Summary
Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi vid svår depression. ECS stimulerar globalt aktiviteten i hippocampus, vilket leder till synaptogenes och synaptisk plasticitet. Här, beskriver vi metoder för ECS induktion hos råttor och subcellulär fraktionering av deras hippocampi att undersöka beslag-inducerade förändringar i synaptic proteiner.
Abstract
Elektrokonvulsiv beslag (ECS) är en experimentell djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, den mest effektiva behandlingen för svår depression. ECS inducerar generaliserade tonisk-kloniska anfall med låg mortalitet och neuronala dödsfall och är en allmänt använd modell till skärmen antiepileptika. Här, vi beskriver en metod för induktion av ECS i som en kort 55-mA ström levereras för 0,5 s till manliga råttor 200-250 g i vikt via örat-clip elektroder. Sådana bilaterala stimulering produceras stage 4-5 kloniska anfall som varade ca 10 s. Efter upphörande av akut eller kronisk ECS, de flesta råttor återhämtat sig för att vara behaviorally omöjlig att skilja från sham ”inga beslag” råttor. Eftersom ECS globalt höjer hjärnans aktivitet, har det också använts för att undersöka aktivitet-beroende förändringar av synaptic proteiner och deras effekter på synaptisk styrka med flera metoder. I synnerhet tillåter subcellulär fraktionering av postsynaptiska densiteten (PSD) i kombination med Western blotting för kvantitativ bestämning av överflödet av synaptic proteiner vid denna specialiserade synaptic struktur. I motsats till en föregående fraktionering metod som kräver stor mängd gnagare hjärnor, beskriver vi här en småskalig fraktionering metod för att isolera PSD från hippocampi på en enda råtta, utan sackaros gradient centrifugering. Med den här metoden visar vi att den isolera PSD-fraktionen innehåller postsynaptiska membranproteiner, inklusive PSD95, GluN2B och GluA2. Presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin uteslöts från den PSD fraktionen, demonstrerar framgångsrika PSD isolering. Kronisk ECS minskade dessutom GluN2B uttryck i PSD, som visar att vår småskaliga PSD fraktionering metod kan användas för att upptäcka förändringar i hippocampus PSD proteiner från en enda råtta efter genetiska, farmakologiska eller mekaniska behandlingar .
Introduction
Elektrokonvulsiv terapi har använts för att behandla patienter med stora depressiva störningar, inklusive svår resistent depression, bipolär depression, Parkinsons sjukdomar och schizofreni1,2. I denna behandling genereras beslag av elektrisk stimulans levereras till chefen för sövda patienter via epicranial elektroder1,2,3. Upprepad administrering av ECS har gynnat kliniskt resistenta depressiva störningar1,2,3. Den exakta mekanismen bakom den långsiktiga effekten av antidepressiva effekten hos människa har dock förblivit svårfångade. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi och används ofta för att undersöka dess terapeutiska mekanism. Hos gnagare, både akut ECS och långtidsbehandling med ECS främja adult neurogenes i hippocampi och omorganisera den neurala nätverk4,5, som sannolikt kommer att bidra till förbättringar i kognitiv flexibilitet. Dessutom förändrar global förhöjning av hjärnans aktivitet av ECS överflödet av avskrifter, såsom en hjärna härrör neurotropa faktor6och flera proteiner, inklusive metabotropa glutamat receptor 17 och den N-metyl-D-aspartat (NMDA) typ glutamat receptor subenheter7. Dessa förändringar är inblandade i medla långsiktig ändring av synaps nummer, struktur och styrka i hippocampus7,8,9.
I ECS modeller levereras elektrisk stimulering till gnagare via stereotaxically implanterade elektroder, korneal elektroder eller örat elektroder att framkalla generaliserade tonisk-kloniska anfall10,11. Stereotaxic implantation av elektroder innebär hjärnkirurgi och kräver betydande tid att förbättra de experimenter's kirurgiska färdigheter för att minimera skadan. Mindre invasiva korneal elektroder kan orsaka korneal nötning och torrhet och kräver narkos. Användning av örat-clip elektroder kringgår dessa begränsningar eftersom de kan användas på gnagare utan kirurgi eller anestesi och minimal skada. Faktiskt, fann vi att nuvarande levereras till vaken råttor via örat-clip elektroder tillförlitligt inducerar etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall och förändrar synaptic proteiner i deras hippocampi10.
För att undersöka ECS-inducerad överflödet av synaptic proteiner i de delar av hjärnan av gnagare, är det viktigt att välja de experimentella metoder som är mest lämpade för deras upptäckt och kvantifiering. Subcellulär fraktionering av hjärnan tillåter för råolja isolering av lösliga cytosoliska proteiner; membranproteiner; organell-bounds proteiner; och även proteiner i särskilda subcellulära strukturer, såsom PSD12,13,14. PSD är en tät och väl organiserad subcellulär domän i nervceller där synaptic proteiner är starkt koncentrerad vid och nära den postsynaptiska membran12,13,15. Isolering av PSD är användbart för studiet av synaptic proteiner berikad på PSD, sedan dynamiska förändringar i överflöd och funktion av postsynaptiska glutamatreceptorer, byggnadsställningar proteiner och signaltransduktion proteiner i PSD12 , 15 , 16 , 17 är korrelerade med synaptisk plasticitet och den synaptopathy som observerats i flera neurologiska17,18. En tidigare subcellulär fraktionering metod som används för att rena PSD inblandade isoleringen av den olösliga i tvättmedel fraktionen från rå membran fraktionen av hjärnan genom den differentiella centrifugeringen av sackaros lutningar14, 19. den stora utmaningen med denna traditionella metod är att den kräver stora mängder gnagare brains14,19. Beredning av 10-20 gnagare att isolera den PSD fraktionen per behandling kräver omfattande kostnads- och investering i tid och är inte praktiskt genomförbart om det finns många behandlingar.
För att övervinna denna utmaning, har vi anpassat en enklare metod som direkt isolerar den PSD fraktionen, utan sackaros gradient centrifugering20,21, och revideras för att vara tillämplig på PSD isolering från hippocampi på en enda råtta hjärnan. Våra småskaliga PSD fraktionering metod ger om 30-50 µg av PSD proteiner från 2 hippocampi, tillräckligt för användning i flera biokemiska analyser, inklusive immunoprecipitation och Western blotting. Western blotting visar framgången av vår metod för att isolera PSD genom att avslöja anrikningen av postsynaptiska densitet protein 95 (PSD-95) och uteslutandet av presynaptiska markör synaptophysin och lösliga cytoplasmiska proteinet α-tubulin. Våra ECS induktion och småskaliga PSD fraktionering metoder är lätt att anpassa till andra gnagare hjärnan och ger en relativt enkel och pålitlig sätt att utvärdera effekterna av ECS på uttrycket av PSD proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner inklusive animaliska ämnen har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid University of Illinois at Urbana-Champaign.
1. att upprätthålla en råtta koloni
- Häcka Sprague-Dawley-råttor (se Tabell av material) och underhålla dem i normala förhållanden med en 12-h ljus-mörker cykel och ad lib tillgång till mat och vatten.
- Avvänja råttungar vid postnatal dag (P) 28 och hus dem i grupper om 2-4 manliga eller kvinnliga littermates.
- Markera svansar av hanråttor med giftfri permanent svart markör för identifiering.
- Väger de mansperson råttorna 3 gånger i veckan och spela in sin bodyweights.
2. beredning av en ECS maskin
- Vid 7:30, desinficerar bänken i djurens beredningslokalen och placera en ECS maskin (pulse generator) på bänken.
- Placera en enskilda mansperson råtta väger 200-250 g i en ren, tom bur med lock. Upprepa detta för alla manliga råttor behandlas med ECS induktion. Låt råttorna habituerar i 30 min.
- När råttorna tillvänjning i sina burar, ange en pulsgenerator för ECS induktion ska frekvensen av 100 pulser/s, en pulsbredd 0,5 MS, en chock varaktighet av 0,5 s, och en ström av 55 mA (figur 1A).
- Förbereda pulsgeneratorn genom att trycka på ”RESET”-knappen och se till att knappen ”färdig” lyser. Kontrollera att örat klippen inte är kopplade till en pulsgenerator och tryck sedan på knappen ”chock” för några sekunder.
Obs: vid denna punkt, pulsgeneratorn är redo för ECS induktion. - Koppla in ear klippen i pulsgeneratorn.
3. induktion av akut ECS
Obs: Se figur 1B, övre panelen.
- Fukta örat klippen med steril koksaltlösning och säkerställa att de är mättade.
- Blöt en råttas öron med steril saltlösning genom att Linda dem i saltlösning-indränkt kompress. När de är våta, ta bort gasväv.
- Bifoga ett klipp per öra, position bortom huvudsakliga brosk bandet.
- Bekräfta på ECS maskinen att en sann loop är etablerad. om så inte är fallet, visas ett felmeddelande eller en läsning av ”1” på maskinen.
- Bära en tjock, icke-metall handske. Medan du håller råttan försiktigt i en behandskade hand, tryck på knappen ”chock” för några sekunder och långsamt släppa greppet om råttan att iaktta beslag. För bluff ”inga beslag” (NS) styra, hantera råttan identiskt men levererar inte nuvarande.
- Koppla bort örat klippen som Klonus börjar och spela in beteendet beslag enligt en reviderad Racines skala22 som inkluderar ”mun och ansiktsbehandling rörelser” (steg 1), ”huvudet nickande” (steg 2), ”forelimb Klonus” (steg 3), ”uppfödning med forelimb Klonus” (steg 4), och ”uppfödning och faller med forelimb Klonus” (steg 5). Beslag bör pågå ca 10 s; spela in beslag varaktighet med hjälp av en timer.
- Efter beslag, återgå råtta till dess buren. Övervaka råtta för en annan 5 min att göra säker på återvinning av råtta från anfall. Hålla den ensamma inrymt i buren och återgå buren till uppvaket.
- Upprepa ECS induktion på nästa råtta.
- Övervaka råttorna i hela resten av dagen och minst en gång på morgonen och en gång på eftermiddagen dagen efter tills de är euthanized för experiment.
Obs: Metoden ECS induktion kan leda till kliniska tecken som en tillfällig bieffekt, som kräver uppmärksamhet. Till exempel kunde ECS induktion protokollet framkalla anfall som varar längre än 15 s och orsaka onödigt lidande till råttorna. I detta fall häva beslag med diazepam (10 mg/kg, i.p.) eller pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Om råttorna utveckla andnöd eller svåra beteendemässiga avvikelser efter beslag upphörande, avliva dem av koldioxid inandning följt av halshuggning.
4. induktion av kronisk ECS
Obs: Se figur 1B, nedre panelen.
- Inducera en ECS per dag vid samma tid på morgonen som beskrivs i steg 1-3 ovan, under sju dagar.
- Övervaka råttorna två gånger en dag efter de återbördas till sina hem burar.
5. homogenisering och fraktionering av råtta Hippocampi
Obs: Se figur 2.
- Förbereda en färsk homogenisering buffert (lösning A) som innehåller 320 mM sackaros, 5 mM natrium pyrofosfat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7,4, 200 nM okadasyra och proteashämmare. Filter-sterilisera bufferten med filter med en 0,22 µm porstorlek för dammsugarfilter och placera den på is.
- Vid en given tidpunkt punkt efter akut ECS eller kronisk ECS (figur 1), eutanasi råtta av CO2 inandning för 5-10 min, följt av halshuggning med en giljotin.
- Ta bort hjärnan och dissekera hippocampi metallplattan placeras på isen, som tidigare beskrivits23,24.
- Plats två hippocampi från en råtta på en 30-mm vävnadsodling skålen och hacka dem i små bitar med sax.
- Överföra de malet hippocampi till en manuell glas Homogenisatorer med 1 mL pipett och tillsätt 1 mL iskallt homogenisering buffert (lösning A, steg 5.1). Infoga en runda mortelstöt i en glas Homogenisatorer. Medan glas Homogenisatorer är på is, försiktigt och stadigt stroke upp och ner på mortelstöten 10 - 15 gånger för 1 min, tills små bitar av hippocampus vävnad försvinner.
- Överföra Homogenatet till ett 1,7 mL mikrocentrifug rör med 1 mL pipett och centrifugera Homogenatet vid 800 x g i 10 minuter vid 4 ° C till separata postnuclear supernatanten (S1 fraktion) från den pellets som innehåller olösliga vävnad och atomkärnor (P1 fraktion). Överför 50 µL och 950 µL i bråket som S1 till två separata, nya 1,7 mL mikrocentrifugrör med 1 mL pipett och lagra dessa rör på isen. Spara P1 bråkdel pelleten på is.
- Centrifugera S1 fraktionen (950 µL) för 10 min vid 13 800 x g och 4 ° C till separat supernatanten (S2 fraktion), berikad med cytosoliska lösliga proteiner, och pelleten (P2 fraktion), berikad med membran-bundna proteiner, inklusive synaptosomal proteiner. Överföra bråket som S2 till en ny 1,7 mL mikrocentrifug med 1 mL pipett och förvara det på is.
- Återsuspendera pelleten (P2 fraktion) i 498 µL iskall renat vatten med 1 mL pipett. Tillsätt 2 µL av 1 M HEPES (pH 7,4) med 20 µL pipett för att uppnå en slutlig koncentration på 4 mM HEPES (pH 7,4). Inkubera vid 4 ° C med agitation för 30 min. Store det återsuspenderade P2 bråket på isen.
- Att bestämma proteinkoncentration S1, S2 och P2 fraktioner med en BCA-analys. Lägga till 50 mM HEPES (pH 7,4) respektive fraktion att uppnå en koncentration av 1 mg/mL och förvaras vid-80 ° C fram till användning eller bearbeta det P2 bråket för att isolera PSD.
6. isolering av PSD från den råa membran-proteinfraktion (P2)
- Centrifugera det P2 bråket (500 µL) under 20 minuter vid 25 000 x g och 4 ° C för att separera lyserat supernatanten (LS2 fraktion) och lyserat pelleten (LP1 fraktion). Överföra den LS2 fraktionen till en ny 1,7 mL mikrocentrifug rör med 1 mL pipett och förvara det på is.
- Återsuspendera pelleten LP1 i 250 µL av 50 mM HEPES (pH 7,4) blandas med 250 µL av 1% tvättmedel 1 x PBS-bufferten med 1 mL pipett. Inkubera vid 4 ° C med skonsam omrörning i 15 min.
- Centrifugera den återsuspenderade pelleten LP1 för 3 h vid 25 000 x g och 4 ° C till separat supernatanten (icke-PSD fraktion) från pelleten (PSD fraktion). Ta bort supernatanten till ett 1,7 mL mikrocentrifug rör och återsuspendera pelleten PSD i 100 µL av 50 mM HEPES (pH 7,4) med 200 µL pipett.
- Bestämma proteinkoncentration av LS2, icke-PSD och PSD fraktioner med en BCA-analys. Lägga till 50 mM HEPES (pH 7,4) respektive fraktion att uppnå en koncentration av 1 mg/mL och förvaras vid-80 ° C fram till användning.
Obs: Alla lösningar används i steg 5-6 (dvs. lösning A HEPES buffert och PBS-bufferten) bör göras med renat vatten gratis joniska och organiska föroreningar och partiklar.
7. Western Blotting
- Tina varje proteinfraktion på is. Överföra 12 µL av varje fraktion (S2, P2 och PSD i 1 mg/mL) till en ny 1,7 mL mikrocentrifug rör med 20-µL pipett.
- Tillsätt 3 µL av 5 x SDS prov buffert och inkubera vid 75 ° C under 30 minuter i ett vattenbad. Cool provet ner till rumstemperatur (RT).
- Ladda 10 µL av protein provet i varje brunn 4-20% lutning 15-väl kam SDS-gelelektrofores (SDS-PAGE) Polyakrylamidgelen med 20 µL pipett. Kör gelen i SDS-PAGE apparaten och vid 80-100 V i kör buffert (25 mM Tris, 190 mM glycin och 0,1% SDS; pH 8,3).
Obs: Varje gel bör innehålla protein prover från NS råttor och ECS råttor vid olika tidpunkter efter akut eller kronisk ECS. - Överföring proteinerna från den SDS-PAGE gel till ett polyvinyl kryptondifluorid (PVDF) membran i den överföring apparaten på 25-30 V (60 mA) för 9-12 h i överföring buffert (25 mM Tris, 190 mM glycin och 20% metanol; pH 8,3).
- Ta bort PVDF membranet från överföring apparaten och tvätta den i Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) för 5 min på en multi-purpose rotator på RT.
- Blockera membranet i 5% mjölk och 0,1% Tween-20 i TBS för 1 h. Inkubera det i primära antikroppar (tabell 1) i tvätt buffert (1% mjölk och 0,1% Tween-20 i TBS) över natten på en multi-purpose rotator vid 4 ° C (se Tabell av material för utspädningar).
- Tvätta membranet 4 gånger för 10 min varje i tvättbuffert och sedan Inkubera det med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundära antikroppar i tvätt buffert för 1 h på en multi-purpose rotator på RT.
- Tvätta membranet 4 gånger för 10 min varje i tvättbuffert och sedan med TBS i 5 min.
- Inkubera membranet med förbättrad chemifluorescence substrat för 1 min och Utsätt det för röntgenfilm. Utveckla den exponerade filmen med en film-processor.
8. kvantifiering av Western blotting
- Skanna Western blot som en TIFF-fil och spara filen på datorn.
- Öppna filen Western blot i programmet ImageJ som en gråskalebild, under ”fil” ”öppna bild”, höger pil ”gråskala”.
- Välj verktyget Rektangulär markering från verktygsfältet ImageJ och rita en rektangel som täcker ett enda Western blot band av ett protein av intresse.
- Under ”Analyze”, hit ”åtgärd” för att få området och den genomsnittliga tätheten av en valda bandet.
- Flytta rektangeln till en bakgrundsområdet utan att ändra dess storlek och form. Upprepa steg 8,4 till området och den genomsnittliga tätheten av en bakgrund.
- Subtrahera värdet genomsnittliga tätheten av en bakgrund band från som ett Western blot-band, ger bakgrunden-subtraheras bandet tätheten av proteinet av intresse.
- Upprepa steg 8,2-8,6 för alla Western blot band av intresse.
- Dela upp bakgrunden-subtraheras bandet tätheten av proteinet av intresse av bakgrunden-subtraheras bandet tätheten av en städning genprodukten, såsom α-Tubulin; Detta steg ger normaliserade värdet av proteinet av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detaljerad procedur presenteras här, en elektrisk stöt (55 mA, 100 pulser/s för 0,5 s) levereras via örat-clip elektroder inducerad engångsposter steg 4-5 tonisk-kloniska anfall hos råttor (figur 1A-B). En totalt 8 råttor emot akut ECS induktion och visas etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall. Beslagen varade ca 10 s, och alla råttor återhämtade sig inom 1-2 min beslag upphörande. Skenmanöver ”inga beslag” råttor får inte en elektrisk stöt och därför framvisade inte anfall. Sammanlagt 4 sham råttor användes. För kronisk ECS induktion, råttorna fick en elektrisk stöt per dag i 7 dagar och visas etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall vid varje elektrisk chock (figur 1A-B). En totalt 8 råttor fick kronisk ECS induktion och sammanlagt 4 sham råttor användes som ”inga beslag” råttor. Även om de flesta råttor som fick kronisk ECS var behaviorally omöjlig att skilja från sham ”inga beslag” råttor, några utvecklade kropp skalv och reducerad undersökande aktivitet av de 7th elektriska stöt.
För att undersöka om ECS-inducerad globala behörighetshöjning aktivitet förändrar proteinuttryck i hippocampi, offrades råttor på 3 h och 24 h efter akut ECS och på 24 h och 96 timmar efter den slutliga ECS i kronisk ECS behandling (figur 1B). Två hippocampi från varje råtta var snabbt dissekeras och utsätts för vårt optimerade småskaliga fraktionering protokoll (figur 2). Inledande Homogenatet av två hippocampi gratis av olösliga vävnad och atomkärnor (S1 fraktion) var åter centrifugeras vid 13.800 x g i 10 min till separat supernatanten innehållande lösliga cytoplasmatiska proteiner (S2 fraktion) från den råa membran pellets som innehåller synaptosomes (P2 fraktion) (figur 2). Våra Western blot upptäckt cytoplasmiska proteinet α-tubulin i S2 fraktioner, men inte P2 fraktioner, av hippocampi från råttor som behandlats med akut och kronisk ECS (figur 3 och figur 4), visar den framgångsrika fraktioneringen av cytosoliska lösliga proteiner från rå membran pellets.
PSD95 är en medlem av familjen membran-associerade stimulerare kinase (MAGUK) och en kärnkomponent i PSD12,18,25. PSD95 och NMDA receptor subenhet GluN2B upptäcktes uteslutande i P2 fraktioner, men inte S2 fraktioner (figur 3 och figur 4). Starkare uttryck för en annan glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) receptor subunit GluA2 upptäcktes i P2 fraktioner jämfört med S2 fraktioner i hippocampi (figur 3 och figur 4), indikerar att postsynaptiska membranproteiner är berikad med rå membran P2 bråkdel pellets. Intressant, upptäcktes synaptiskt vesikelprotein protein synaptophysin och integrerad membranprotein striatum berikad tyrosin fosfatas 61 (steg61)26 lika i S2 och P2 fraktioner (figur 3 och figur 4). Med tanke på den ringa storleken av synaptiska vesikler-med en genomsnittlig diameter av 39 nm27 och endosomes, centrifugeringen att isolera rå membran pelleten (P2 fraktion) kan inte ha varit tillräckligt till pellet alla synaptiska vesikler och endosomes. Tillsammans indikerar dessa resultat att vår rå fraktionering protokoll kan berika membran-bundna proteiner och transmembrana proteiner som inte är associerade med synaptic blåsor och eventuellt med endosomes i rå membran P2 fraktionen.
För att undersöka om ECS-inducerad globala behörighetshöjning aktivitet förändrar uttrycket av postsynaptiska proteiner i hippocampi, rå membran P2 bråket var lyserat i iskallt vatten, resuspended i HEPES buffert och centrifugeras vid 25 000 x g i 20 min att isolera de lyserat pellet (LP1) (figur 2). LP1 pelleten var resuspended i HEPES buffert innehållande 1% Triton x-100 rengöringsmedel och centrifugeras vid 25 000 x g över 3 h att få PSD pelleten (figur 2). Den efterföljande Western blot av PSD fraktioner upptäckt PSD95, GluN2B och GluA2 (figur 3 och figur 4), som är kända postsynaptiska proteiner17,25,28. Men PSD fraktioner saknade α-tubulin och allt presynaptiska markör synaptophysin (figur 3 och figur 4). STEG61, som defosforylerar GluN2B och GluA2 och fungerar som deras negativ regulator29,30,31, hittades inte i PSD fraktioner (figur 3 och figur 4), överensstämmer med den senaste rapporten visar synaptic uteslutandet av steg61, medieras av PSD95 berikad i PSD26. Sammantaget indikerar dessa resultat att vår småskaliga fraktionering metod framgångsrikt isolerar PSD proteiner från den råa membran P2 fraktionen.
Kvantifiering av Western blotting avslöjade att GluN2B uttryck var oförändrat i P2 fraktionen men visas en ökande trend i PSD fraktionen på 3 h och 24 h efter akut ECS (n = 4) (figur 3B). GluA2 uttryck har inte ändrats i både P2 och PSD fraktioner på 3 h och 24 h efter akut ECS (figur 3C). På 24 h och 96 timmar efter kronisk ECS, GluN2B uttryck visas en nedåtgående trend i P2 fraktionen och minskade avsevärt i PSD fraktionen (24 h: p < 0,05, n = 4; 48 h: p < 0,01, n = 4) (figur 4B). Däremot påverkade inte kronisk ECS GluA2 uttryck i P2 och PSD fraktioner (n = 4) (figur 4C).
Figur 1 : Schema för induktion av akut ECS och kronisk ECS. (A) A råtta var ansluten till en pulsgenerator via örat-clip elektroder och en elektrisk stöt (55 mA, 100 pulser/s för 0,5 s) tillämpades för att framkalla etapp 4-5 tonisk-kloniska anfall. (B) akut ECS förmåddes genom en elektrisk stöt. Kronisk ECS var framkallas av en elektrisk stöt per dag i 7 dagar. Punkter visas representerar varaktighet efter induktion av akut ECS eller den sista ECS för kronisk ECS induktion innan dissekering av hippocampi. Sham ”inga beslag” (NS) kontroll råttor sköttes identiskt men inte fick en elektrisk stöt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Arbetsflöde av subcellulär fraktionering att isolera den S2, P2 och PSD fraktioner från Hippocampi på en enda råtta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Undersökning av Synaptic proteiner i hippocampus S2, P2 och PSD fraktioner från råttorna som fick NS eller akut ECS. (A) representativa Western blotting visar det protein uttrycket av NMDA-receptorn subenhet GluN2B, AMPA receptor GluA2 och steg61 i S2, P2, och PSD fraktioner från hippocampi av sham ”inga beslag” (NS) råttor och råttor som fick akut ECS. Det cytoplasmiska lösliga proteinet α-tubulinet är berikad i S2 fraktionen. Synaptophysin är ett protein som presynaptiska vesikler och anrikas i rå membranet P2 bråkdel, men inte i PSD fraktionen. PSD-95 anrikas i både P2 och PSD fraktioner. (B-C) Kvantifiering av GluN2B (B) och GluA2 (C) i P2 och PSD fraktioner vid 3 och 24 h efter akut ECS (n = 4 råttor per tidpunkt). GluN2B och GluA2 uttryck i P2 fraktionen var normaliserade till α-Tubulin i S2 fraktionen. GluN2B och GluA2 uttryck i PSD fraktionen var normaliserade till PSD-95 i PSD fraktionen. Data presenteras som den procentiga ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Undersökning av Synaptic proteiner i hippocampus S2, P2 och PSD fraktioner från råttorna som fick NS eller kronisk ECS. Representant Western blotting av α-tubulin; synaptophysin; STEG61; och postsynaptiska proteiner, inklusive PSD95, GluN2B och GluA2, i S2, P2 och PSD fraktioner från hippocampi av sham ”inga beslag” (NS) råttor och råttor som fick kronisk ECS. Det cytoplasmiska lösliga proteinet α-tubulinet är berikad i S2 fraktionen. Synaptophysin är ett protein som presynaptiska vesikler och anrikas i rå membranet P2 bråkdel, men inte i PSD fraktionen. PSD-95 anrikas i både P2 och PSD fraktioner. (B-C) Kvantifiering av GluN2B (B) och GluA2 (C) i P2 och PSD fraktioner på 24 och 96 h efter kronisk ECS (n = 4 råttor per tidpunkt). GluN2B och GluA2 uttryck i P2 fraktionen var normaliserade till det α-tubulinet i S2 fraktionen. GluN2B och GluA2 uttryck i PSD fraktionen var normaliserade till PSD-95 i PSD fraktionen. Data presenteras som procent ± SEM; * p < 0,05, ** p < 0,01 jämfört med kontroll (ANOVA och Tukey's post hoc- test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fraktion | Proteinfraktion | Protein markör |
| P1 | Kärnkraft | Histon H1 |
| S1 | Cytosol/membrances | a-tubulin (cytoskelettet) och GAPDH (cytosol) |
| P2 | Rå synaptosomes | AMPA och NMDA receptor subenheter |
| S2 | Cytosol/ljus membrances | GAPDH (cytosol) och LAMP1 (Lysosomen) |
| Synaptosomal membran | Synaptosome/mitokondrier | AMPA och NMDAR-receptorn subenheter, Synaptophysin (presynaptiska markör) |
| PSD | PSD | AMPA och NMDA receptor subenheter, PSD95, PICK1, Chytridiomycota |
Tabell 1: Lista av Protein markörer och antikroppar för att skilja subcellulär fraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett ECS induktion metod hos råttor som framkallar den globala stimuleringen av neuronal aktivitet i deras hippocampi. ECS är en djurmodell för elektrokonvulsiv terapi, som används kliniskt för behandling drog behandlingsresistenta depressiva störningar i människor1,2,3. Trots användning av elektrokonvulsiv terapi för att behandla svår depression, oklar den exakta underliggande mekanismen. Eftersom ECS inducerar anti-depressant-liknande beteenden hos gnagare och stimulerar Hippocampus neurogenes4,32, ECS har använts i stor utsträckning att undersöka om ny vuxen-född nervceller i dentate gyrus i hippocampus bidra till anti-depressiva beteende5,32.
ECS inducerar mild till svår generaliserade tonisk-kloniska anfall hos gnagare vid nuvarande leverans via stereotaxically implanterade elektroder, korneal elektroder eller örat-clip elektroder33,34. EEG inspelningar hos patienter har visat att bilaterala elektrisk stimulering orsakar mer framträdande och längre generaliserade anfall än unilateral stimulering gör35,36. I vår ECS induktion metod induceras tonisk-kloniska anfall av aktuella leveransen genom noninvasiv öra-klipp elektroder kopplade till båda öronen, härma anfall hos människor som frammanade genom bilateral stimulering36. Även om vi inte har kollat effekten av ECS i råttor som sedering eller anestesi tillämpas, är det möjligt att ge narkos droger till råttorna skulle kunna minska graden av krampanfall framkallas genom elektrisk stimulering, som kan vara på grund av att anestesi är fysiologiskt associerade med förbättrad hämmande och dämpade excitatoriska ton i hjärnan nätverket. Det kritiska steget i metoden ECS induktion är dessutom att experimentellt ringa nuvarande intensiteten för att framkalla etapp 4-5 generaliserade tonisk - kloniska anfall baserat på ålder, vikt och arter av gnagare. Vår ECS induktion metod har optimerats för att inducera etapp 4-5 anfall inom ett par sekunder i vaken manliga Sprague-Dawley-råttor som väger 200-250 g. Om råttorna under anestesi stat används för ECS induktion, bör intensitet, varaktighet och frekvens av leverera nuvarande ändras för framgångsrika induktion av beslag från steg 4 till 5.
ECS erbjuder också fördelen med stimulerande hyperaktivitet i nervceller och orsakar akut övergående anfall med mycket låg dödlighet33, i motsats till chemoconvulsants, inklusive pilokarpin och kainit, som framkalla status epilepticus och orsaka kroniska manifestationen av spontana återkommande anfall och allvarliga histologiska förändringar37,38. Även om ECS har använts rutinmässigt till skärmen antiepileptika33,34, akut ECS och kronisk ECS resulterar inte i generation av kronisk epilepsi och därmed kan inte användas i en djurmodell för att studera epileptogenes. I stället har ECS allmänt använts för att undersöka i vilken utsträckning som bred höjden av hjärnans aktivitet förändrar uttryck eller posttranslationell modifieringar av synaptic proteiner i vivo, som bidrar till bestående förändringar i synaptic styrka och strukturer (figur 3 och figur 4)10,40. I denna studie används vi endast hanråttor för att utesluta de oväntade effekterna av brunstigheten cykel fas hos honråttor på mängden PSD protein efter ECS. Det observerades dock att det finns ingen sex skillnad i byggnadsställningar proteiner, inklusive PSD-95 och SAP102 i regionen PSD i den främre hjärnbarken och hippocampus39, vilket innebär att hormonella förändringar styr estrus cykel inte kan påverka den basala mängden PSD proteiner.
Flera metoder har använts för att undersöka i vilken utsträckning som ECS inducerar förändringar i neurogenes och synaptogenes synaptisk plasticitet5,6,7,8,9, 11 , 40. elektrofysiologiska inspelningar av excitatoriska postsynaptiska ström (EPSC) ofta används för att upptäcka förändringar i glutamaterg excitatoriska synaptisk styrka synapser21. Till exempel har miniatyr EPSC inspelningar avslöjat den homeostatiska nedskalning av excitatoriska synaptisk styrka i kortikala pyramidala nervceller av lager II-III av möss efter akut ECS41. Identifiering av synaptic proteiner som bidrar till ECS-inducerad synaptisk plasticitet är dock utmanande eftersom elektrofysiologiska inspelningar måste paras ihop med den genetiska knockout eller knock-down av specifika kandidat synaptic proteiner. Förändringar i nivån på glutamatreceptorer på postsynaptiska membranet och synaptic proteiner anrikade med PSD reglera styrka och effekt av excitatoriska synaptisk transmission17,18,25. Även om immunohistokemi kan användas för att undersöka ECS-inducerade förändringar i uttrycket av synaptic proteiner, denna teknik kan undersöka endast 1-2 kandidat synaptic proteiner på en tid och kräver väl validerade antikroppar som specifikt känner igen dem utan orsakar icke-specifik färgning.
Den subcellulär fraktioneringen av hjärnvävnad i kombination med Western blotting erbjuder fördelar över elektrofysiologi och immunohistokemi att identifiera synaptic proteiner som ändras av ECS. Den subcellulär fraktioneringen av hjärnvävnaden är en snabb och rå biokemisk metod att separera lösliga cytosoliska proteiner (S2 fraktion) från rå membran (P2 fraktion), inklusive ER och Golgi membran, membran-bundna organeller, plasma membran, och Synaptic terminal membran som återförsluta till formuläret synaptosomes42,43,44. PSD fraktionen kan vara ytterligare isolerad från P2 bråket att berika de synaptic proteiner42,43,44. Opartisk proteomiska analysen i bråket som PSD kunde identifiera alla PSD proteiner vars nivåer ändras med ECS. Western blotting kan utföras snabbt för att undersöka uttrycket ändringarna av PSD proteinerna, som lätt kan identifieras från icke-specifika band.
Den tidigare metoden för hjärnan fraktionering kräver en stor mängd gnagare hjärnan vävnad42,43,44, att göra denna teknik utmanande för användning vid prövningen av lösliga eller membranproteiner individ gnagare hjärnan eller en specifik hjärnregionen från en enda hjärna. Det finns en ökande efterfrågan att kvantitativt jämföra proteomet från en hjärna region till en annan och från en kontroll djur till en transgena djur eller djur som har genomgått en särskild behandling. Vi har därför reviderat och optimerad metoden traditionella hjärnan fraktionering för att isolera rå lösliga och membran fraktioner från två hippocampi på en enda råtta. Vårt småskaliga rå fraktionering protokoll framgångsrikt isolerade rå P2 membran fraktioner från cytosoliska S2 lösliga fraktioner, som indikeras av avsaknaden av cytoplasmisk proteinet α-tubulin i P2 fraktioner, medan membran-bundna PSD95 upptäcktes i den P2 men inte S2 fraktioner (figur 3A och figur 4A). Med metoden som beskrivs här, har vi kvantitativt visat att akut ECS avsevärt ökar steg61 uttryck och minskar tyrosin fosforylering av dess substrat, GluN2B och den extracellulära signal-reglerade Kinas 1/2 i rå membranet P2 bråkdel av råtta hippocampi på 48 h efter akut ECS10.
Oväntat, S2 fraktioner innehöll synaptophysin; STEG61; och, i mycket mindre utsträckning, GluA2 (figur 3A och figur 4A). STEG61 är en glykosylerat integrerad membran protein26 samband med endoplasmatiska nätverket (ER) och PSD45. Det är möjligt att centrifugeringen att isolera rå membran pelleten (P2 fraktion) inte kan ha varit tillräckligt till pellet alla synaptiska vesikler innehållande synaptosomes, liksom endosomes och lysosomer som innehåller GluA2 och steg61. Dock klart anrikningen av GluN2B, GluA2 och PSD95 och avsaknaden av α-tubulin i P2 fraktioner indikerar att vårt fraktionering protokoll kan berika membran-bundna proteiner och transmembrana proteiner som inte är associerade med synaptic blåsor och endosomes i rå membran P2 fraktionen.
Även om den råa membran P2 fraktionen innehåller synaptosomes, är en begränsning av undersökande aktivitet-beroende förändringar av synaptic proteiner i P2 fraktionen att den exakta platsen för deras ändringar inte kan fastställas. Om synaptic proteiner anrikade med PSD skulle bestämmas, kan sedan ytterligare biokemiska fraktionering användas för att isolera PSD. Den tidigare metoden för PSD fraktionering kräver en stor mängd gnagare hjärnvävnaden (dvs. 10-20 gnagare hjärnor) och sackaros övertoningar42,43,44. Eftersom denna traditionella metod är otillräckliga för att isolera en tillräcklig mängd av den PSD fraktionen från två hippocampi på en enda råtta, har vi anpassat en enklare metod som direkt isolerar den PSD fraktionen, utan en sackaros lutning20,21 . Denna metod ger om 30-50 µg av proteinet PSD, som är tillräcklig för flera biokemiska analyser, inklusive Western blotting. Vår metod berikar PSD95, GluN2B och GluA2, som är kända för att vara koncentrerade i PSD fraktionen och identifierar ändringar i GluN2B uttryck i PSD bråkdel efter kronisk ECS induktion (figur 3 och figur 4).
Här, visade vår kvantitativa Western blot-analys ingen signifikant förändring i GluA2 uttryck i P2 och PSD fraktioner på 3 h och 24 h efter akut ECS (figur 3C). GluN2B uttrycket var oförändrat i P2 fraktionen men visas en ökande trend i PSD fraktionen på 3 h och 24 h efter akut ECS (figur 3B), vilket tyder på möjliga differential regleringen av synaptic kontra extrasynaptic GluN2B-innehållande NMDA-receptorer. Vi observerade också att GluN2B uttryck visas en nedåtgående trend i P2 fraktionen efter kronisk ECS och minskade avsevärt i PSD fraktionen på 24 och 96 h följande kronisk ECS (figur 4B). Men mycket spekulativa, kan sådan borttagning av GluN2B från PSD efter repetitiva induktion av ECS förmedlas genom flera mekanismer, inklusive direkta internalisering från PSD membran eller lateral diffusion till extrasynaptic platser. Med tanke på vår tidigare rapport att långvarig förstärkning av neuronal aktivitet markant ökar steg61 uttryck och minskar Tyr-fosforylering av GluN2B i P2 fraktioner av odlade Hippocampus nervceller46, våra fynd tyder att en minskning av GluN2B uttryck i P2 och PSD fraktioner efter kronisk ECS sannolikt beror på förbättrad steg61 uttryck och det efterföljande avlägsnandet av GluN2B från det extrasynaptic membranet.
Sammanfattningsvis har vi visat att vår småskaliga PSD fraktionering metod, i kombination med ett ECS induktion protokoll, tillåter oss att differentiera i vivo aktivitet-anhörigen regleringen av glutamatreceptorer på det postsynaptiska membranet kontra totalt plasma membran, inklusive extrasynaptic membran. Detta protokoll kan enkelt appliceras på någon synaptic proteiner vid retande synapser och kan ändras för andra gnagare hippocampi eller andra regioner i hjärnan genom att justera volymen för varje lösning baserad på vävnad vikten. Således vår småskaliga PSD fraktionering metod är mångsidig och kan antas för framtida tillämpningar att undersöka förändringar i vivo i postsynaptiska proteinerna i varje djur vid genetiska, farmakologiska eller mekanisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Eric C. Bolton för att tillåta oss att använda hans centrifug för fraktionering och Dr Graham H. Diering i Dr Richard L. Huganir lab vid John Hopkins University för att förse oss med småskaliga protokollet för den PSD fraktioneringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
