Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56016
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל עבור דיכאון חמור. ECS מעוררת באופן גלובלי פעילות ההיפוקמפוס, המוביל synaptogenesis פלסטיות סינפטית. כאן, אנו מתארים שיטות עבור ה-ECS אינדוקציה בחולדות, fractionation subcellular של hippocampi שלהם כדי לבחון שינויים התקף-induced חלבונים סינפטיים.

Abstract

חשמל התקף (ECS) הוא מודל חיה ניסיוני של נזעי חשמל, הטיפול היעיל ביותר לטיפול בדיכאון חמור. ECS המניע מוכללת ויהיו clonic טוניקה עם התמותה נמוכה ומוות עצביים, הוא מודל נפוץ לתרופות אנטי-אפילפטי מסך. כאן, אנו מתארים שיטה אינדוקציה ECS ב אשר מועבר זרם 55-mA קצרה עבור 0.5 s כדי זכר חולדות 200-250 גר' במשקל באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ. גירוי דו צדדיים כאלה המיוצרים שלב 4-5 ויהיו clonic שנמשכה בערך 10 s. לאחר הפסקת ECS אקוטי או כרוני, שאם רוב חולדות משוחזרים בהתנהגותו לבין "אין תפיסה" חולדות. כי ECS מתרוממת באופן גלובלי פעילות מוחית, זה גם שימש כדי לבחון שינויים תלויי-פעילות של חלבונים סינפטיים והשפעתם על כוח סינפטית באמצעות מספר שיטות. בפרט, fractionation subcellular של צפיפות postsynaptic (PSD) בשילוב עם סופג המערבי מאפשר הקביעה כמותית של השפע של חלבונים סינפטיים-מבנה סינפטית מיוחד זה. בניגוד שיטה fractionation הקודם דורש כמות גדולה של המוח מכרסמים, נתאר כאן שיטה fractionation בקנה מידה קטן כדי לבודד את PSD מ hippocampi של עכברוש בודד, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות. באמצעות שיטה זו, אנו מראים כי השבר PSD מבודד מכיל חלבונים postsynaptic ממברנה, כולל PSD95, GluN2B ו- GluA2. סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין נכללו השבר PSD, הוכחת בידוד PSD מוצלחת. יתר על כן, ECS כרונית ירד GluN2B ביטוי PSD, המציין כי שיטת fractionation שלנו PSD בקנה מידה קטן יכול להיות מיושם כדי לזהות את השינויים בחלבונים PSD בהיפוקמפוס מעכברוש יחיד לאחר טיפולים גנטיים, תרופתי או מכני .

Introduction

נזעי חשמל שימש לטיפול בחולים עם הפרעות דיכאון, כולל דיכאון עמיד לתרופות, דיכאון ביפולרי, פרקינסון מחלות של סכיזופרניה1,2. בטיפול זה, התקף נוצר על ידי גירוי חשמלי מועברים לראש המטופלים ומורדמת באמצעות epicranial אלקטרודות1,2,3. ניהול חוזרות של ECS כבר תועלת קלינית הפרעות דיכאון עמיד לתרופות-1,2,3. עם זאת, המכניזם המדויק שבבסיס יעילותם לטווח ארוך של האפקט נוגדות דיכאון אצל בני אדם נותר חמקמק. ECS במודל חיה של נזעי חשמל ומשמש באופן נרחב כדי לחקור את המנגנון הטיפולי. בחולדות, ECS אקוטי והן טיפול כרוני ECS לקדם נוירוג'נסיס למבוגרים ב hippocampi ולארגן מחדש את4,רשת עצבית5, שזה סביר לתרום לשיפור איכות על גמישות קוגניטיבית. יתר על כן, הרמה הכללית של פעילות מוחית על ידי ה-ECS הפיצולים השפע של תעתיקים, כגון מוח נגזר פקטור neurotropic6וחלבונים מרובות, כולל metabotropic גלוטמט קולטן 17 ו את N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) סוג גלוטמט קולטן subunits7. שינויים אלה מעורבים תיווכה שינוי לטווח ארוך של מספר סינפסה, מבנה והעוצמה ב8,7,9ההיפוקמפוס.

ECS דגמים, גירוי חשמלי מועבר מכרסמים באמצעות אלקטרודות stereotaxically מושתל, אלקטרודות הקרנית או אלקטרודות האוזן לעורר מוכללת ויהיו clonic טוניקה10,11. Stereotaxic השרשת אלקטרודות כרוך ניתוח מוח ודורש זמן ניכר לשיפור מיומנויות ניתוח של הנסיין כדי למזער את הפגיעה. אלקטרודות הקרנית פולשני פחות יכול לגרום שחיקה הקרנית ויובש, דורש הרדמה. השימוש של האוזן-קליפ אלקטרודות עוקף מגבלות אלה כי הם יכולים לשמש על מכרסמים ללא ניתוח או הרדמה, לגרום פגיעה מינימלית. אכן, אנחנו נמצא כי חולדות נמסור ער הנוכחי באמצעות אלקטרודות האוזן-קליפ אמינה גורם ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5, הפיצולים חלבונים סינפטיים שלהם hippocampi10.

כדי לבחון את השפע ECS-induced של חלבונים סינפטיים באזורי מוח מסוימים המכרסמים, חשוב לבחור את שיטות נסיוניות המתאימים ביותר שלהם זיהוי, כימות. Fractionation subcellular של המוח מאפשר הבידוד גולמי של חלבונים מסיסים cytosolic; קרום חלבונים; אברון-גבולות חלבונים; ואפילו חלבונים קונסטרוקציות subcellular מיוחדים, כגון PSD12,13,14. PSD הוא תחום subcellular צפוף ומאורגן היטב בנוירונים שבו חלבונים סינפטיים הם מרוכז בבית, ליד ה13,12,ממברנה postsynaptic15. בידודו של PSD שימושית לצורך המחקר של חלבונים סינפטיים מועשר ב PSD, מאז שינויים דינמיים שפע ומתפקדים של רצפטורים גלוטמט postsynaptic פיגומים חלבונים, חלבונים התמרה חושית אות ב ה PSD12 , 15 , 16 , 17 נמצאים בקורלציה עם פלסטיות סינפטית, את synaptopathy נצפו הפרעות נוירולוגיות מספר17,18. בשיטת subcellular fractionation הקודם כדי לטהר את PSD מעורב הבידוד של השבר דטרגנט-לא מסיס מן השבר ממברנה גולמי של המוח על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית סוכרוז מעברי צבע14, 19. האתגר העיקרי בשיטה מסורתית זו הוא כי זה דורש כמויות גדולות של מכרסם המוח14,19. הכנה של 10-20 מכרסמים כדי לבודד את השבר PSD לכל טיפול דורש השקעה זמן ועלות נרחב, והוא לא ממש ריאלי. אם ישנם טיפולים רבים.

כדי להתגבר על האתגר הזה, לנו יש להתאים שיטה פשוטה יותר ישירות מבודד השבר PSD, ללא סוכרוז צנטריפוגה הדרגתיות20,21, ומתוקנים שזה יהיה ישים PSD בידוד מ hippocampi של עכברוש בודד המוח. שיטת fractionation בקנה מידה קטן שלנו PSD התשואות על 30-50 µg של החלבונים PSD של hippocampi 2, מספיק לשימוש מספר מבחני הביוכימי, כולל immunoprecipitation, סופג המערבי. סופג המערבי מדגים את ההצלחה של השיטה שלנו עבור בידוד של PSD חושף את העשרת של צפיפות postsynaptic חלבון 95 (PSD-95) להדרה של סמן presynaptic synaptophysin, חלבון מסיס cytoplasmic α-טובולין. שלנו ECS אינדוקציה ושיטות בקנה מידה קטן PSD fractionation בקלות לצורכי אזורים במוח מכרסמים אחרים ומספקים דרך יחסית פשוטה ואמינה כדי להעריך את ההשפעות של ECS על הביטוי של חלבונים PSD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני כולל נושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ב אוניברסיטת אילינוי באורבנה-שמפיין.

1. שמירה על מושבה עכברוש

  1. מתרבים חולדות ספראג-Dawley (ראה טבלה של חומרים) ולתחזק אותם בתנאים סטנדרטיים עם 12-h בהירה-כהה מחזור וגישה ad libitum מזון ומים.
  2. לגמול את הגורים עכברוש ביום כמחנכת (P) 28, אותם בקבוצות של 2-4 הארנבונים מאותה זכר או נקבה.
  3. סמן את הזנב של חולדות זכרים עם סמן קבוע רעיל שחור עבור זיהוי.
  4. שוקל לעכברושים הזכר 3 פעמים בשבוע ולהקליט את bodyweights שלהם.

2. הכנת מכונת ECS

  1. ב- 7:30 בבוקר, לחטא את הספסל בחדר הכנת בעלי חיים ולמקם מכונת ECS (מחולל הפעימה) על הספסל.
  2. המקום עכברוש גברים בודדים במשקל של 200-250 גרם בתוך כלוב נקי, ריק עם מכסה. חזור על זה עבור כל זכר העכברושים שיתייחסו אליו ECS אינדוקציה. תן את החולדות habituate למשך 30 דקות.
  3. בעת החולדות הם habituating בכלובים שלהם, להגדיר גנרטור הדופק עבור ה-ECS אינדוקציה על תדירות פולסים בשנייה 100, רוחב הדופק של 0.5 ms, משך הלם של 0.5 s, זרם של 55 mA (איור 1א').
  4. הכן את הגנרטור דופק על ידי ללחוץ על הכפתור "RESET" ולהבטיח כי לחצן "מוכן" מואר. ודא כי הקליפים האוזן לא צורפו גנרטור דופק ולאחר מכן הקש על כפתור "הלם" לכמה שניות.
    הערה: בשלב זה, הגנרטור הדופק הוא מוכן ECS אינדוקציה.
  5. חבר את הקליפים האוזן הגנרטור דופק.

3. אינדוקציה של ECS חריפה

הערה: ראה איור 1ב', בראש החלונית.

  1. להרטיב את הקליפים האוזן עם סליין סטרילי ולהבטיח כי הם רוויים.
  2. רטוב האוזניים של חולדה עם סליין סטרילי על ידי ליפוף אותם בתוך תמיסת מלח ספוג גזה. פעם אחת הם רטובים, להסיר את הגזה.
  3. לצרף קליפ אחד לכל אוזן, עמדה מעבר הלהקה הסחוס המרכזי.
  4. לאשר על המכונה ECS לולאה נכון מוקמת. אם לא, הודעת שגיאה או קריאה של "1" יופיע על המכונה.
  5. לובש כפפה עבה, -מטאל בעוד אתה מחזיק את החולדה בעדינות ביד בכפפה, לחץ על לחצן "הלם" לכמה שניות ולשחרר לאט האחיזה על החולדה לבחון את ההתקף. עבור המזויף "אין תפיסה" (NS) לשלוט, להתמודד עם החולדה באופן זהה אך אינם מספקים הנוכחי.
  6. נתק את הקליפים האוזן כמו קלונוס מתחיל ולהקליט את התנהגות פרכוס בהתאם מידה של ראסין המתוקן22 הכולל "הפה ותנועות פנים" (שלב 1), "ראש מהנהן" (שלב 2), "forelimb קלונוס" (שלב 3), "לגידול עם קלונוס forelimb" (שלב 4), ו "לגידול ונופל עם קלונוס forelimb" (שלב 5). ההתקף אמור להספיק כ 10 s; להקליט את משך ההתקף באמצעות שעון עצר.
  7. בעקבות סיום ההתקף, להחזיר את החולדה בכלוב בבית. לפקח על העכברוש עבור עוד 5 דקות לוודא על החלמתו של העכברוש של ההתקפים. לשמור את זה שוכן ביחידים בכלוב ולחזור הכלוב לחדר ההתאוששות.
  8. חזור על אינדוקציה ECS על החולדה הבא.
  9. לפקח על החולדות ברחבי השארית של היום, לפחות פעם אחת בבוקר, פעם אחת בצהריים למחרת עד שהם מורדמים לניסויים.
    הערה: השיטה אינדוקציה ECS עלול להוביל סימנים קליניים כמו אפקט לוואי נלווים, אשר דורש תשומת לב. לדוגמה, פרוטוקול אינדוקציה ECS יכול לגרום התקפים יותר 15 s ולגרום מיותרים מצוקה לעכברושים. במקרה זה, לסיים את ההתקף באמצעות דיאזפם (10 מ"ג/ק"ג, i.p.) או פנטוברביטל (25-30 מ"ג/ק"ג, i.p.). אם החולדות לפתח מצוקה נשימתית או חריגות התנהגותית חמורה בעקבות תפיסה הפסקת, המתת חסד אותם על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני ואחריו עריפת ראש.

4. אינדוקציה של ECS כרונית

הערה: ראה איור 1B, החלונית התחתונה.

  1. זירוז ECS אחת ליום במקביל בבוקר כפי שתואר בשלבים 1-3 לעיל, במשך שבעה ימים רצופים.
  2. צג העכברושים פעמיים ביום לאחר קבלתן לבית שלהם בכלובים.

5. המגון ו- Fractionation של עכברוש Hippocampi

הערה: ראה באיור 2.

  1. הכנת מאגר המגון טריים (פתרון A) המכיל סוכרוז 320 מ"מ, 5 מ"מ נתרן רב-תכליתי, 1 מ"מ EDTA, 10 מ מ HEPES pH 7.4, 200 ננומטר okadaic חומצה, מעכבי פרוטאז. מסנן-לעקר את המאגר באמצעות מסננים עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.22 עבור סינון ואקום ומניחים אותו על קרח.
  2. בזמן נתון הצבע בעקבות ECS חריפה או כרונית ECS (איור 1), המתת חסד העכברוש באמצעות אינהלציה2 CO למשך 5-10 דקות, ואחריו עריפה באמצעות גיליוטינה.
  3. מסירים את המוח ומנתחים את hippocampi בצלחת מתכת המוטלות על קרח, כפי שתואר לעיל23,24.
  4. מקום שני hippocampi של עכבר אחד על תרביות רקמה 30 מ מ צלחת, מינצ אותם לחתיכות קטנות בעזרת מספריים.
  5. להעביר את hippocampi טחון מהמגן זכוכית ידני באמצעות פיפטה של 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל המאגר הקר המגון (פתרון A, שלב 5.1). הכנס כבעלי עגול מהמגן זכוכית. בעוד מהמגן זכוכית על קרח, בעדינות ובזהירות קו למעלה ולמטה על איחדו 10 - 15 פעמים עבור 1 דקות, עד חתיכות קטנות של רקמות בהיפוקמפוס להיעלם.
  6. להעביר את homogenate צינור microcentrifuge 1.7 mL באמצעות פיפטה של 1-mL, centrifuge את homogenate ב g 800 x 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע postnuclear (S1 שבר) מ גלולה המכילה רקמות לא מסיסים, גרעינים (P1 שבר). להעביר שני צינורות microcentrifuge של mL 1.7 נפרדים, חדש, באמצעות פיפטה 1 מ"ל 50 µL ו µL 950 של השבר S1 ולאחסן הצינורות האלה על קרח. שמור בגדר שבר P1 על קרח.
  7. Centrifuge השבר S1 (950 µL) למשך 10 דקות-13,800 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע (S2 שבר), מועשר חלבונים cytosolic מסיסים, ולא בגדר (שבר P2), מועשר מאוגד-קרום חלבונים, כולל חלבונים synaptosomal. להעביר את השבר S2 microcentrifuge 1.7 mL החדש באמצעות פיפטה 1-mL ואחסן אותו בקרח.
  8. Resuspend בגדר (שבר P2) ב- 498 µL של קרח מים מטוהרים באמצעות פיפטה של 1-mL. להוסיף 2 µL של מ' 1 HEPES (pH 7.4) באמצעות פיפטה 20 µL כדי להשיג ריכוז סופי של 4 מ מ HEPES (pH 7.4). דגירה ב 4 ° C עם עצבנות 30 דקות לחנות השבר P2 resuspended על הקרח.
  9. לקבוע את ריכוז חלבון ו- S1, S2, ואת וזמינותו P2 שברים בעזרת של BCA. להוסיף 50 מ מ HEPES (pH 7.4) כל שבר להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש, או לעבד את השבר P2 כדי לבודד את PSD.

6. בידוד של PSD של השבר חלבון (P2) ממברנה גולמי

  1. Centrifuge השבר P2 (500 µL) במשך 20 דקות ב- 25,000 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע lysed (LS2 שבר) ולא בגדר lysed (LP1 שבר). להעביר את השבר LS2 1.7 mL microcentrifuge צינור באמצעות פיפטה 1 מ"ל ואחסן אותו בקרח.
  2. Resuspend בגדר LP1 ב 250 µL של 50 מ מ HEPES (pH 7.4) מעורבב עם 250 µL של 1% סבון 1 x PBS המאגר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. דגירה ב 4 ° C עם עצבנות עדין למשך 15 דקות.
  3. Centrifuge בגדר LP1 resuspended עבור 3 h ב- 25,000 x g ו- 4 ° C כדי להפריד את תגובת שיקוע (שבר שאינו-PSD) בגדר (PSD שבר). הסר את תגובת שיקוע לרכבת התחתית microcentrifuge 1.7-mL, resuspend בגדר PSD ב 100 µL של 50 מ מ HEPES (pH 7.4) באמצעות פיפטה 200 µL.
  4. לקבוע ריכוז חלבון של LS2, הלא-PSD, שברים PSD באמצעות וזמינותו של BCA. להוסיף 50 מ מ HEPES (pH 7.4) כל שבר להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    הערה: כל הפתרונות בשימוש שלבים 5-6 (קרי, פתרון A מאגר HEPES, מאגר PBS) צריכה להיעשות עם מים מורתחים ללא מזהמים יוניים ואורגניים וחלקיקים.

7. המערבי סופג

  1. הפשרת כל שבר חלבון על קרח. העברת µL 12 של כל שבר (S2, P2 ו PSD של 1 מ"ג/מ"ל) מ ל 1.7 microcentrifuge צינור באמצעות פיפטה 20-µL.
  2. הוסף µL 3 5 x מרחביות דוגמת המאגר, דגירה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות באמבט מים. מגניב הדגימה עד לטמפרטורת החדר (RT).
  3. לטעון µL 10 המדגם החלבון לתוך כל טוב של 4-20% מסרק 15-ובכן הדרגתיות מרחביות-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) ג'ל באמצעות פיפטה 20 µL. להפעיל את הג'ל במנגנון מרחביות-דף ו- 80-100 V פועל מאגר (25 מ מ טריס, 190 מילימטר גליצין ו- 0.1% מרחביות; pH 8.3).
    הערה: כל הג'ל צריך להכיל חלבון דגימות NS עכברים וחולדות ECS בנקודות זמן שונות בעקבות ECS אקוטי או כרוני.
  4. העברת החלבונים מהעמוד מרחביות ג'ל קרום פוליוויניל difluoride (PVDF) במנגנון העברה-25-30 V (60 mA) עבור 9-12 h במאגר העברה (25 מ מ טריס, 190 מילימטר גליצין ו- 20% מתנול; pH 8.3).
  5. הסרת קרום PVDF מנגנון העברה ולשטוף אותו בתוך באגירה טריס תמיסת מלח (TBS) למשך 5 דקות על מסובב רב תכליתי-RT.
  6. לחסום את הקרום בחלב 5% ו- 0.1% Tween-20 ב- TBS עבור ה 1 דגירה זה ב ראשי נוגדנים (טבלה 1) במאגר כביסה (חלב 1% ו- 0.1% Tween-20 ב- TBS) לילה על מסובב רב-תכליתי ב 4 ° C (ראה את הטבלה של חומרים דילולים).
  7. לשטוף את הקרום 4 פעמים למשך 10 דקות כל במאגר לשטוף, ואז דגירה זה עם חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים של כביסה מאגר מאובטח על מסובב רב תכליתי-RT.
  8. לשטוף את הקרום 4 פעמים למשך 10 דקות כל במאגר לשטוף, ואז עם TBS במשך 5 דקות.
  9. דגירה הקרום עם סובסטרט chemifluorescence משופרת עבור 1 דקות, לחשוף אותם בפני לסרטי רנטגן. לפתח את הסרט חשוף עם מעבד הסרט.

8. כימות שהכלים המערבי

  1. סריקה המערבי כתם כקובץ TIFF, שמור את הקובץ במחשב.
  2. פתח בקובץ תספיג בתוכנית ImageJ כמו תמונה בגווני אפור, תחת "קובץ," 'פתח תמונה,' חץ ימינה 'גווני אפור'.
  3. בחרו בכלי בחירה מלבנית מסרגל הכלים ImageJ, צייר מלבן שמכסה להקת יחיד תספיג חלבון עניין.
  4. תחת "נתח," מכה "מדידה" כדי להשיג את האזור ואת הצפיפות אכזרי של להקה שנבחרה.
  5. להעביר את המלבן על אזור רקע מבלי לשנות את הגודל והצורה שלה. חזור על שלב 8.4 לאזור ואת הצפיפות אכזרי של רקע.
  6. להחסיר את ערך הדחיסות אכזרי של להקת הרקע של להקת תספיג, נותן את צפיפות הלהקה המופחת-רקע של החלבון עניין.
  7. חזור על שלבים 8.2-8.6 ללהקות תספיג כל עניין.
  8. לחלק את הצפיפות הלהקה המופחת-רקע של החלבון עניין על ידי צפיפות הלהקה המופחת-רקע של מוצר ג'ין משק בית, כגון α-טובולין; שלב זה מניב הערך המנורמל של החלבון עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות ההליך מפורט המובאים כאן, אחד מכת חשמל (55 אמא, 100 פולסים בשנייה עבור 0.5 s) מועברת באמצעות האוזן-קליפ אלקטרודות המושרה הבמה ובקשה ויהיו clonic טוניקה 4-5 בחולדות (איור 1א-ב). 8 סה של חולדות התקבל אינדוקציה ECS חריפה ומוצגים ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5. ההתקפים נמשך בערך 10 s, ואת כל העכברושים התאושש תוך 1-2 דקות של תפיסה הפסקת. דמה "אין תפיסה" חולדות לא קיבלה הלם חשמלי, לכן מציג התקפים. סכום כולל של 4 עכברי דמה שימשו. עבור אינדוקציה ECS כרונית, החולדות קיבל הלם חשמלי אחד ביום למשך 7 ימים רצופים ומוצגים ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5 על כל הלם חשמלי (איור 1א-ב). 8 סה של חולדות התקבל אינדוקציה ECS כרונית, סך של חולדות המזויפים 4 שימשו חולדות "אין תפיסה". למרות שרוב חולדות שקיבלו כרונית ECS היו בהתנהגותו להבחין מגניחותיה מ שאם "אין תפיסה" חולדות, כמה רעידות גוף מפותח, צמצום פעילות גישוש על-ידי הזרם החשמלי 7th .

כדי לבחון אם ECS-induced הרמה הכללית של פעילות הפיצולים חלבון ביטוי hippocampi, חולדות הוקרבו ב 3 שעות ו- 24 שעות לאחר ECS חריפה ו- 24 שעות ביממה ו- 96 h לאחר ECS הסופי בטיפול ECS כרונית (איור 1B) Hippocampi שני של כל עכברוש במהירות גזור, נתון פרוטוקול fractionation בקנה מידה קטן ממוטבת שלנו (איור 2). Homogenate הראשוני של שני hippocampi חינם של רקמת לא מסיסים גרעינים (S1 שבר) היה centrifuged מחדש ב 13,800 g x 10 דקות להפריד את תגובת שיקוע המכיל חלבונים cytoplasmic מסיסים (S2 שבר) מ המכיל קרום גולמי גלולה synaptosomes (שבר P2) (איור 2). זוהה שלנו תספיג חלבון cytoplasmic α-טובולין שברים S2, אך לא שברים P2, של hippocampi של חולדות שטופלו ECS אקוטי וכרוני (איור 3 ו- 4 באיור), הממחיש את fractionation מוצלחת של cytosolic חלבונים מסיסים של כדורי ממברנה גולמי.

PSD95 הוא חבר של משפחת קינאז (מאגוק) guanylate ממברנה-הקשורים למרכיב ליבה של PSD12,18,25. PSD95, יחידת משנה של קולטן NMDA GluN2B התגלו באופן בלעדי שברים P2, אבל לא את S2 שברים (איור 3 ו- 4 באיור). ביטוי חזק של עוד glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic חומצה (אמפא) קולטן יחידה משנית GluA2 זוהה שברים P2 לעומת שברים S2 ב hippocampi (איור 3 ו- 4 באיור), המציין כי חלבוני ממברנה postsynaptic מועשרים בכדורי שבר גולמי ממברנה P2. מעניין, שלפוחית סינפטית חלבון synaptophysin, חלבון ממברנלי אינטגרלי Striatal מועשר טירוזין Phosphatase 61 (שלב61)26 אותרו באותה מידה בחלקים S2 ו- P2 (איור 3 ו- 4 באיור). בהתחשב בגודל קטן של הסינפטיות-בקוטר ממוצע של 39 nm27 ו endosomes, צנטריפוגה כדי לבודד בגדר ממברנה גולמי (שבר P2) אולי לא היה מספיק לך גלולה הסינפטיות וכל endosomes. תוצאות אלו יחד מציינים כי פרוטוקול fractionation גולמי שלנו יכול להעשיר מאוגד-קרום חלבונים, חלבונים transmembrane שאינם משויכים הסינפטיות, ואולי עם endosomes של השבר P2 ממברנה גולמי.

כדי לבחון אם ECS-induced הרמה הכללית של פעילות הפיצולים הביטוי של חלבונים postsynaptic ב hippocampi, השבר גולמי ממברנה P2 היה lysed במים קפואים resuspended במאגר HEPES, centrifuged ב g x 25,000 במשך 20 דקות לבודד צניפה lysed (LP1) (איור 2). בגדר LP1 resuspended HEPES מאגר המכיל 1% טריטון X-100 דטרגנט, centrifuged ב x 25,000 g מעל 3 h כדי להשיג בגדר PSD (איור 2). תספיג עוקבות של שברים PSD זוהה PSD95, GluN2B ו- GluA2 (איור 3 ו- 4 באיור), אשר ידועים חלבונים postsynaptic17,25,28. עם זאת, שברים PSD חסרה α-טובולין, וחשוב, סמן presynaptic synaptophysin (איור 3 ו- 4 באיור). שלב61, אשר dephosphorylates GluN2B, GluA2, משמש שלהם הרגולטור שלילי29,30,31, לא נמצאה בקובץ PSD שברים (איור 3 ו- 4 באיור), בקנה אחד עם הדו ח האחרונות הממחיש את הדרה סינפטית של שלב61, מתווכת על-ידי PSD95 מועשר ב- PSD26. בסך הכל, תוצאות אלה מציינים כי השיטה שלנו fractionation בקנה מידה קטן בהצלחה מבודד PSD חלבונים מן השבר גולמי ממברנה P2.

כימות של סופג המערבי נחשף כי הביטוי GluN2B היה מסקרן של השבר P2 אך מוצגים מגמת עלייה השבר PSD ב 3 שעות ו- 24 שעות לאחר ECS חריפה (n = 4) (איור 3ב). GluA2 הביטוי לא השתנה בחלקים P2 והן PSD-3 h ו- h 24 בעקבות ECS חריפה (איור 3ג'). ב 24 שעות ביממה ו- h 96 לאחר ECS כרונית, GluN2B ביטוי המוצגים מגמה יורדת השבר P2, צומצם באופן משמעותי בתוך השבר PSD (ח': 24 p < 0.05, n = 4; 48 ח': p < 0.01, n = 4) (איור 4B). לעומת זאת, לא השפיעה ECS כרונית GluA2 ביטוי בחלקים P2 ו- PSD (n = 4) (איור 4C).

Figure 1
איור 1 : סכימה אינדוקציה של ECS אקוטית, כרונית ECS. (א) A חולדה היה מחובר גנרטור דופק דרך האוזן-קליפ אלקטרודות ומכת חשמל (55 אמא, 100 פולסים בשנייה עבור 0.5 s) הוחל שמעודדים ויהיו clonic טוניקה שלב 4-5. ECS חריפה (B) היה המושרה על ידי הלם חשמלי אחד. ECS כרונית מצידם על ידי הלם חשמלי אחד ביום למשך 7 ימים רצופים. הנקודות הזמן המוצגות מייצגות משך בעקבות של אינדוקציה של ECS חריפה או את ה-ECS. האחרון עבור אינדוקציה ECS כרונית לפני ניתוח hippocampi. שאם "אין התקף" (NS) שליטה חולדות שטופלו באופן זהה אך לא קיבל מכת חשמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : זרימת העבודה של Fractionation Subcellular כדי לבודד את S2, P2 ו PSD שברים מ Hippocampi של עכברוש בודד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: בדיקה חלבונים סינפטיים ב S2 בהיפוקמפוס, P2 ו PSD שברים של חולדות זה התקבל NS או חריפה ECS. () נציג המערבי שהכלים הצג את הביטוי חלבון של יחידת משנה של קולטן NMDA GluN2B, אמפא קולטן GluA2 שלב61 ב- S2, P2, והתקבלו PSD שברים מ hippocampi של דמה "אין תפיסה" (NS) עכברים, חולדות זה ECS חריפה. חלבון cytoplasmic מסיסים α-טובולין מועשר בתמציות השבר S2. Synaptophysin חלבון presynaptic שלפוחית, מועשר קרום גולמי שבר P2, אך לא את השבר PSD. PSD-95 מועשר בחלקים P2 והן PSD. (ב'-ג') כימות של GluN2B (B), GluA2 (ג) בחלקים P2 ו- PSD-3 ו- 24 שעות לאחר ECS חריפה (n = 4 חולדות לכל נקודת זמן). GluN2B, GluA2 ביטוי השבר P2 היה מנורמל ל α-טובולין, השבר S2. GluN2B, GluA2 ביטוי השבר PSD היה מנורמל כדי PSD-95 בהשבר PSD. הנתונים מוצגים כמו ± אחוז ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: בדיקה חלבונים סינפטיים ב S2 בהיפוקמפוס, P2 ו PSD שברים של חולדות זה התקבל NS או כרונית ECS. נציג המערבי לחומה של α-טובולין; synaptophysin; שלב61; וקיבל postsynaptic חלבונים, כולל PSD95, GluN2B, GluA2, שברים S2, P2 ו PSD מ hippocampi של דמה "אין תפיסה" (NS) עכברים, חולדות זה ECS כרונית. חלבון cytoplasmic מסיסים α-טובולין מועשר בתמציות השבר S2. Synaptophysin חלבון presynaptic שלפוחית, מועשר קרום גולמי שבר P2, אך לא את השבר PSD. PSD-95 מועשר בחלקים P2 והן PSD. (בג) כימות של GluN2B (B), GluA2 (ג) בחלקים P2 ו- PSD-24 ו 96 h לאחר ECS כרונית (n = 4 חולדות לכל נקודת זמן). GluN2B, GluA2 ביטוי השבר P2 היה מנורמל ל α-טובולין, השבר S2. GluN2B, GluA2 ביטוי השבר PSD היה מנורמל כדי PSD-95 בהשבר PSD. הנתונים מוצגים כמו אחוז ± SEM; * p < 0.05, * * p < 0.01 לעומת שליטה (מבחן ANOVA, של Tukey פוסט-הוק ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שבר חלבון שבר סמן חלבון
P1 גרעיני Histon H1
S1 ציטוזול/membrances -טובולין (שלד התא), GAPDH (ציטוזול)
P2 Synaptosomes גולמי אמפא ו- NMDA קולטן subunits
S2 ציטוזול/אור membrances GAPDH (ציטוזול) ו LAMP1 (ליזוזום)
קרום synaptosomal Synaptosome/המיטוכונדריה Subunits קולטן אמפא, NMDAR, Synaptophysin (סמן presynaptic)
PSD PSD אמפא ו- NMDA קולטן subunits, PSD95, PICK1, CaMKII

טבלה 1: רשימת סמני חלבונים ונוגדנים כדי להבחין בין שברים Subcellular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מתארים בשיטת אינדוקציה ECS בחולדות מעורר גירוי כללי של הפעילות העצבית שלהם hippocampi. ECS הוא במודל חיה של נזעי חשמל, אשר נמצא בשימוש קליני לטיפול הפרעות דיכאון עקשן בסמים אצל בני אדם1,2,3. למרות השימוש נזעי חשמל לטיפול בדיכאון חמור, המנגנון הבסיסי המדויק עדיין לא ברור. כי ה-ECS גורם אנטי-depressant-כמו בהתנהגויות של מכרסמים ומעוררת נוירוג'נסיס בהיפוקמפוס4,32, ECS שימש בהרחבה כדי לחקור אם חדש למבוגרים-נולד נוירונים בתוך הפיתול משוננת של ההיפוקמפוס לתרום5,נגד דיכאון התנהגות32.

ECS גורם מתון עד חמור מוכללת ויהיו טוניק-clonic מכרסמים במסירה הנוכחי באמצעות אלקטרודות stereotaxically מושתל, אלקטרודות הקרנית או אוזן-קליפ-אלקטרודות-33,-34. הקלטות EEG בחולים חשפו כי גירוי חשמלי דו צדדיים גורמת להתקפים בולטים יותר כללית יותר מאשר גירוי חד צדדית35,36. בשיטה שלנו אינדוקציה ECS, ויהיו clonic טוניקה הם המושרה על ידי משלוח הנוכחי דרך האוזן לא פולשנית-קליפ אלקטרודות המונחות בשתי האוזניים, מחקה התקפים אצל בני אדם עורר על ידי גירוי דו צדדיים36. אמנם לא בדקנו את היעילות של ECS בחולדות הרגעה או הרדמה שהוחל עליו, זה ריאלי כי מתן תרופות הרדמה לעכברושים יכול להפחית את מידת התקפים המושרה על ידי גירוי חשמלי, אשר עשוי להיות בשל העובדה כי הרדמה המדינה קשורה מבחינה פיזיולוגית משופרת מעכבות, לחה סינאפסות הטון ברשת המוח. בנוסף, הוא השלב הקריטי בשיטת אינדוקציה ECS השפעול לחייג את העוצמה הנוכחית להפיק שלב 4-5 כללית tonic - ויהיו clonic בהתבסס על הגיל, משקל, המינים של מכרסם.  שיטת הגיוס שלנו ECS מוטבה להשראת שלב 4-5 התקפים תוך כמה שניות אצל חולדות ספראג-Dawley זכר ער במשקל של 200-250 גרם. אם חולדות תחת הרדמה מצב משמשים ECS אינדוקציה, העוצמה, המשך והתדירות של העברת הנוכחי צריך להיות שונה עבור אינדוקציה מוצלחת של התקף החל שלב 4 עד 5.

ECS מציעה גם את היתרון של היפראקטיביות בנוירונים ומעורר גורם ויהיו ארעי חריפה עם התמותה נמוכה מאוד33, בניגוד chemoconvulsants, כולל פילוקרפין ו- kainite, אשר זירוז סטטוס אפילפטיקוס ולגרום ביטוי כרונית של התקפים חוזרים ונשנים ספונטנית ו37,חמור שינויים היסטולוגית38. למרות ECS יש כבר מנוצל באופן שגרתי אל מסך אנטי-אפילפטי תרופות33,34, ECS אקוטית, כרונית ECS התוצאה אינה הדור של אפילפסיה כרונית, לכן לא ניתן להשתמש במודל חיה כדי ללמוד epileptogenesis. במקום זאת, ECS נרחב ננקטה כדי לבחון את היקף אשר גובה רחבה של פעילות מוחית הפיצולים ביטוי ו/או שינויים posttranslational של חלבונים סינפטיים ויוו, אשר תורמים לשינויים מתמידים סינפטית כוח ומבנים (איור 3 ו- 4 באיור)10,40. במחקר זה, שאנחנו משתמשים. רק עכברושים זכר כדי לא לכלול את השפעות בלתי צפויה ייחום שלב מחזור של חולדות נקבות על כמות חלבון PSD לאחר ECS. עם זאת, זה היה ציין כי אין שום הבדל מין את החלבונים פיגומים, כולל PSD-95 ו- SAP102 באזור PSD של החזיתית, ההיפוקמפוס39, רומז כי שינויים הורמונליים המסדירים מחזור ייחום יכול לא להשפיע על הבסיס כמות חלבונים PSD.

יש כבר מועסקים מספר שיטות לבחון את המידה שבה ECS גורם לשינויים נוירוג'נסיס, synaptogenesis ופלסטיות סינפטית5,6,7,8,9, 11 , 40. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של סינאפסות postsynaptic הנוכחי (EPSC) נמצאים בשימוש נרחב כדי לזהות השינויים בחוזק glutamatergic סינאפסות סינפטית synapses21. לדוגמה, הקלטות EPSC מיניאטורי נחשפו homeostatic downscaling של סינאפסות כוח סינפטיים בנוירונים כפירמידה קורטיקלית של שכבות II-III של עכברים בעקבות ECS חריפה41. עם זאת, הזיהוי של חלבונים סינפטיים שתורמים ECS-induced פלסטיות סינפטית הוא מאתגר כי הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לזווג עם נוקאאוט גנטי או דפיקה למטה של חלבונים סינפטיים מועמד מסוים. שינויים ברמת של רצפטורים גלוטמט postsynaptic ממברנה, חלבונים סינפטיים מועשר ב- PSD לווסת את הכוח ואת היעילות של סינאפסות הסינאפסית17,18,25. למרות אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש כדי לבחון ECS-induced שינויים בביטוי של חלבונים סינפטיים, טכניקה זו ניתן לבחון רק 1-2 המועמד סינפטית חלבונים בכל פעם ודורש נוגדנים היטב מאומתים באופן ספציפי לזהות אותם מבלי לגרום כתמים שאינם ספציפיים.

Fractionation subcellular של רקמת המוח, בשילוב עם סופג המערבי מציע יתרונות אלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה בזיהוי חלבונים סינפטיים שונו על ידי ה-ECS. Fractionation subcellular של רקמת המוח היא שיטה מהירה וגסים ביוכימי כדי להפריד מסיסים cytosolic חלבונים (S2 שבר) של ממברנות גולמי (שבר P2), כולל ריריות ER, גולג'י, ממברנה מכורך organelles, ממברנות פלזמה, ו סינפטית מסוף הקרומים reseal כדי טופס synaptosomes42,43,44. השבר PSD יכול להיות עוד יותר מבודד מן השבר P2 להעשיר חלבונים סינפטיים42,43,44. הניתוח לא משוחד פרוטיאומיה מבנית של השבר PSD יוכל לזהות כל החלבונים PSD של מי רמות שונו על ידי ה-ECS. סופג המערבי יכול להתבצע במהירות כדי לבחון את השינויים ביטוי של החלבונים PSD, אשר ניתן לזהות בקלות להקות לא ספציפית.

השיטה הקודמת של המוח fractionation דורשת כמות גדולה של המוח מכרסמים רקמות42,43,44, ביצוע טכניקה זו מאתגרת לשימוש בעת בחינת מסיסים או קרום חלבונים מאדם בודד המוח מכרסמים או אזור ספציפי במוח של מוח אחד. יש לדרישה גוברת להשוות באופן כמותי את פרוטאום מאזור המוח אחד למשנהו, מחיה שליטה חיה הטרנסגניים או חיה עבר טיפול מסוים. לפיכך, יש תוקן ואנו ממוטב בשיטת fractionation המוח מסורתיים כדי לבודד שברים מסיסים, ממברנה גולמי של שני hippocampi של עכברוש בודד. פרוטוקול fractionation גולמי בקנה מידה קטן שלנו בהצלחה מבודד גולמי שברים ממברנה P2 מ cytosolic S2 מסיסים שברים, כמצוין על-ידי חוסר חלבון cytoplasmic α-טובולין בחלקים P2, ואילו PSD95 ממברנה מכורך זוהה P2 אך לא S2 שברים (איור 3א ואיור 4א). באמצעות השיטה המתוארת כאן, אנחנו באופן כמותי הראו כי ECS חריפה באופן משמעותי מגדילה שלב61 ביטוי מקטין זרחון טירוזין של מצעים שלה, GluN2B, את חוץ-תאית מוסדר אות קינאז 1/2 בגולמי ממברנה P2 שבריר עכברוש hippocampi-48 שעות לאחר ECS חריפה10.

באופן בלתי צפוי, שברים S2 הכילה synaptophysin; שלב61; ו, במידה פחותה בהרבה, GluA2 (איור 3א ואיור 4א). שלב61 הוא glycosylated ממברנלי אינטגרלי חלבון26 המשויך (ER) רשתית תוך-פלזמית של PSD45. זה אפשרי כי צנטריפוגה כדי לבודד בגדר ממברנה גולמי (שבר P2) אולי לא היה מספיק לך גלולה כל הסינפטיות synaptosomes, כמו גם endosomes, lysosomes המכיל GluA2 ונכנסים61. ובכל זאת, ברור העשרה של GluN2B, GluA2 ו- PSD95 ולציין חוסר α-טובולין בחלקים P2 כי פרוטוקול fractionation שלנו יכול להעשיר מאוגד-קרום חלבונים, חלבונים transmembrane לא משויכים הסינפטיות, endosomes של השבר גולמי ממברנה P2.

למרות השבר P2 ממברנה גולמי מכיל synaptosomes, מגבלה אחת של שינויים תלויי-פעילות בדיקה של חלבונים סינפטיים ב השבר P2 היא כי לא ניתן לקבוע את המיקום המדויק של השינויים שלהם. אם חלבונים סינפטיים מועשר ב- PSD להיקבע, בהמשך הביוכימי fractionation ניתן לבודד את PSD. השיטה הקודמת של PSD fractionation דורשת כמות גדולה של רקמת המוח מכרסמים (קרי, המוח מכרסמים 10-20), סוכרוז מעברי צבע42,43,44. כי שיטה מסורתית זו זה לא מספיק לבודד כמות מספקת של השבר PSD של שני hippocampi של עכברוש בודד, לנו יש להתאים שיטה פשוטה שמבודד ישירות השבר PSD, ללא סוכרוז הדרגתיות20,21 . שיטה זו התשואות על 30-50 µg של החלבון PSD, מספיק עבור מספר מבחני הביוכימי, כולל סופג המערבי. השיטה שלנו מעשיר PSD95 GluN2B, GluA2, אשר ידועים להיות מרוכזים השבר PSD, מזהה שינויים בביטוי GluN2B שבר PSD בעקבות אינדוקציה ECS כרונית (איור 3 ו- 4 באיור).

כאן, ניתוח כמותי תספיג שלנו גילה שום שינוי משמעותי בביטוי GluA2 שברים P2 ו- PSD-3 h ו- h 24 בעקבות ECS חריפה (איור 3ג'). הביטוי GluN2B היה מסקרן של השבר P2 אבל המוצגים מגמת עלייה השבר PSD ב 3 שעות ו- 24 שעות לאחר ECS חריפה (איור 3B), רומז אפשרי דיפרנציאלית ויסות סינפטית נגד extrasynaptic GluN2B המכיל קולטני NMDA. גם הבחנו כי הביטוי GluN2B המוצגים מגמה יורדת השבר P2 לאחר ECS כרונית, צומצם באופן משמעותי בתוך השבר PSD-h 24 ו 96 בעקבות ECS כרונית (איור 4B). למרות ספקולטיבי מאוד, כזה הסרת GluN2B מ- PSD בעקבות אינדוקציה חוזרות של ECS עשוי להיות מתווכת על-ידי מנגנונים מרובים, כולל הפנמה ישירה מ- PSD ממברנה או לרוחב פעפוע לאתרים extrasynaptic. בהתחשב הדוח הקודם שלנו זה שיפור ממושך של פעילות. עצבית במידה ניכרת מגדילה שלב61 ביטוי ומפחית טיר-זירחון של GluN2B שברים P2 של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית46, הממצאים שלנו מראים כי ירידה בביטוי GluN2B של P2 ושברים PSD לאחר ECS כרונית עשוי להיות סביר בשל שיפור שלב61 ביטוי והסרה עוקבות של GluN2B של קרום extrasynaptic.

לסיכום, הראו כי שיטת fractionation בקנה מידה קטן שלנו PSD, בשילוב עם פרוטוקול אינדוקציה ECS, מאפשר לנו להבדיל ויוו תלויי-פעילות ויסות רצפטורים גלוטמט-קרום postsynaptic לעומת סה כ ממברנות פלזמה, כולל את ממברנות extrasynaptic. פרוטוקול זה בקלות יכול להיות מיושם בכל חלבונים סינפטיים-הסינפסות סינאפסות, יכול להיות שונה hippocampi מכרסמים אחרים או אזורים אחרים במוח על-ידי כוונון עוצמת הקול של כל פתרון המבוסס על המשקל רקמות. לפיכך, שיטת fractionation בקנה מידה קטן שלנו PSD הוא תכליתי, יכול להיות מאומץ עבור יישומים עתידיים לבחון את השינויים ויוו את החלבונים postsynaptic ב כל חיה על טיפול גנטי, תרופתי או מכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחברים תודה ומאפשר לנו להשתמש צנטריפוגה שלו fractionation, ד ר גראהם ה Diering במעבדה של ד ר ריצ'רד ל' Huganir באוניברסיטת ג'ון הופקינס סיפק לנו הפרוטוקול בקנה מידה קטן עבור fractionation PSD ד ר אריק ג בולטון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).

Tags

מדעי המוח גיליון 126 חשמל ההתקף ההיפוקמפוס subcellular fractionation צפיפות postsynaptic קולטן NMDA סופג המערבי
חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, S. S., Jeong, H. G., Chung, H. … More

Jang, S. S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter