. Mol Psychiatry. 17 (2), 223-233 (2012).
- Hazrati, L. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2945-2949 (2012).
- Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiol. Aging. 36, 1712-1765 (2015).
- Helgeson, M., Swanson, J., Polesky, H. F. Knops-Helgeson (Kna), a high-frequency erythrocyte antigen. Transfusion. 10 (3), 137-138 (1970).
