Summary
Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie für schwere Depressionen. ECS stimuliert weltweit Aktivität im Hippocampus, führt zu Synaptogenese und synaptische Plastizität. Hier beschreiben wir Methoden für ECS Induktion bei Ratten und subzellulären Fraktionierung von ihren Hippocampi, Beschlagnahme verursachten Veränderungen in synaptischen Proteine zu untersuchen.
Abstract
Elektrokrampftherapie Beschlagnahme (ECS) ist ein experimentellen Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die effektivste Behandlung für schwere Depressionen. ECS generalisierte Stärkungsmittel-klonischen Anfällen mit niedrigen Mortalität und neuronalen Tod induziert und ist eine weit verbreitete Modell Bildschirm antiepileptische Drogen. Hier beschreiben wir eine ECS-Induktion-Methode in die kurze 55 mA Strom für 0,5 geliefert wird s zu männlichen Ratten 200-250 g Gewicht über Ohr-Clip-Elektroden. Diese bilaterale Stimulation produziert Stufe 4-5 klonische Anfällen, die dauerte ca. 10 s. Nach der Einstellung der akuten oder chronischen ECS Schein die meisten Ratten erholt, um Verhalten von nisht zu unterscheidend werden "keine Beschlagnahme" Ratten. Da ECS weltweit erhöht die Aktivität des Gehirns, dient es auch aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Proteine und deren Auswirkungen auf synaptische Stärke mit mehreren Methoden zu untersuchen. Insbesondere kann subzellulären Fraktionierung der postsynaptischen Dichte (PSD) in Kombination mit Western blotting für die quantitative Bestimmung der Fülle der synaptischen Proteine bei dieser spezialisierten synaptischen Struktur. Im Gegensatz zu früheren Fraktionierung-Methode, die große Menge an Nagetier Gehirne erfordert, beschreiben wir hier eine kleine Fraktionierung-Methode, um die PSD von Hippokampi einer einzigen Ratte ohne Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung isoliert. Mit dieser Methode zeigen wir, dass die isolierte PSD Bruchteil postsynaptischen Membranproteine, einschließlich PSD95, GluN2B und GluA2 enthält. Präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin wurden von der PSD-Bruch, zeigen erfolgreiche PSD Isolierung ausgeschlossen. Darüber hinaus verringerte chronische ECS GluN2B Ausdruck in der PSD, die darauf hinweist, dass unsere kleine PSD Fraktionierung Methode angewendet werden kann, um die Änderungen im Hippokampus PSD Proteine aus einer einzigen Ratte nach genetischen, pharmakologische oder mechanische Behandlungen zu erkennen .
Introduction
Elektrokrampftherapie wurde zur Behandlung von Patienten mit großen depressive Störungen, einschließlich schweren Medikamenten-resistenten Depression, bipolare Depression, Parkinson Erkrankungen und Schizophrenie1,2. In dieser Therapie wird Beschlagnahme durch elektrische Impulse geliefert an den Leiter der narkotisierten Patienten über Epicranial Elektroden1,2,3erzeugt. Wiederholte Gabe von ECS wurde klinisch vorteilhaft für resistente depressive Störungen1,2,3. Der genaue Mechanismus zugrunde liegt die langfristige Wirksamkeit der antidepressiven Wirkung beim Menschen blieben jedoch schwer. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie und ist weit verbreitet, seine therapeutischen Mechanismus zu untersuchen. Bei Nagetieren akute ECS und ECS Langzeitbehandlung Förderung der adulten Neurogenese in den Hippocampi und reorganisieren der neuronalen Netzwerk4,5, kognitive Flexibilität zu Verbesserungen beitragen dürfte. Darüber hinaus ändert globale Erhöhung der Aktivität des Gehirns von ECS die Fülle der Transkripte, wie eine Gehirn neurotropic Faktor6und mehrere Proteine, einschließlich metabotropen Glutamat-Rezeptor 17 und N-Methyl-D-Aspartat-abgeleitet (NMDA) Typ Glutamat-Rezeptor-Untereinheiten7. Diese Änderungen sind bei der Vermittlung von langfristigen Veränderung der Synapse Nummer, Struktur und Stärke im Hippocampus7,8,9beteiligt.
ECS-Modelle ist elektrischer Stimulation an Nagetieren per stereotaxically implantierte Elektroden, Hornhaut Elektroden oder Ohrelektroden zu evozieren generalisierten Stärkungsmittel-klonischen Anfällen10,11geliefert. Stereotaktischen Implantation von Elektroden beinhaltet Gehirnchirurgie und erfordert viel Zeit zur Verbesserung der Experimentator chirurgischen Fähigkeiten um Verletzungen zu minimieren. Weniger invasiven Hornhaut Elektroden könnte Korneaabnutzung und Trockenheit verursachen und erfordern Anästhesie. Die Verwendung von Ohr-Clip Elektroden umgeht diese Einschränkungen, weil sie auf Nagetiere ohne Chirurgie oder Anästhesie verwendet werden können und nur minimale Verletzungen verursachen. In der Tat fanden wir, dass aktuelle gelieferten zu wach Ratten über Ohr-Clip Elektroden zuverlässig induziert Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen und synaptischen Proteine in ihrer Hippokampi10verändert.
Um die ECS-induzierte Fülle der synaptischen Proteine in bestimmten Gehirnregionen von den Nagetieren zu untersuchen, ist es wichtig, die experimentellen Methoden zu wählen, die am besten geeignete für ihre Erkennung und Quantifizierung. Subzellulären Fraktionierung des Gehirns ermöglicht für die grobe Lokalisierung der löslichen cytosolischen Proteine; Membranproteinen; Organell-Grenzen Proteine; auch Proteine in speziellen subzellulären Strukturen, wie z. B. die PSD12,13,14. Die PSD ist eine Dichte und gut organisierte subzelluläre Domain in Neuronen in denen synaptischen Proteine hochkonzentriert an und in der Nähe der postsynaptischen Membran12,13,15 sind. Die Isolation der PSD eignet sich für die Untersuchung von synaptischen Proteinen angereichert an der PSD, da dynamische Änderungen in die Fülle und die Funktion der postsynaptischen Glutamatrezeptoren, Gerüstbau Proteine und Signal Transduction Proteine in der PSD-12 , 15 , 16 , 17 sind korreliert mit synaptische Plastizität und die Synaptopathy in mehrere neurologische Störungen17,18beobachtet. Eine vorherige subzellulären Fraktionierung-Methode verwendet, um die PSD zu reinigen beteiligt die Isolation der Waschmittel-unlösliche Fraktion aus Roh Membran Bruchteil des Gehirns durch die differentielle Zentrifugation von Saccharose Steigungen14, 19. die größte Herausforderung bei dieser traditionellen Methode ist, dass es erfordert große Mengen von Nagetier Gehirne14,19. Vorbereitung von 10-20 Nagetiere zu isolieren, die PSD-Fraktion pro Behandlung erfordert umfangreiche Kosten- und Zeitaufwand und ist nicht praktisch durchführbar, wenn es viele Behandlungen gibt.
Um diese Herausforderung zu meistern, haben wir eine einfachere Methode angepasst, die direkt den PSD-Bruch ohne Saccharose Steigung Zentrifugierung20,21, isoliert und überarbeitet um auf PSD-Isolierung aus der Hippocampi einer einzigen Ratte anwendbar Gehirn. Unsere kleine PSD-Fraktionierung-Methode führt zu über 30-50 µg der PSD Proteine aus 2 Hippokampi, ausreichend für den Einsatz in mehreren biochemischen Tests, einschließlich Immunopräzipitation und westliche Beflecken. Westliche Beflecken, zeigt den Erfolg unserer Methode zur Isolierung von der PSD durch die Enthüllung der Bereicherung der postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD-95) und der Ausschluss von präsynaptischen Marker Synaptophysin und lösliche zytoplasmatischen Protein α-Tubulin. Unsere ECS Induktion und kleine PSD Fraktionierung Methoden sind leicht anpassbar an anderen Nagetier Gehirnregionen und bieten eine relativ einfache und zuverlässige Möglichkeit zur Bewertung der Auswirkungen von ECS auf die Expression von Proteinen, PSD.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren einschließlich tierische Themen wurden von der institutionellen Tiere kümmern und Nutzung hat an der University of Illinois at Urbana-Champaign genehmigt.
1. die Aufrechterhaltung einer Ratte-Kolonie
- Züchten Sie Sprague-Dawley Ratten (siehe die Tabelle der Materialien) zu und pflegen sie in standard-Bedingungen mit 12-h-hell-dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
- Entwöhnen Sie die Ratte-Welpen an postnatalen Tag (P) 28 zu und beherbergen sie in Gruppen von 2-4 männlich oder weiblich Wurfgeschwistern.
- Markieren Sie die Schwänzen von männlichen Ratten mit einem ungiftigen Permanentmarker Schwarz zur Identifikation.
- Wiegen der männlichen Rats 3 Mal pro Woche, und notieren Sie ihre Körpergewichte.
2. Vorbereitung einer ECS-Maschine
- 07:30 desinfizieren der Bank in den tierischen Vorbereitungsraum und eine ECS-Maschine (Impulsgeber) auf der Bank Platz.
- Legen Sie eine einzelne männliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g in einem sauberen, leeren Käfig mit einem Deckel. Wiederholen Sie dies für alle männlichen Ratten mit ECS Induktion behandelt werden. Lassen Sie die Ratten für 30 min zu gewöhnen.
- Während die Ratten in ihren Käfigen förderliche sind, legen Sie Impulsgeber für ECS Induktion auf die Frequenz von 100 Impulse/s, eine Pulsbreite von 0,5 ms, eine Schock-Dauer von 0,5 s und einem Strom von 55 mA (Abb. 1A).
- Bereiten Sie den Impulsgenerator durch Drücken der Taste "RESET" und sicherzustellen, dass die "READY"-Taste leuchtet. Stellen Sie sicher, dass die Ohr-Clips nicht mit einem Impulsgenerator verbunden sind und dann drücken Sie den "Schock" für ein paar Sekunden.
Hinweis: an dieser Stelle ist der Impulsgeber für ECS Induktion bereit. - Stecken Sie die Ohr-Clips in den Impulsgenerator.
(3) Induktion von akuten ECS
Hinweis: Siehe Abbildung 1B, Oberseite.
- Die Ohr-Clips mit steriler Kochsalzlösung nass und stellen Sie sicher, dass sie gesättigt sind.
- Befeuchten Sie eine Ratte in den Ohren mit steriler Kochsalzlösung durch Umwickeln sie in Kochsalzlösung getränkten Gaze. Sobald sie nass sind, entfernen Sie die Gaze.
- Befestigen Sie einen Clip pro Ohr, Position jenseits der wichtigsten Knorpel-Band.
- Bestätigen Sie auf der ECS-Maschine, dass eine wahre Schleife entsteht; Wenn dies nicht der Fall ist, erscheint eine Fehlermeldung oder eine Lesung von "1" auf dem Computer.
- Tragen Sie einen dicken, Nichtmetall Handschuh. Halten Sie die Ratte sanft in einer behandschuhten Hand, drücken Sie den "Schock" für ein paar Sekunden und lassen Sie langsam den Griff auf die Ratte, die Beschlagnahme zu beobachten los. Für die Farce "keine Beschlagnahme" (NS) kontrollieren, Ratte gleich zu behandeln aber nicht den Strom liefern.
- Trennen Sie die Ohr-Clips als Klonus beginnt und erfassen die Beschlagnahme Verhalten nach einer überarbeiteten Racine Skala22 , die "Mund- und Gesichts-Bewegungen" (Stufe 1), "Kopf nicken" (Stufe 2), "Vordergliedmaße Klonus" enthält (Stufe 3), "Aufzucht mit Vordergliedmaße Klonus" (Stufe 4), und "Aufzucht und Vordergliedmaße Klonus verliebt" (Stufe 5). Die Beschlagnahme dauert ca. 10 s; Notieren Sie die Beschlagnahme Dauer mit Hilfe eines Timers.
- Nach der Aufhebung der Beschlagnahme die Ratte zurück zu seinem Hause Käfig. Überwachen Sie die Ratte für weitere 5 min um sicherzustellen, dass die Erholung der Ratte von den Anfällen. Halten Sie es einzeln in den Käfig untergebracht und wieder den Käfig in den Aufwachraum.
- Wiederholen Sie die ECS-Induktion auf die nächste Ratte.
- Überwachen Sie die Ratten für den Rest des Tages und mindestens einmal morgens und einmal am Nachmittag des Folgetages bis sie für Experimente eingeschläfert werden.
Hinweis: Die ECS Induktionsmethode klinischen Symptome als gelegentliche Nebenwirkung, könnten die Aufmerksamkeit erfordert. Beispielsweise könnte das ECS-Induktion-Protokoll Anfälle auslösen, die länger als 15 s und verursachen unnötige Notlage für die Ratten. In diesem Fall kündigen Sie die Beschlagnahme mit Diazepam (10 mg/kg, i.p.) oder Pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Wenn die Ratten Atemnot oder schweren Verhaltens-Auffälligkeiten nach Beschlagnahme Einstellung entwickeln, einschläfern sie durch Kohlendioxid einatmen gefolgt durch Enthauptung.
(4) Induktion von chronischen ECS
Hinweis: Siehe Abbildung 1B, Bodenplatte.
- Induzieren Sie eine ECS täglich zur gleichen Zeit am Morgen in den Schritten 1-3, oben beschriebenen, für sieben aufeinander folgende Tage.
- Monitor die Ratten Käfige zweimal einen Tag, nachdem sie in ihre Heimat zurückgekehrt sind.
5. Homogenisierung und Fraktionierung der Ratte Hippocampi
Hinweis: Siehe Abbildung 2.
- Bereiten Sie einen frisches Homogenisierung Puffer (Lösung A), Saccharose 320 mM, 5 mM Natrium Pyrophosphat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4 enthält, 200 nM Okadaic Säure- und Protease-Inhibitoren. Sterilisieren Sie den Puffer mit Filter mit einer 0,22 µm Porengröße für Vakuumfiltration Filter zu und legen Sie es auf dem Eis.
- Zu einem bestimmten Zeitpunkt Punkt nach ECS akute oder chronische ECS (Abbildung 1), die Ratte von CO2 Inhalation für 5-10 min, gefolgt von Enthauptung mit einer Guillotine einschläfern.
- Entfernen Sie das Gehirn und sezieren Sie die Hippocampi auf der Metallplatte auf Eis gelegt, wie zuvor beschrieben23,24.
- Legen Sie zwei Hippokampi von einer Ratte auf ein 30-mm-Gewebe-Kultur-Speise- und sie mit einer Schere in kleine Stücke hacken.
- Übertragen Sie Hackfleisch / Hippokampi auf eine manuelle Glas-Homogenisator mit einer 1 mL-Pipette und 1 mL eiskaltes Homogenisierung Puffer (Lösung A, Schritt 5.1). Legen Sie eine Runde Stößel in ein Glas-Homogenisator. Während die Glas-Homogenisator auf Eis, streicheln Sie sanft und gleichmäßig rauf und runter auf den Stößel 10 - 15 Mal für 1 min, bis kleine Stücke des Hippokampus Gewebe verschwinden.
- Übertragen Sie das Homogenat auf einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette und Zentrifugieren Sie Homogenat 800 X g für 10 min bei 4 ° C, die postnukleare überstand (S1 Bruch) zu trennen von der Pellet mit unlöslichen Gewebe und Kerne (P1-Bruch). Übertragen Sie 50 µL und 950 µL der S1-Fraktion auf zwei separate, neue 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit einer 1 mL-Pipette und speichern Sie diese Rohre auf Eis. Speichern Sie das P1 Bruchteil Pellet auf Eis.
- Zentrifugieren den S1-Bruch (950 µL) für 10 min bei 13.800 x g und 4 ° C, den überstand (S2 Bruch), angereichert mit cytosolischen lösliche Proteine zu trennen und das Pellet (P2 Bruch), angereichert mit Membran-gebundene Proteine, einschließlich synaptosomal Proteine. Übertragen Sie die S2-Fraktion auf eine neue 1,7 mL Microcentrifuge mit einer 1-mL-Pipette und speichern Sie es auf dem Eis.
- Aufzuwirbeln Sie das Pellet (P2 Bruch) in 498 µL eiskaltes gereinigtes Wasser mit einer 1-mL-Pipette. Fügen Sie 2 µL 1 M HEPES (pH 7,4) mit einer 20 µL Pipette, um eine Endkonzentration von 4 mM HEPES (pH 7,4) zu erreichen. Inkubieren Sie bei 4 ° C mit Agitation für 30 min. laden die resuspendierte P2-Fraktion auf Eis.
- Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der S1, S2 und P2 Fraktionen mit einem BCA-Assay. Jede Fraktion zu erreichen eine Konzentration von 1 mg/mL und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren 50 mM HEPES (pH 7,4) hinzufügen oder Bearbeiten der P2-Fraktion um die PSD zu isolieren.
6. Isolierung der PSD aus dem Roh Membran Proteinfraktion (P2)
- Zentrifugieren Sie den P2-Bruch (500 µL) für 20 min bei 25.000 x g und 4 ° C der lysierten überstand (LS2 Bruch) und lysierten Pellet (LP1 Bruch) zu trennen. Übertragen Sie den LS2-Bruch zu einem neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1 mL-Pipette und speichern Sie es auf dem Eis.
- Aufschwemmen Sie LP1 Pellet in 250 µL 50 mM HEPES (pH 7,4) gemischt mit 250 µL 1 % Waschmittel in 1 x PBS-Puffer mit einer 1 mL-Pipette. Bei 4 ° C mit sanften Agitation für 15 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die resuspendierte LP1-Pellet für 3 h bei 25.000 x g und 4 ° C, den überstand (Bruch-PSD) von Pellet (PSD Bruch) zu trennen. Den Überstand zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch entfernen und Aufschwemmen der PSD Pellet in 100 µL 50 mM HEPES (pH 7,4) mit einer 200 µL Pipette.
- Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins der LS2-PSD und PSD Brüche mit einem BCA-Assay. Jede Fraktion zu erreichen eine Konzentration von 1 mg/mL und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren fügen Sie 50 mM HEPES (pH 7,4 hinzu).
Hinweis: Alle Lösungen für die Schritte 5 und 6 (d. h. Lösung A, HEPES-Puffer und PBS-Puffer) sollten mit gereinigtem Wasser frei von ionischen und organischen Verunreinigungen und Partikel erfolgen.
(7) Western Blotting
- Jede Proteinfraktion auf Eis auftauen. Übertragen Sie 12 µL der einzelnen Fraktionen (S2, P2 und PSD in 1 mg/mL) auf einen neuen 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch mit einem 20-µL Pipette.
- Fügen Sie 3 µL 5 X SDS-Probenpuffer und bei 75 ° C für 30 min im Wasserbad inkubieren. Kühlen Sie die Probe auf Raumtemperatur (RT).
- Laden Sie 10 µL der Probe Protein in jede Vertiefung von 4-20 % Steigung 15-Well-Kamm SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Gel mit einer 20 µL Pipette. Führen Sie das Gel in der SDS-PAGE-Apparat und bei 80-100 V im laufenden Puffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 0,1 % SDS; pH 8,3).
Hinweis: Jedes Gel sollte Proteinproben von NS-Ratten und ECS Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten nach akuter oder chronischer ECS enthalten. - Transfer die Proteine aus der SDS-PAGE gel auf eine Membran polyvinyl Difluoride (PVDF) in den Transfer-Apparat bei 25-30 V (60 mA) für 9-12 h im Transfer-Puffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin und 20 % Methanol; pH 8,3).
- Entfernen Sie die PVDF-Membran aus dem Transfer-Gerät zu und waschen Sie es in Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) für 5 min auf ein Mehrzweck-Rotator bei RT
- Blockieren der Membran in 5 % Milch und 0,1 % Tween-20 in TBS für 1 h inkubieren sie in primären Antikörper (Tabelle 1) waschen Puffer (1 % Milch und 0,1 % Tween-20 in TBS) über Nacht auf ein Mehrzweck-Rotator bei 4 ° C (siehe Tabelle der Materialien für Verdünnungen).
- Die Membran 4 Mal für 10 min in Waschpuffer waschen und inkubieren Sie es dann mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper in Waschpuffer für 1 h auf ein Mehrzweck-Rotator bei RT
- Waschen Sie die Membran 4 Mal für 10 min in Waschpuffer und dann mit TBS für 5 Minuten.
- Inkubieren Sie die Membran mit verstärkten Chemifluorescence Substrat für 1 min und setzen sie auf Röntgenfilm. Entwickeln Sie den belichteten Film mit einem Film-Prozessor.
(8) Quantifizierung des Western Blots
- Der Western blot als TIFF-Datei und speichern Sie diese Datei auf den Computer zu scannen.
- Öffnen Sie die Western-Blot-Datei in das Programm ImageJ als Graustufenbild, unter "Datei", "Bild öffnen," Pfeil nach rechts "Graustufen."
- Wählen Sie das rechteckige Auswahlwerkzeug aus der ImageJ-Symbolleiste und zeichnen Sie ein Rechteck, das eine einzelne Western-Blot-Band eines Proteins des Interesses abdeckt.
- Treffen Sie unter "Analyze" "Maßnahme" um die Gegend und der mittleren Dichte einer ausgewählten Band zu erhalten.
- Bewegen Sie das Rechteck auf ein Hintergrundbereich ohne Änderung seiner Größe und Form. Wiederholen Sie Schritt 8.4 zu der mittleren Dichte des Hintergrunds und der Umgebung.
- Subtrahieren Sie den mittleren Dichte-Wert einer Hintergrund-Band von der Western-Blot-Band, die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte des Proteins des Interesses zu geben.
- Wiederholen Sie die Schritte 8,2-8,6 für alle Western-Blot-Bänder von Interesse.
- Teilen Sie die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte des Proteins des Interesses durch die Hintergrund-subtrahiert Band Dichte von einem Zimmermädchen Genprodukt, z. B. α-Tubulin; Dieser Schritt führt zu den normalisierte Wert des Proteins des Interesses.
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Representative Results
Mit dem detaillierten Verfahren präsentiert hier einen elektrischen Schlag (55 mA, 100 Impulse/s für 0,5 s) über die Ohr-Clip Elektroden induzierten einmalige Bühne 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen bei Ratten (Abbildung 1A-B) geliefert. Insgesamt 8 von Ratten akute ECS Induktion empfangen und angezeigt Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen. Die Anfälle dauerten ca. 10 s und alle Ratten, die innerhalb von 1-2 Minuten Beschlagnahme Einstellung wiederhergestellt. Sham "keine Beschlagnahme" Ratten erhielten einen Stromschlag und Anfälle wurden daher nicht angezeigt. Insgesamt 4 Schein Ratten dienten. Für chronische ECS Induktion die Ratten erhielt einen elektrischen Schlag pro Tag an 7 aufeinanderfolgenden Tagen und Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen bei jedem Stromschlag (Abbildung 1A-B) angezeigt. Insgesamt 8 von Ratten erhielt chronische ECS Induktion und insgesamt 4 Schein Ratten dienten als "keine Beschlagnahme" Ratten. Obwohl die meisten Ratten, die chronische ECS erhielt verhaltensrelevanten nisht zu unterscheidend waren von sham "keine Beschlagnahme" Ratten, ein paar entwickelten Körper zittern und reduzierte explorative Tätigkeit durch die 7th elektrischen Schlag.
Um zu untersuchen ob ECS-induzierte globale Erhöhung der Aktivität Protein-Expression in den Hippocampi ändert, wurden Ratten bei 3 h und 24 h nach akuten ECS und bei 24 h und 96 h nach der letzten ECS in ECS Langzeitbehandlung (Abbildung 1B) geopfert. Beiden Hippokampi von jede Ratte wurden rasch seziert und unsere optimierten kleinräumige Fraktionierung Protokoll (Abbildung 2). Die anfängliche Homogenat von beiden Hippokampi frei von unlöslichen Gewebe und Kerne (S1 Bruch) wurde bei 13.800 x g für 10 min bis zum Trennen des Überstands mit löslichen zytoplasmatischen Proteinen (S2 Bruch) aus Roh Membran Pellet mit erneut zentrifugiert Synaptosomes (P2 Bruch) (Abbildung 2). Unsere Western-Blot detektiert zytoplasmatischen Proteinen α-Tubulin in der S2-Brüche, aber nicht die P2-Fraktionen, der Hippokampi von Ratten, die mit akuten und chronischen ECS (Abbildung 3 und Abbildung 4), behandelt zeigen die erfolgreiche Fraktionierung von cytosolischen lösliche Proteine aus Roh Membran Pellets.
PSD95 ist ein Mitglied der Familie membranassoziierten Guanylate Kinase (MAGUK) und eine Kernkomponente von PSD12,18,25. PSD95 und NMDA-Rezeptor-Untereinheit GluN2B wurden ausschließlich in der P2-Brüche, aber nicht die S2-Fraktionen (Abbildung 3 und Abbildung 4) erkannt. Stärkeren Ausdruck einer anderen glutamatergen α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA) Rezeptor-Untereinheit GluA2 wurde in den P2-Fraktionen im Vergleich zum S2-Fraktionen in den Hippocampi (Abbildung 3 und Abbildung 4), erkannt. darauf hinweist, dass postsynaptischen Membranproteine in den rohen Membran P2 Bruchteil Pellets angereichert sind. Interessanterweise wurden synaptischen Vesikel Protein Synaptophysin und integrale Membranprotein striatalen bereichert Tyrosin Phosphatase 61 (Schritt61)26 in den S2 und P2 Fraktionen (Abbildung 3 und Abbildung 4) gleich erkannt. In Anbetracht der geringen Größe der synaptischen Vesikel-mit einem mittleren Durchmesser von 39 nm27 und Endosomen, könnte der Zentrifugation, roh Membran Pellet (P2 Bruch) zu isolieren nicht ausreicht, um alle synaptischen Vesikel und Endosomen pellet gewesen. Diese Ergebnisse zeigen zusammen, dass unser Rohöl Fraktionierung Protokoll bereichern kann, Membrane-springen und transmembranen Proteine, die nicht mit synaptischen Vesikel und evtl. mit Endosomen in Roh Membran P2 Bruchteil einhergehen.
Um zu untersuchen ob ECS-induzierte globale Erhöhung der Aktivität den Ausdruck der postsynaptischen Proteine in den Hippocampi ändert, roh Membran P2 Bruchteil war lysiert in eiskaltem Wasser, Nukleinsäuretablette in HEPES-Puffer und zentrifugiert bei 25.000 x g für 20 min zu isolieren, die lysierten Pellet (LP1) (Abbildung 2). Die LP1 Pellet war Nukleinsäuretablette in HEPES-Puffer mit 1 % Triton x-100 Reinigungsmittel und zentrifugiert bei 25.000 x g über 3 h das PSD-Pellet (Abbildung 2) zu erhalten. Die nachfolgenden Western-Blot der PSD Fraktionen erkannt, PSD95, GluN2B und GluA2 (Abbildung 3 und Abbildung 4), die postsynaptischen Proteine17,25,28bekannt sind. Allerdings fehlte der PSD-Fraktionen α-Tubulin und allem präsynaptischen Marker Synaptophysin (Abbildung 3 und Abbildung 4). Schritt61, die dephosphorylates GluN2B und GluA2 und fungiert als ihre negativen Regulator29,30,31, wurde nicht in den PSD-Fraktionen (Abbildung 3 und Abbildung 4) gefunden. Übereinstimmung mit dem jüngsten Bericht demonstriert des synaptischen Ausschluss von Schritt61, vermittelt durch PSD95 in der PSD-26bereichert. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass unsere kleine Fraktionierung-Methode erfolgreich PSD Proteine aus der rohen Membran P2-Fraktion isoliert.
Die Quantifizierung der Western blotting ergab, dass GluN2B Ausdruck in der P2-Fraktion unverändert wurde aber eine steigende Tendenz in der PSD-Anteil bei 3 h und 24 h nach akuten ECS angezeigt (n = 4) (Abb. 3B). GluA2 Ausdruck änderte nicht die P2 und PSD Brüche bei 3 h und 24 h nach akuten ECS (Abb. 3C). Bei 24 h und 96 h nach chronischer ECS, GluN2B Ausdruck angezeigt ein Abwärtstrend in der P2-Fraktion und wurde in der PSD-Fraktion deutlich reduziert (24 h: p < 0,05, n = 4; 48 h: p < 0,01, n = 4) (Abbildung 4B). Im Gegensatz dazu chronische ECS hatte keinen Einfluss auf GluA2 Ausdruck in den P2 und PSD Fraktionen (n = 4) (Abb. 4C).
Abbildung 1 : Schema für die Induktion von ECS akute und chronische ECS. (A) A Ratte war verbunden mit einem Pulsgenerator über Ohr-Clip Elektroden und einen elektrischen Schlag (55 mA, 100 Impulse/s für 0,5 s) wurde angewandt, um Stufe 4-5 Tonikum-klonischen Anfällen zu entlocken. (B) akute ECS wurde durch einen elektrischen Schlag verursacht. Chronische ECS wurde durch einen elektrischen Schlag pro Tag an 7 aufeinanderfolgenden Tagen ausgelöst. Die Zeitpunkte gezeigt repräsentieren die Dauer nach der Induktion von akuten ECS oder die letzten ECS für chronische ECS Induktion vor Dissektion der Hippocampi. "Keine Beschlagnahme" Sham (NS) Kontrolle Ratten wurden gleich behandelt, aber keinen elektrischen Schlag erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Workflow der subzellulären Fraktionierung, S2 und P2 PSD-Fraktionen aus der Hippocampi einer einzigen Ratte isolieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Prüfung der synaptischen Proteine in Hippocampal S2, P2 und PSD-Fraktionen aus Ratten, erhielt NS oder akute ECS. (A) repräsentative Western Blots zeigen die Proteinexpression von NMDA-Rezeptor-Untereinheit GluN2B, AMPA-Rezeptor GluA2 und Schritt61 in der S2, P2, und PSD-Fraktionen aus dem Hippokampi von Sham "keine Machtergreifung" (NS) Ratten und Ratten, die akute ECS erhalten. Die zytoplasmatischen lösliche Protein α-Tubulin ist in der S2-Fraktion angereichert. Synaptophysin ist ein präsynaptischen Vesikel Protein und ist in der rohen Membran P2 Bruchteil, aber nicht in der PSD-Fraktion angereichert. PSD-95 wird in der P2 und PSD-Fraktionen bereichert. (B-C) Quantifizierung der GluN2B (B) und GluA2 (C) in den P2 und PSD Fraktionen 3 und 24 h nach akuten ECS (n = 4 Ratten pro Zeitpunkt). GluN2B und GluA2 Ausdruck in der P2-Fraktion war an α-Tubulin in der S2-Fraktion normalisiert. GluN2B und GluA2 Ausdruck in der PSD-Fraktion war in der PSD-Fraktion auf PSD-95 normalisiert. Die Daten werden dargestellt als Prozent ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Prüfung der synaptischen Proteine in Hippocampal S2 und P2 PSD-Fraktionen aus Ratten, erhielt NS oder chronischen ECS. Vertreter Western blots von α-Tubulin; Synaptophysin; Schritt61; und postsynaptischen Proteine, einschließlich PSD95, GluN2B und GluA2, in der S2 und P2 PSD-Fraktionen aus Hippokampi von Sham "keine Machtergreifung" (NS) Ratten und Ratten, die chronische ECS. Die zytoplasmatischen lösliche Protein α-Tubulin ist in der S2-Fraktion angereichert. Synaptophysin ist ein präsynaptischen Vesikel Protein und ist in der rohen Membran P2 Bruchteil, aber nicht in der PSD-Fraktion angereichert. PSD-95 wird in der P2 und PSD-Fraktionen bereichert. (B-C) Quantifizierung der GluN2B (B) und GluA2 (C) in den P2 und PSD Fraktionen bei 24 und 96 h nach chronischer ECS (n = 4 Ratten pro Zeitpunkt). GluN2B und GluA2 Ausdruck in der P2-Fraktion wurde auf das α-Tubulin in der S2-Fraktion normalisiert. GluN2B und GluA2 Ausdruck in der PSD-Fraktion war in der PSD-Fraktion auf PSD-95 normalisiert. Die Daten werden als prozentuale ± SEM dargestellt; * p < 0,05, ** p < 0,01 im Vergleich mit Steuerung (ANOVA und Tukey Post-hoc- Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Bruchteil | Proteinfraktion | Protein-marker |
| P1 | Nukleare | Histon H1 |
| S1 | Zytosol/membrances | a-Tubulin (Cytoskelett) und GAPDH (Zytosol) |
| P2 | Grobe synaptosomes | AMPA und NMDA-Rezeptor-Untereinheiten |
| S2 | Zytosol/Licht membrances | GAPDH (Zytosol) und LAMP1 (Lysosomen) |
| Synaptosomal Membran | Synaptosome/Mitochondrien | AMPA und NMDAR-Rezeptor-Untereinheiten, Synaptophysin (präsynaptischen Marker) |
| PSD | PSD | AMPA und NMDA-Rezeptor-Untereinheiten, PSD95, PICK1, CaMKII |
Tabelle 1: Liste der Protein-Marker und Antikörper subzellularen Brüche zu unterscheiden.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine ECS Induktionsmethode bei Ratten, die die globale Stimulation neuronaler Aktivität in ihren Hippokampi entlockt. ECS ist ein Tiermodell der Elektrokrampftherapie, die klinisch zur Behandlung von Drogen feuerfest depressive Störungen bei Menschen1,2,3. Trotz Verwendung der Elektrokrampftherapie Therapie zur Behandlung von schweren Depressionen bleibt die präzise zugrunde liegende Mechanismus unklar. Da ECS anti-Aepressant-wie Verhalten bei Nagetieren induziert und stimuliert die hippocampale Neurogenese4,32, ECS wurde ausgiebig genutzt, um untersuchen, wenn neue Erwachsenen geboren Neuronen im dentate Gyrus des Hippocampus Dazu tragen Sie bei, Anti-Depressiva Verhalten5,32.
ECS induziert leichte bis schwere generalisierte Tonikum-klonischen Anfällen bei Nagetieren bei der aktuellen Lieferung durch stereotaxically implantierte Elektroden, Hornhaut Elektroden oder Ohr-Clip Elektroden33,34. EEG-Ableitungen bei Patienten haben gezeigt, dass bilaterale elektrischer Stimulation mehr prominente und mehr Generalisierte Anfälle verursacht, als einseitige Stimulation35,36tut. In unseren ECS Induktionsmethode sind Tonika-klonischen Anfällen durch aktuelle Lieferung durch nicht-invasive Ohr-Clip Elektroden an beiden Ohren, imitiert Anfälle bei Menschen hervorgerufen durch bilaterale Stimulation36induziert. Obwohl wir noch nicht, die Wirksamkeit von ECS bei Ratten auf die Sedierung oder Vollnarkose angewendet geprüft, es ist möglich, dass die Ratten Anästhetika verleihen den Grad der Anfälle induziert durch elektrische Stimulation, die möglicherweise verringern könnte aufgrund der Tatsache, dass Anästhesie ist physiologisch verstärkte hemmenden und gedämpft exzitatorischen Ton in das Gehirn-Netzwerk zugeordnet. Darüber hinaus ist der entscheidende Schritt in die ECS Induktionsmethode experimentell die Stromstärke Stufe 4-5 entlocken wählen Stärkungsmittel - klonischen Anfällen basierend auf Alter, Gewicht und die Arten von Nagetieren verallgemeinert. Unsere ECS Induktionsmethode wurde optimiert, zur Induktion Stufe 4-5 Anfällen innerhalb von ein paar Sekunden bei wach männlichen Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 200-250 g. Wenn die Ratten unter Narkose Zustand für ECS Induktion verwendet werden, sollte die Intensität, Dauer und Häufigkeit der Bereitstellung aktueller für erfolgreiche Induktion der Beschlagnahme von Stufe 4 bis 5 geändert werden.
ECS bietet auch den Vorteil der Hyperaktivität in Neuronen stimulieren und verursacht akute vorübergehende Anfälle mit sehr niedrigen Mortalität33, im Gegensatz zu Chemoconvulsants, einschließlich Pilocarpin und Kainite, die Status Epilepticus auslösen und verursachen chronische Manifestation des spontanen wiederkehrende Anfälle und schweren histologischen Veränderungen37,38. Obwohl ECS routinemäßig auf Bildschirm Antiepileptika Medikamente33,34verwendet worden ist, akute ECS und chronische ECS nicht zu der Generation von chronischen Epilepsie führen und daher nicht in einem Tiermodell um zu studieren Epileptogenesis verwendet werden. Stattdessen hat ECS eingesetzt worden zu prüfen, inwieweit die ändert die Breite Höhe der Aktivität des Gehirns Ausdruck bzw. posttranslationale Modifikationen des synaptischen Proteine in Vivo, die dazu, dauerhafte Änderungen im synaptischen beitragen Stärke und Strukturen (Abbildung 3 und Abbildung 4)10,40. In dieser Studie haben wir nur männliche Ratten die unerwarteten Auswirkungen der Östruszyklus Zyklus Phase des weiblichen Ratten auf die Menge des Proteins PSD nach ECS auszuschließen. Es wurde allerdings beobachtet, dass es keinen Sex Unterschied in den Gerüstbau-Proteinen, einschließlich PSD-95 und SAP102 in der PSD-Region des frontalen Kortex und Hippocampus39, was impliziert, dass hormonelle Veränderungen, die EZB Östrus Zyklus nicht die basale beeinträchtigt Höhe der PSD Proteine.
Mehrere Methoden sind eingesetzt worden, zu prüfen, inwieweit die ECS Veränderungen der Neurogenese, Synaptogenese und synaptische Plastizität5,6,7,8,9, induziert 11 , 40. elektrophysiologische Aufnahmen des exzitatorischen postsynaptischen Stroms (EPSC) sind weit verbreitet, die Änderungen in der synaptischen Stärke der erregenden glutamatergen Synapsen21zu erkennen. Beispielsweise ergaben die homöostatische downscaling exzitatorische synaptische Stärke in den kortikalen pyramidalen Neuronen der Schichten II-III von Mäusen nach akuten ECS41Miniatur EPSC Aufnahmen. Allerdings ist die Identifizierung der synaptischen Proteine, die ECS-induzierte synaptische Plastizität beitragen, anspruchsvolle denn elektrophysiologische Aufnahmen mit der genetischen Ko gepaart werden müssen oder Knock-down von bestimmten Kandidaten synaptischen Proteine. Änderungen in der Ebene von Glutamat-Rezeptoren an der postsynaptischen Membran und synaptischen Proteine angereichert in der PSD regulieren die Stärke und Wirksamkeit von erregenden synaptischen Übertragung17,18,25. Obwohl Immunohistochemistry verwendet werden kann, zu prüfen, ECS-induzierten Veränderungen in der Expression der synaptischen Proteine, diese Technik kann nur 1-2 Kandidaten synaptischen Proteine gleichzeitig untersuchen und erfordert gut validierte Antikörper, die spezifisch sie erkennen ohne dass unspezifische Färbung.
Die subzelluläre Fraktionierung von Hirngewebe in Kombination mit Western blotting bietet Vorteile gegenüber Elektrophysiologie und Immunohistochemistry bei der Identifizierung von synaptischen Proteine, die durch ECS verändert werden. Die subzelluläre Fraktionierung des Hirngewebes ist eine schnelle und grobe biochemische Methode lösliche cytosolischen Proteine (S2 Bruch) aus Rohöl Membranen (P2 Bruch), wie ER und Golgi Membranen, Membrane-springen Organellen, Plasmamembranen, zu trennen und synaptische terminal Membranen, die in Form Synaptosomes42,43,44wieder verschließen. Die PSD-Fraktion kann weitere isoliert aus der P2-Fraktion, die synaptischen Proteine42,43,44zu bereichern. Die unvoreingenommene Proteomic Analyse der PSD-Fraktion konnte alle PSD Proteine zu identifizieren deren Ebenen durch ECS verändert werden. Westliche Beflecken kann schnell durchgeführt werden, um die Veränderungen der PSD Proteine, zu untersuchen, die durch unspezifische Bänder leicht identifiziert werden kann.
Die bisherige Methode der Gehirn Fraktionierung erfordert eine große Menge von Nagetier Gehirn Gewebe42,43,44, machen diese Technik anspruchsvoll für den Einsatz bei der Prüfung löslich oder Membranproteine von einer einzelnen Person Nagetier Gehirn oder eine bestimmte Gehirnregion aus einem einzigen Gehirn. Es gibt eine steigende Nachfrage quantitativ vergleichen das Proteom von einer Gehirnregion zur anderen und von einem Tier Kontrolle eines transgenen Tieres oder ein Tier, das einer bestimmte Behandlung unterzogen hat. Daher haben wir überarbeitet und optimiert die traditionellen Gehirn Fraktionierung Methode um grobe löslich und Membran-Fraktionen aus beiden Hippokampi einer einzigen Ratte zu isolieren. Unsere kleine Rohöl Fraktionierung-Protokoll erfolgreich isoliert rohe P2-Membran-Fraktionen aus cytosolischen S2 löslichen Brüche, wie durch das Fehlen von zytoplasmatischen Proteinen α-Tubulin in den P2-Fraktionen, während Membrane-springen PSD95 in erkannt wurde die P2 aber nicht S2 Brüche (Abbildung 3A und Abbildung 4A). Mit der beschriebenen Methode hier, haben wir quantitativ gezeigt, dass akute ECS deutlich Schritt61 Ausdruck und Tyrosin Phosphorylierung der Substrate, GluN2B und die extrazelluläre Signal-regulierte Kinase 1/2 in das Roh abnimmt Membran P2 Bruchteil der Ratte Hippokampi 48 h nach akuten ECS10.
Die S2-Fraktionen enthalten unerwartet, Synaptophysin; Schritt61; und in viel geringerem Maße, GluA2 (Abbildung 3A und Abbildung 4A). Schritt61 ist ein glykosylierten integrale Membrane Protein26 das endoplasmatische Retikulum (ER) und PSD45zugeordnet. Es ist möglich, dass der Zentrifugation zu isolieren, das Roh Membran Pellet (P2 Bruch) nicht ausreicht, um alle synaptischen Vesikel mit Synaptosomes sowie Endosomen pellet gewesen wäre und Lysosomen mit GluA2 und Schritt61. Dennoch klare Bereicherung der GluN2B, GluA2 und PSD95 und der Mangel an α-Tubulin in den P2-Fraktionen darauf hinweisen, dass unsere Fraktionierung Protokoll bereichern kann, Membrane-springen und transmembranen Proteine, die nicht mit synaptischen Vesikel verbunden sind und Endosomen in der rohen Membran P2-Fraktion.
Obwohl die Roh Membran P2 Bruchteil Synaptosomes enthält, ist eine Einschränkung der Prüfungsabteilung aktivitätsabhängige Veränderungen der synaptischen Proteine in der P2-Fraktion, dass die genaue Lage der ihre Änderungen nicht bestimmt werden kann. Synaptischen Proteine in der PSD angereichert waren bestimmt werden, kann weitere biochemische Fraktionierung verwendet werden, um die PSD zu isolieren. Die bisherige Methode der PSD Fraktionierung erfordert eine große Menge von Nagetier Hirngewebe (d. h. 10-20 Nagetier Gehirne) und Saccharose Steigungen42,43,44. Da diese traditionelle Methode nicht ausreichen, um eine ausreichende Menge an die PSD-Fraktion aus zwei Hippocampi einer einzigen Ratte zu isolieren ist, haben wir eine einfachere Methode angepasst, die direkt den PSD-Bruch ohne Saccharose gradient20,21 isoliert . Diese Methode führt zu über 30-50 µg des PSD-Proteins, ausreichend für mehrere biochemische Tests, einschließlich westliche Beflecken. Unsere Methode bereichert, PSD95, GluN2B und GluA2, die bekannt sind, in der PSD-Fraktion konzentriert werden und erkennt Änderungen in GluN2B Ausdruck in PSD Bruchteil nach chronischer ECS Induktion (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Hier, offenbart unsere quantitativen Western-Blot Analyse keine signifikante Veränderung in GluA2 Ausdruck in den P2 und PSD Fraktionen bei 3 h und 24 h nach akuten ECS (Abb. 3C). Der GluN2B Ausdruck in der P2-Fraktion unverändert war aber eine steigende Tendenz in der PSD-Anteil bei 3 h und 24 h nach akuten ECS (Abbildung 3B), schlägt die mögliche differenzierte Regelung der synaptischen versus extrasynaptic angezeigt GluN2B-haltigen NMDA-Rezeptoren. Wir beobachten auch, dass GluN2B Ausdruck ein Abwärtstrend in der P2-Fraktion nach chronischer ECS angezeigt und verringerte sich deutlich in der PSD-Fraktion um 24 und 96 h nach chronischer ECS (Abbildung 4B). Obwohl höchst spekulativ, kann solche Entfernung von GluN2B aus der PSD nach sich wiederholenden Induktion von ECS durch mehrere Mechanismen, einschließlich direkte Internalisierung von PSD Membran oder laterale Diffusion zu extrasynaptic Seiten vermittelt. In Anbetracht unserer vorhergehenden Bericht, dass anhaltende Verbesserung neuronaler Aktivität deutlich erhöht Schritt61 Ausdruck und verringert die Tyr-Phosphorylierung des GluN2B in den P2-Fraktionen der kultivierten hippocampal Neuronen46, unsere Ergebnisse deuten darauf hin dass eine Abnahme der GluN2B Ausdruck in der P2 und die PSD-Fraktionen nach chronischer ECS kann wahrscheinlich durch Schritt61 Ausdruck und die spätere Entfernung des GluN2B aus der extrasynaptic Membran verbessert.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass unsere kleine PSD-Fraktionierung-Methode in Kombination mit dem ECS-Induktion-Protokoll in Vivo zu unterscheiden die aktivitätsabhängige Regulierung der Glutamat-Rezeptoren an der postsynaptischen Membran ermöglicht im Vergleich zu insgesamt Plasmamembranen, einschließlich die extrasynaptic Membranen. Dieses Protokoll kann problemlos an jede synaptischen Proteine an exzitatorischen Synapsen angewendet werden und kann für andere Nager Hippokampi oder anderen Gehirnregionen durch Anpassen der Lautstärke der jeweiligen Lösung basierend auf dem Gewebe Gewicht geändert werden. Also, unsere kleine PSD Fraktionierung Methode ist vielseitig und für zukünftige Anwendungen zu prüfen, die in Vivo -Änderungen in den postsynaptischen Proteinen in jedes Tier nach genetischen, pharmakologische oder mechanische Behandlung angenommen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Eric C. Bolton für die Erlaubnis, seine Zentrifuge für die Fraktionierung und Dr. Graham H. Diering in Dr. Richard L. Huganir Lab an Johns Hopkins Universität für die Bereitstellung von uns mit dem kleinen Protokoll für die PSD-Fraktionierung zu verwenden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
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