Summary
Elektrochok beslaglæggelse (ECS) er en eksperimenterende dyremodel af elektrochok behandling for svær depression. ECS stimulerer globalt aktivitet i hippocampus, fører til synaptogenesis og synaptisk plasticitet. Her, beskriver vi metoder for ECS induktion i rotter og subcellulært fraktionering af deres hippocampi til at undersøge beslaglæggelse-inducerede ændringer i synaptic proteiner.
Abstract
Elektrochok beslaglæggelse (ECS) er en eksperimenterende dyremodel af elektrochok terapi, den mest effektive behandling for svær depression. ECS inducerer generaliseret tonisk-kloniske anfald med lav dødelighed og neuronal død og er en meget anvendt model til skærmen anti-epileptisk medicin. Her, vi beskriver en ECS induktion metode i som en kort 55-mA strøm er leveret til 0,5 s hen til Handyr rats 200-250 g i vægt via øret-klip elektroder. Sådanne bilaterale stimulation produceret etape 4-5 kloniske anfald, der varede cirka 10 s. Efter ophør af akut eller kronisk ECS, de fleste rotter kommet for at blive behaviorally skelnes fra humbug "ingen beslaglæggelse" rotter. Fordi ECS hæver globalt hjerneaktivitet, er det også blevet brugt til at undersøge aktivitet-afhængige ændringer af synaptic proteiner og deres effekter på synaptisk styrke ved hjælp af flere metoder. Især subcellulært fraktionering af postsynaptiske massefylde (PSD) i kombination med Western blotting giver mulighed for kvantitativ bestemmelse af overfloden af synaptic proteiner på denne specialiserede synaptic struktur. I modsætning til en tidligere fraktionering metode, der kræver store mængder af gnaver hjerner, beskriver vi her en mindre fraktionering metode til at isolere PSD fra hippocampi af en enkelt rotte, uden saccharose gradient centrifugering. Ved hjælp af denne metode, viser vi, at den isolerede PSD fraktion indeholder postsynaptiske Membranproteiner, herunder PSD95, GluN2B og GluA2. Præsynaptiske markør synaptophysin og opløselige cytoplasmatiske protein α-tubulin blev udelukket fra PSD brøkdel, demonstrerer vellykket PSD isolation. Derudover faldt kronisk ECS GluN2B udtryk i PSD, der angiver, at vores små PSD fraktionering metode kan anvendes til at registrere ændringerne i hippocampus PSD proteiner fra en enkelt rotte efter genetiske, farmakologiske eller mekaniske behandlinger .
Introduction
Elektrochok terapi har været anvendt til behandling af patienter med større depressive lidelser, herunder svær resistent depression, bipolar depression, Parkinsons sygdomme, og skizofreni1,2. I denne behandling genereres beslaglæggelse af elektriske stimulus leveret til lederen af bedøvede patienter via epicranial elektroder1,2,3. Gentagen administration af ECS har været klinisk gavnlig medicinresistente depressive lidelser1,2,3. Imidlertid har den nøjagtige mekanisme bag den langsigtede effekt af antidepressiv effekt hos mennesker forblev undvigende. ECS er en dyremodel af elektrochok terapi og er almindeligt anvendt til at undersøge sin terapeutiske mekanisme. I gnavere, både akut ECS og kronisk ECS behandling fremme voksen neurogenese i hippocampi og omstrukturere de neurale netværk4,5, som forventes at bidrage til forbedringer i kognitiv fleksibilitet. Derudover ændrer globale udvidelse af hjerneaktivitet af ECS overfloden af udskrifter, såsom en hjerne afledt neurotropic faktor6, og flere proteiner, herunder metabotropic glutamat receptor 17 og N-methyl-D-aspartat (NMDA) type glutamat receptor underenheder7. Disse ændringer er involveret i mægler langsigtet ændring af synapse nummer, struktur og styrke i hippocampus7,8,9.
I ECS modeller, er elektrisk stimulation leveret til gnavere via stereotaxically implanterede elektroder, cornea elektroder eller øre elektroder til at fremmane generaliseret tonisk-kloniske anfald10,11. Stereotaxisk implantation af elektroder indebærer hjernekirurgi og kræver en væsentlig tid til at forbedre den eksperimentatoren kirurgiske færdigheder for at minimere skaden. Mindre invasive hornhinde elektroder kan forårsage hornhinde slid og tørhed og kræver bedøvelse. Brugen af øre-klip elektroder omgår disse begrænsninger, fordi de kan bruges på gnavere uden operation eller anæstesi og minimal skade. Faktisk, vi fandt, at nuværende leveres til vågen rotter via øret-klip elektroder pålideligt inducerer fase 4-5 tonisk-kloniske anfald og ændrer synaptic proteiner i deres hippocampi10.
For at undersøge den ECS-induceret overflod af synaptic proteiner i de specifikke hjerneregioner af gnavere, er det vigtigt at vælge de eksperimentelle metoder, der er mest egnet til deres påvisning og kvantificering. Subcellulært fraktionering af hjernen giver mulighed for den rå isolation af opløselige cytosole proteiner; Membranproteiner; organelle-grænser proteiner; og selv proteiner i særlige subcellulært strukturer, såsom PSD12,13,14. PSD er en tæt og velorganiseret subcellulært domæne i neuroner, synaptic proteiner er meget koncentreret på og i nærheden af postsynaptiske membran12,13,15. Isolering af PSD er nyttig for studiet af synaptic proteiner beriget på PSD, da dynamiske ændringer i overflod og funktion af postsynaptiske glutamat receptorer, stilladser proteiner og signaltransduktion proteiner i PSD12 , 15 , 16 , 17 er korreleret med synaptisk plasticitet og synaptopathy observeret i flere neurologiske17,18. En tidligere subcellulært fraktionering metode bruges til at rense PSD involveret isolation af de detergent-uopløselige fraktion fra rå membran brøkdel af hjernen ved den differentierede centrifugering af saccharose forløb14, 19. den store udfordring med denne traditionelle metode er, at det kræver store mængder af gnaver brains14,19. Forberedelse af 10-20 gnavere at isolere PSD brøkdel pr. behandling kræver omfattende omkostninger og tid investeringer og er ikke praktisk muligt, hvis der er mange behandlinger.
For at overvinde denne udfordring, har vi tilpasset en enklere metode, der direkte isolerer PSD fraktion, uden saccharose gradient centrifugering20,21, og revideret den for at være gældende for PSD isolation fra hippocampi af en enkelt rotte hjernen. Vores små PSD fraktionering metode giver om 30-50 µg af PSD proteiner fra 2 hippocampi, tilstrækkelige til brug i flere biokemiske analyser, herunder immunoprecipitation og Western blotting. Western blotting viser succesen med vores metode til at isolere PSD ved at afsløre berigelse af postsynaptiske tæthed protein 95 (PSD-95) og udelukkelse af præsynaptiske markør synaptophysin og opløselige cytoplasmatiske protein α-tubulin. Vores ECS induktion og små PSD fraktionering metoder er let at tilpasse til andre gnavere hjerneregioner og giver en relativt enkel og pålidelig måde at evaluere virkningerne af ECS på udtryk for PSD proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer herunder animalske emner er blevet godkendt af det institutionelle dyr pleje og brug udvalg på University of Illinois i Urbana-Champaign.
1. opretholde en rotte koloni
- Racen Sprague-Dawley rotter (Se Tabel af materialer) og fastholde dem i standardbetingelser med en 12-h lys-mørke cyklus og ad libitum adgang til mad og vand.
- Vænne rotte unger på postnatal dag (P) 28 og hus dem i grupper af 2-4 mand eller kvinde littermates.
- Markere haler af mandlige rotter med giftfri permanent sort markør for identifikation.
- Vejer de mandlige rotter 3 gange om ugen og optage deres bodyweights.
2. forberedelse af en ECS maskine
- Klokken 7:30, desinficere bænk i animalsk forberedelse værelse og placere en ECS maskine (pulsgenerator) på bænken.
- Sted en enkelt mandlig rotte vejer 200-250 g i en ren, Tom bur med låg. Gentag dette for alle mandlige rotter behandles med ECS induktion. Lad rotter habituate i 30 min.
- Mens rotter habituating i deres bure, angive en pulsgenerator for ECS induktion til hyppigheden af 100 pulser/s, en pulse bredde på 0,5 ms, et chok varighed af 0,5 s, og en nuværende 55 mA (fig. 1A).
- Forberede pulsgenerator ved at trykke på "RESET" knappen og sikre, at "READY"-knappen er tændt. Sørg for at øre clips ikke er knyttet til en pulsgenerator og tryk derefter på knappen "Chok" i et par sekunder.
Bemærk: på dette tidspunkt, pulse generator er klar til ECS induktion. - Sæt øre clips i pulse generator.
3. induktion af akut ECS
Bemærk: Se figur 1B, toppanelet.
- Våd øre clips med sterilt saltvand og sikre, at de er mættet.
- Våd en rotte ører med sterilt saltvand ved at omkranse dem i saltvand-gennemblødt gaze. Når de er våde, fjerne gaze.
- Vedhæft et klip pr. øre, stilling ud over de vigtigste brusk band.
- Bekræfte på ECS maskine, en sand løkke er etableret; Hvis ikke, vises en fejlmeddelelse eller en læsning af "1" på maskinen.
- Bære en tyk og ikke-metal handske. Mens du holder rotten forsigtigt i en behandskede hånd, tryk på knappen "Chok" i et par sekunder og langsomt frigive greb på rotte at observere beslaglæggelse. For fingeret "ingen beslaglæggelse" (NS) styre, håndtere rotten ens men levere ikke aktuelt.
- Afbryde øre clips, da clonus begynder og optage beslaglæggelse adfærd ifølge en revideret Racine scale22 , indeholder "munden og ansigts bevægelser" (fase 1), "hovedet Nikkende" (fase 2), "forelimb clonus" (fase 3), "opdræt med forelimb clonus" (fase 4), og "opdræt og falder med forelimb clonus" (trin 5). Beslaglæggelse skal vare ca 10 s; optage beslaglæggelse varighed ved hjælp af en timer.
- Efter beslaglæggelse opsigelse, returnere rotten til sit hjem bur. Overvåge rotte i en anden 5 min for at sikre inddrivelse af rotter fra anfald. Holde det enkeltvis har til huse i buret og vende tilbage i buret til på opvågningsstuen.
- Gentag ECS induktion på den næste rotte.
- Overvåge rotter i resten af dagen og mindst én gang om morgenen og en gang om eftermiddagen den følgende dag, indtil de er euthanized for eksperimenter.
Bemærk: ECS induktion metode kunne føre til kliniske tegn som en utilsigtet bivirkning, der kræver opmærksomhed. For eksempel, kunne ECS induktion protokollen fremkalde anfald, der vare længere end 15 s og forårsage unødvendig nød til rotter. I dette tilfælde, afslutte beslaglæggelsen ved hjælp af diazepam (10 mg/kg, i.p.) eller pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Hvis rotter udvikle åndedrætsbesvær eller svære adfærdsmæssige abnormiteter efter beslaglæggelse ophør, aflive dem ved CO2-indånding efterfulgt af halshugning.
4. induktion af kronisk ECS
Bemærk: Se figur 1B, nederste panel.
- Fremkalde en ECS pr. dag på samme tid om morgenen som beskrevet i trin 1-3, ovenfor, for syv på hinanden følgende dage.
- Monitor rotter to gange om dagen efter vendte de tilbage til deres hjem bure.
5. homogenisering og fraktionering af rotte Hippocampi
Bemærk: Se figur 2.
- Forberede en frisk homogenisering buffer (opløsning A), der indeholder 320 mM saccharose, 5 mM natrium pyrofosfat, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7,4, 200 nM indhold af okadainsyre, og proteasehæmmere. Filter-sterilisere bufferen ved hjælp af filtre med en 0,22 µm porestørrelse for vakuum filtrering og placere den på is.
- På et givet tidspunkt punkt efter akut ECS eller kronisk ECS (figur 1), aflive rotten af CO2 indånding for 5-10 min, efterfulgt af halshugning ved hjælp af en guillotine.
- Fjerne hjernen og dissekere hippocampi på metalpladen placeret på isen, som tidligere beskrevet23,24.
- Sted to hippocampi fra en rotte på en 30-mm vævskultur fad og hakke dem i små stykker ved hjælp af saks.
- Overføre de hakket hippocampi til en manuel glas homogeniseringsapparat ved hjælp af 1 mL pipette og tilsættes 1 mL iskold homogenisering buffer (opløsning A, trin 5.1). Indsæt en runde pistil i et glas homogeniseringsapparat. Mens glas homogeniseringsapparat er på isen, forsigtigt og støt slagtilfælde op og ned på pistil 10 - 15 gange i 1 minut, indtil små stykker af hippocampus væv forsvinde.
- Overførsel af homogenatet til en 1,7 mL microcentrifuge rør med 1 mL pipette og centrifugeres homogenatet ved 800 x g i 10 min. ved 4 ° C for at adskille postnuclear supernatanten (S1 brøkdel) fra toerstoffet indeholdende uopløselige væv og kerner (P1 brøkdel). Overføre 50 µL og 950 µL af S1 brøk til to separate, nye 1,7 mL microcentrifuge rør med 1 mL pipette og gemme disse rør på is. Gemme P1 brøkdel pellet på is.
- Centrifugeres S1 brøkdel (950 µL) i 10 min på 13,800 x g og 4 ° C for at adskille supernatanten (S2 brøkdel), beriget med cytosole-opløselige proteiner, og pellet (P2 brøkdel), beriget med membran-bundet protein, herunder synaptosomal proteiner. Overføre S2 brøk til en ny 1,7 mL microcentrifuge ved hjælp af 1 mL pipette og gemme det på is.
- Resuspenderes (P2 brøkdel) i 498 µL iskold renset vand ved hjælp af 1 mL pipette. Tilføj 2 µL 1 M HEPES (pH 7,4) ved hjælp af en 20 µL pipette til at opnå en endelig koncentration på 4 mM HEPES (pH 7,4). Der inkuberes ved 4 ° C med agitation for 30 min. butik den resuspenderede P2 fraktion på is.
- Protein koncentrationen af S1, S2, og P2 fraktioner ved hjælp af en BCA assay. Tilføje 50 mM HEPES (pH 7,4) til hver fraktion til at opnå en 1 mg/mL koncentration og opbevares ved-80 ° C indtil brug, eller behandle P2 fraktion for at isolere PSD.
6. isolering af PSD fra rå membran proteinfraktion (P2)
- Der centrifugeres P2 brøkdel (500 µL) i 20 min. på 25.000 x g og 4 ° C for at adskille lysed supernatanten (LS2 brøkdel) og den lysed pellet (LP1 brøkdel). Overføre LS2 brøk til en ny 1,7 mL microcentrifuge rør med 1 mL pipette og gemme det på is.
- LP1 resuspenderes i 250 µL af 50 mM HEPES (pH 7,4) blandet med 250 µL 1% vaskemiddel i 1 x PBS buffer ved hjælp af 1 mL pipette. Der inkuberes ved 4 ° C med blid agitation i 15 min.
- Der centrifugeres den resuspenderede LP1 pellet for 3 h på 25.000 x g og 4 ° C for at adskille supernatanten (ikke-PSD brøkdel) fra pellet (PSD brøkdel). Fjern supernatanten til en 1,7-mL microcentrifuge tube og PSD resuspenderes i 100 µL af 50 mM HEPES (pH 7,4) ved hjælp af en 200 µL pipette.
- Bestemme proteinkoncentration LS2, ikke-PSD og PSD fraktioner ved hjælp af en BCA assay. Tilføje 50 mM HEPES (pH 7,4) til hver fraktion til at opnå en 1 mg/mL koncentration og opbevares ved-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Alle løsninger, der anvendes i trin 5-6 (dvs. løsning A HEPES buffer og PBS buffer) bør gøres med renset vand gratis af Ioniske og organiske forurenende stoffer og partikler.
7. Western Blotting
- Tø hver proteinfraktion på is. Overføre 12 µL af hver fraktion (S2, P2 og PSD i 1 mg/mL) til en ny 1,7 mL microcentrifuge rør ved hjælp af en 20-µL pipette.
- Tilføje 3 µL af 5 x SDS prøvebuffer og inkuberes ved 75 ° C i 30 minutter i et vandbad. Cool prøve ned til stuetemperatur (RT).
- Læg 10 µL af protein prøve i hver brønd 4-20% gradient 15-godt kam SDS-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) gel ved hjælp af en 20 µL pipette. Kør gelen i apparatet SDS-PAGE og på 80-100 V i kører buffer (25 mM Tris, 190 mM glycin og 0,1% SDS; pH 8.3).
Bemærk: Hver gel bør indeholde protein prøver fra NS rotter og ECS rotter på forskellige tidspunkter efter akut eller kronisk ECS. - Overførsel proteiner fra SDS-PAGE gel til en polyvinyl xenondifluorid (PVDF) membran i apparatet overførsel på 25-30 V (60 mA) til 9-12 h i overførsel buffer (25 mM Tris, 190 mM glycin og 20% methanol; pH 8.3).
- Fjerne PVDF membran fra apparatet overførsel og vaske det i Tris-bufferet saltvand (TBS) i 5 min på en multi-purpose rotator på RT.
- Blokere membran i 5% mælk og 0,1% Tween-20 i TBS for 1 h. udruge det primære antistoffer (tabel 1) i vask buffer (1% mælk og 0,1% Tween-20 i TBS) natten på en multi-purpose rotator ved 4 ° C (Se Tabel af materialer til fortyndinger).
- Vask membran 4 gange i 10 min i wash buffer og derefter inkuberes det med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundære antistoffer i vask buffer i 1 time på en multi-purpose rotator på RT.
- Vask membran 4 gange i 10 min i wash buffer og derefter med TBS i 5 min.
- Inkuber membran med forbedret chemifluorescence substrat for 1 min og udsættes for X-ray film. Udvikle de udsatte film med en film processor.
8. kvantificering af Western blotting
- Scan Western blot som en TIFF-fil og gemme denne fil på computeren.
- Åbn filen vestlige skamplet i programmet ImageJ som et gråtonebillede, under "Fil," "Åbn billede," højre pil "gråtoneskala."
- Vælg det rektangulære markeringsværktøj på værktøjslinjen ImageJ og tegne et rektangel, der dækker en enkelt vestlige skamplet band af en protein af interesse.
- Under "Analyze," hit "Foranstaltning" for at opnå området og den gennemsnitlige massefylde valgte bandet.
- Flyt rektanglet til en baggrundsområdet uden at ændre dets størrelse og form. Gentag trin 8,4 til området og den gennemsnitlige massefylde af en baggrund.
- Fratræk den gennemsnitlige tæthed værdi af en baggrund band fra af en vestlige skamplet band, giver baggrund-trækkes band tætheden af protein af interesse.
- Gentag trin 8.2-8,6 for alle vestlige skamplet bands af interesse.
- Opdele baggrund-trækkes band tætheden af protein af interesse af baggrunden-trækkes band tæthed af en husholdning gen produkt, såsom α-Tubulin; Dette trin giver den normaliserede værdi af protein af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af en detaljeret procedure præsenteres her, en elektrisk stød (55 mA, 100 pulser/s for 0,5 s) leveret via øre-klip elektroder induceret ikke-tilbagevendende etape 4-5 tonisk-kloniske anfald hos rotter (figur 1A-B). En samlet 8 af rotter modtaget akut ECS induktion og vises etape 4-5 tonisk-kloniske anfald. Anfaldene varede omkring 10 s, og alle rotter inddrevet inden for 1-2 min af beslaglæggelse ophør. Forlorne "ingen beslaglæggelse" rotter modtog ikke en elektrisk stød og vises derfor ikke anfald. Ialt 4 sham rotter blev brugt. For kronisk ECS induktion, rotter fik et elektrisk stød pr. dag i 7 dage i træk og vises etape 4-5 tonisk-kloniske anfald ved hvert stød (figur 1A-B). En samlet 8 af rotter modtaget kronisk ECS induktion og ialt 4 sham rotter blev brugt som "ingen beslaglæggelse" rotter. Selv om de fleste rotter, der fik kronisk ECS var behaviorally skelnes fra humbug "ingen beslaglæggelse" rotter, et par udviklede kroppen rystelser og reduceret sonderende aktivitet af 7th elektrisk stød.
For at undersøge, om ECS-induceret globale udvidelse af aktivitet ændrer protein udtryk i hippocampi, blev rotter ofret 3 og 24 timer efter akut ECS og på 24 og 96 timer efter den endelige ECS i kronisk ECS behandling (figur 1B). To hippocampi fra hver rotte blev hurtigt dissekeret og udsat for vores optimeret små fraktionering protokol (figur 2). Den første homogenatet af to hippocampi gratis af uopløselige væv og kerner (S1 brøkdel) var re centrifugeres ved 13,800 x g i 10 min. til at adskille supernatanten der indeholder opløselige cytoplasmatisk proteiner (S2 brøkdel) fra den rå membran pellet, der indeholder synaptosomes (P2 brøkdel) (figur 2). Vores vestlige skamplet opdaget cytoplasmatiske protein α-tubulin i S2 fraktioner, men ikke P2 fraktioner, af hippocampi fra rotter behandlet med akut og kronisk ECS (figur 3 og figur 4), demonstrerer den vellykkede fraktionering af cytosole opløselige proteiner fra rå membran pellets.
PSD95 er medlem af familien membran-associerede guanylatcyclase kinase (MAGUK) og en kernekomponent i PSD12,18,25. PSD95 og NMDA-receptor underenhed GluN2B blev opdaget udelukkende i P2 fraktioner, men ikke S2 fraktioner (figur 3 og figur 4). Stærkere udtryk for en anden glutamatergic α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptor subunit GluA2 blev opdaget i P2 fraktioner i forhold til S2 fraktioner i hippocampi (figur 3 og figur 4), Angiver, at postsynaptiske Membranproteiner er beriget med rå membran P2 brøkdel pellets. Interessant, blev synaptic vesikel protein synaptophysin og integreret membran protein Striatal beriget tyrosin Phosphatase 61 (trin61)26 fundet lige så i S2 og P2-fraktioner (figur 3 og figur 4). I betragtning af den lille størrelse af synaptiske vesikler-med en gennemsnitlig diameter på 39 nm27 og endosomes, centrifugering at isolere rå membran pelleten (P2 brøkdel) kunne ikke have været tilstrækkelig til at pille alle synaptiske vesikler og endosomes. Disse resultater viser sammen at vores rå fraktionering protokol kan berige membran-bundet proteiner og transmembrane proteiner, som ikke er forbundet med synaptiske vesikler og eventuelt med endosomes i rå membran P2 fraktion.
For at undersøge, om ECS-induceret globale udvidelse af aktivitet ændrer udtryk af postsynaptiske proteiner i hippocampi, rå membran P2 brøkdel var mængden i iskoldt vand, genopslemmes i HEPES buffer og centrifugere på 25.000 x g i 20 min. at isolere den mængden pellet (LP1) (figur 2). LP1 pellet var genopslemmes i HEPES buffer indeholdende 1% Triton X-100 vaskemiddel og centrifugeres ved 25.000 x g over 3 timer at få PSD pellet (figur 2). Den efterfølgende vestlige skamplet af PSD fraktioner opdaget PSD95, GluN2B og GluA2 (figur 3 og figur 4), som er kendt postsynaptiske proteiner17,25,28. Dog PSD fraktioner manglede α-tubulin og vigtigere, præsynaptiske markør synaptophysin (figur 3 og figur 4). TRIN61, som dephosphorylates GluN2B og GluA2 og fungerer som deres negative regulator29,30,31, blev ikke fundet i PSD fraktioner (figur 3 og figur 4), overensstemmelse med den seneste rapport viser synaptic udelukkelse af trin61, medieret af PSD95 beriget med PSD26. Helt, disse resultater viser, at vores små fraktionering metode med held isolerer PSD proteiner fra rå membran P2 brøkdel.
Kvantificering af Western blotting afslørede at GluN2B udtryk var uændret i P2 fraktion men vises en stigende tendens i PSD fraktion 3 og 24 timer efter akut ECS (n = 4) (fig. 3B). GluA2 udtryk blev ikke ændret i både P2 og PSD fraktioner 3 og 24 timer efter akut ECS (figur 3C). 24 og 96 timer efter kronisk ECS, GluN2B udtryk vises en faldende tendens i P2 fraktion og blev reduceret betydeligt i PSD fraktion (24 h: p < 0,05, n = 4; 48 h: p < 0,01, n = 4) (fig. 4B). Derimod kroniske ECS ikke påvirkede GluA2 udtryk i P2 og PSD fraktioner (n = 4) (fig. 4C).
Figur 1 : Skema til induktion af akut ECS og kronisk ECS. (A) A rotte var forbundet med en pulsgenerator via øret-klip elektroder og elektrisk stød (55 mA, 100 pulser/s for 0,5 s) blev anvendt til at fremkalde etape 4-5 tonisk-kloniske anfald. (B) akut ECS er fremkaldt ved en elektrisk stød. Kronisk ECS var fremkaldt af en elektrisk stød pr. dag i 7 dage i træk. De tidspunkter vist repræsenterer varighed efter induktion af akut ECS eller den sidste ECS for kronisk ECS induktion før dissektion af hippocampi. Humbug "ingen beslaglæggelse" (NS) kontrol rotter blev håndteret ens men har ikke modtaget en elektrisk stød. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Workflow af subcellulært fraktionering at isolere S2, P2 og PSD fraktioner fra Hippocampi af en enkelt rotte. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Undersøgelse af synaptisk proteiner i hippocampus S2, P2, og PSD fraktioner fra rotter at modtaget NS eller akut ECS. (A) repræsentative Western blotting Vis protein udtryk af NMDA-receptor underenhed GluN2B, AMPA-receptoren GluA2 og trin61 i S2, P2, og PSD fraktioner fra hippocampi af fingeret "ingen beslaglæggelse", (NS) rats og rats der modtages akutte ECS. Cytoplasmatisk-opløseligt protein α-tubulin er beriget i S2-fraktionen. Synaptophysin er en præsynaptiske vesikel protein og er beriget i den rå membran P2 brøkdel, men ikke i PSD fraktion. PSD-95 er beriget med både P2 og PSD fraktioner. (B-C) Kvantificering af GluN2B (B) og GluA2 (C) i P2 og PSD fraktioner på 3 og 24 timer efter akut ECS (n = 4 rotter pr. tidspunkt). GluN2B og GluA2 udtryk i P2 fraktion var normaliseret til α-Tubulin i S2-fraktionen. GluN2B og GluA2 udtryk i PSD fraktion var normaliseret til PSD-95 i PSD fraktion. Dataene præsenteres som den procentvise ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Undersøgelse af synaptisk proteiner i hippocampus S2, P2, og PSD fraktioner fra rotter at modtaget NS eller kronisk ECS. Repræsentant Western blots af α-tubulin; synaptophysin; TRIN61; og postsynaptiske proteiner, herunder PSD95, GluN2B og GluA2, i S2, P2, og PSD fraktioner fra hippocampi af fingeret "ingen beslaglæggelse", (NS) rats og rats, modtaget kronisk ECS. Cytoplasmatisk-opløseligt protein α-tubulin er beriget i S2-fraktionen. Synaptophysin er en præsynaptiske vesikel protein og er beriget i den rå membran P2 brøkdel, men ikke i PSD fraktion. PSD-95 er beriget med både P2 og PSD fraktioner. (B-C) Kvantificering af GluN2B (B) og GluA2 (C) i P2 og PSD-fraktion på 24 og 96 h efter kronisk ECS (n = 4 rotter pr. tidspunkt). GluN2B og GluA2 udtryk i P2 fraktion var normaliseret til α-Tubulin i S2-fraktionen. GluN2B og GluA2 udtryk i PSD fraktion var normaliseret til PSD-95 i PSD fraktion. Dataene præsenteres som procent ± SEM; * p < 0,05, ** p < 0,01 sammenlignet med kontrol (ANOVA og Tukey's post-hoc test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Brøk | Proteinfraktion | Protein markør |
| P1 | Nukleare | Histon H1 |
| S1 | Cytosol/membrances | a-tubulin (cytoskeleton) og GAPDH (cytosol) |
| P2 | Rå synaptosomes | AMPA og NMDA receptor underenheder |
| S2 | Cytosol/lys membrances | GAPDH (cytosol) og LAMP1 (lysosomet) |
| Synaptosomal membran | Synaptosome/mitokondrier | AMPA og NMDAR receptor underenheder, Synaptophysin (præsynaptiske markør) |
| PSD | PSD | AMPA og NMDA receptor underenheder, PSD95, PICK1, CaMKII |
Tabel 1: Liste over Protein markører og antistoffer for at skelne subcellulært fraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her, beskriver vi en ECS induktion metode i rotter, der fremkalder den globale stimulation af neuronal aktivitet i deres hippocampi. ECS er en dyremodel af elektrochok terapi, som er klinisk anvendes til behandling af narkotika ildfaste depressive lidelser i mennesker1,2,3. Trods brugen af elektrochok terapi til behandling af svær depression, den præcise underliggende mekanisme er fortsat uklart. Fordi ECS inducerer depressant-lignende adfærd i gnavere og stimulerer hippocampus neurogenese4,32, ECS har været flittigt brugt til at undersøge hvis nye voksen-født neuroner i den dentate gyrus af hippocampus bidrage til anti-depressivt adfærd5,32.
ECS inducerer mild til svær generaliseret tonisk-kloniske anfald hos gnavere ved nuværende levering gennem stereotaxically implanterede elektroder, cornea elektroder eller øre-klip elektroder33,34. EEG optagelser i patienter har afsløret, at bilaterale elektrisk stimulering forårsager mere fremtrædende og længere generaliserede anfald end ensidige stimulation gør35,36. I vores ECS induktion metode, er tonisk-kloniske anfald fremkaldt af aktuelle levering gennem noninvasive øre-klip elektroder fastgjort til begge ører, efterligne anfald hos mennesker fremkaldt af bilaterale stimulation36. Selv om vi ikke har undersøgt effekten af ECS i rotter som sedation eller anæstesi anvendes, er det muligt, at give rotter bedøvende stoffer kunne reducere graden af krampeanfald induceret af elektrisk stimulation, som muligvis skyldes at anæstesi er fysiologisk forbundet med øget hæmmende og afdæmpet excitatoriske tone i hjernens netværk. Den kritiske trin i metoden ECS induktion er derudover at eksperimentelt ringe den nuværende intensitet for at fremkalde etape 4-5 generaliseret tonic - kloniske anfald baseret på alder, vægt og arter af gnavere. Vores ECS induktion metode er blevet optimeret for at fremkalde etape 4-5 anfald indenfor et par sekunder i vågen mandlige Sprague-Dawley rotter vejer 200-250 g. Hvis rotter under anæstesi tilstand bruges til ECS induktion, bør intensitet, varighed og hyppighed for at levere aktuelle ændres for succesfulde induktion af beslaglæggelse spænder fra 4 til 5. etape.
ECS tilbyder også fordelen, at stimulere hyperaktivitet i neuroner og forårsager akut forbigående anfald med meget lav dødelighed33, i modsætning til chemoconvulsants, herunder pilocarpin og kainit, som inducerer status epilepticus og forårsage kronisk manifestation af spontan tilbagevendende anfald og alvorlige histologiske ændringer37,38. Selv om ECS er rutinemæssigt blevet udnyttet til skærmen anti-epileptisk medicin33,34, akut ECS og kronisk ECS resulterer ikke i generation af kronisk epilepsi og dermed ikke kan bruges i en dyremodel til at studere epileptogenesis. I stedet, ECS har været bredt ansat til at undersøge som den brede udvidelse af hjerneaktivitet ændrer udtryk og/eller posttranslationelle modifikationer af synaptic proteiner i vivo, der bidrager til vedvarende ændringer i synaptic styrke og strukturer (figur 3 og figur 4)10,40. I denne undersøgelse brugte vi kun mandlige rotter for at udelukke de uventede virkninger af estrus cyklus fase af hunrotter på mængden af protein, PSD efter ECS. Dog blev det konstateret, at der er ingen sex forskel i stilladser proteiner, herunder PSD-95 og SAP102 i regionen PSD i frontal cortex og hippocampus39, hvilket indebærer, at hormonelle ændringer vedrørende estrus cyklus ikke kan påvirke den basale mængden af PSD proteiner.
Flere metoder har været ansat til at undersøge som ECS inducerer ændringer i neurogenese, synaptogenesis og synaptisk plasticitet5,6,7,8,9, 11 , 40. elektrofysiologiske optagelser af excitatoriske postsynaptiske nuværende (EPSC) er almindeligt anvendt til at registrere ændringer i glutamatergic excitatoriske synaptisk styrke synapser21. For eksempel, har miniature EPSC optagelser afsløret den homeostatiske nedskalering af excitatoriske synaptisk styrke i kortikale pyramideformet neuroner i lag II-III af mus efter akut ECS41. Identifikation af synaptic proteiner, der bidrager til ECS-induceret synaptisk plasticitet er imidlertid udfordrende fordi elektrofysiologiske optagelser skal kombineres med den genetiske knockout eller knock-down af specifikke kandidat synaptic proteiner. Ændringer i niveauet af glutamat receptorer på den postsynaptiske membran og synaptic proteiner beriget i PSD regulere styrken og effektiviteten af excitatoriske synaptisk transmission17,18,25. Selvom Immunhistokemi kan bruges til at undersøge ECS-inducerede ændringer i udtrykket af synaptic proteiner, denne teknik kan undersøge kun 1-2 kandidat synaptic proteiner ad gangen og kræver godt validerede antistoffer, som specifikt genkender dem. uden at forårsage uspecifik farvning.
Subcellulært fraktionering af hjernevæv i kombination med Western blotting tilbyder fordele over Elektrofysiologi og Immunhistokemi i at identificere synaptic proteiner, der er ændret af ECS. Subcellulært fraktionering af hjernevæv er en hurtig og rå biokemiske metode til at adskille opløselige cytosole proteiner (S2 brøkdel) fra rå membraner (P2 brøkdel), herunder ER og Golgi membraner, membran-bundet organeller, plasma membraner, og Synaptic terminal membraner, der reseal form synaptosomes42,43,44. PSD brøkdel kan være yderligere isoleret fra P2 brøkdel til at berige synaptic proteiner42,43,44. Uvildig proteom-analyse af PSD brøkdel kunne identificere alle PSD proteiner hvis niveauet er ændret af ECS. Western blotting kan udføres hurtigt for at undersøge udtrykket ændringer af PSD proteiner, som let kan identificeres fra ikke-specifikke bands.
Den forrige metode af hjernen fraktionering kræver en stor mængde af gnaver hjernen væv42,43,44, gøre denne teknik udfordrende til brug ved behandlingen af opløselige eller Membranproteiner fra individ gnaver hjernen eller en bestemt hjerne region fra en enkelt hjerne. Der er en stigende efterspørgsel kvantitativt sammenligne proteom fra én hjernen regionen til et andet og fra en kontrol dyr til en transgene dyr eller dyr, som har undergået en særlig behandling. Derfor har vi revideret og optimeret traditionelle hjernen fraktionering metode til at isolere rå opløselige og membran fraktioner fra to hippocampi af en enkelt rotte. Vores små rå fraktionering protokollen held isoleret rå P2 membran fraktioner fra cytosole S2 opløselige fraktioner, som angivet af manglen cytoplasmatiske protein α-tubulin i P2 fraktioner, hvorimod membran-bundet PSD95 blev opdaget i den P2 men ikke S2 fraktioner (fig. 3A og figur 4A). Ved hjælp af metoden beskrevet her, har vi kvantitativt vist at akut ECS betydeligt øger trin61 udtryk og reducerer tyrosin fosforylering af dens substrater, GluN2B og den ekstracellulær signal-reguleret kinase 1/2 i rå membran P2 brøkdel af rotte hippocampi på 48 h efter akut ECS10.
Uventet, S2 fraktioner indeholdt synaptophysin; TRIN61; og i langt mindre grad, GluA2 (fig. 3A og figur 4A). TRIN61 er en glykosyleret integreret membran protein26 tilknyttet endoplasmatiske reticulum (ER) og PSD45. Det er muligt at centrifugering at isolere rå membran pelleten (P2 brøkdel) ikke kunne have været tilstrækkelig til at pille alle synaptiske vesikler indeholdende synaptosomes, samt endosomes og lysosomer indeholdende GluA2 og trin61. Ikke desto mindre klare berigelse af GluN2B, GluA2 og PSD95 og manglen på α-tubulin P2 brøkdele indikerer, at vores fraktionering protokol kan berige membran-bundet proteiner og transmembrane proteiner, der ikke er knyttet til synaptiske vesikler og endosomes i rå membran P2 fraktion.
Selv om rå membran P2 fraktion indeholder synaptosomes, er en begrænsning af undersøge aktivitet-afhængige ændringer af synaptic proteiner i P2-fraktionen, den nøjagtige placering af deres ændringer ikke kan fastslås. Hvis synaptic proteiner beriget i PSD skulle fastlægges, kan derefter yderligere biokemiske fraktionering bruges til at isolere PSD. Den tidligere PSD fraktionering kræver en stor mængde af gnaver hjernevæv (dvs. 10-20 gnaver hjerner) og saccharose gradienter42,43,44. Fordi denne traditionelle metode er utilstrækkelig til at isolere en tilstrækkelig mængde af PSD fraktion fra to hippocampi af en enkelt rotte, har vi tilpasset en enklere metode, der direkte isolerer PSD fraktion, uden en saccharose gradient20,21 . Denne metode giver om 30-50 µg PSD protein, tilstrækkelige til flere biokemiske analyser, herunder Western blotting. Vores metode beriger PSD95, GluN2B og GluA2, som er kendt for at være koncentreret i PSD fraktion, og registrerer ændringer i GluN2B udtryk i PSD brøkdel efter kronisk ECS induktion (figur 3 og figur 4).
Her, viste vores kvantitative Western blot analyse ingen væsentlige ændringer i GluA2 udtryk i P2 og PSD fraktioner 3 og 24 timer efter akut ECS (figur 3C). GluN2B udtryk var uændret i P2 fraktion men vises en stigende tendens i PSD fraktion 3 og 24 timer efter akut ECS (fig. 3B), tyder på mulige differentieret regulering af synaptic versus extrasynaptic GluN2B-holdige NMDA-receptorer. Vi bemærkede også, at GluN2B udtryk vises en faldende tendens i P2-fraktionen efter kronisk ECS og blev reduceret betydeligt i PSD fraktion på 24 og 96 h efter kronisk ECS (fig. 4B). Selvom meget spekulative, kan sådanne fjernelse af GluN2B fra PSD efter gentagne induktion af ECS medieret af flere mekanismer, herunder direkte internalisering fra PSD membran eller lateral diffusion til extrasynaptic websteder. Overvejer vores forrige rapport at længere tids forbedring af neuronal aktivitet markant øger trin61 udtryk og reducerer Tyr-fosforylering af GluN2B P2 brøkdele af kulturperler hippocampus neuroner46, vores resultater tyder at et fald i GluN2B udtryk i P2 og PSD fraktioner efter kronisk ECS kan være sandsynlige grund til forbedret skridt61 udtryk og den efterfølgende fjernelse af GluN2B fra den extrasynaptic membran.
I sammendrag, har vi bevist, at vores små PSD fraktionering metode, i kombination med en ECS induktion protokol, giver os mulighed for at differentiere i vivo aktivitet-afhængig regulering af glutamat receptorer på den postsynaptiske membran versus samlede plasma membraner, herunder extrasynaptic membraner. Denne protokol kan nemt anvendes på enhver synaptic proteiner på excitatoriske synapser og kan ændres til andre gnaver hippocampi eller andre områder af hjernen ved at justere mængden af hver løsning baseret på væv vægt. Således, vores små PSD fraktionering metode er alsidige og kan vedtages for fremtidige ansøgninger til at undersøge, i vivo ændringer i de postsynaptiske proteiner i hvert dyr ved genetiske, farmakologiske eller mekanisk behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. Eric C. Bolton for at lade os bruge sin centrifuge til fraktionering og Dr. Graham H. Diering i Dr. Richard L. Huganir lab på John's Hopkins University for at give os med de små protokol for PSD fraktionering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spargue-Dawley rat | Charles River Laboratories | ECS supplies | |
| A pulse generator | Ugo Bsile, Comerio, Italy | 57800 | ECS supplies |
| MilliQ water purifying system | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Subcellular fractionation supplies |
| Sucrose | Em science | SX 1075-3 | Subcellular fractionation supplies |
| Na4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Subcellular fractionation supplies |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Subcellular fractionation supplies |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Subcellular fractionation supplies |
| Okadaic acid | TOCRIS | 1136 | Subcellular fractionation supplies |
| Halt Protease Inhibitor | Thermo Scientific | 78429 | Subcellular fractionation supplies |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Subcellular fractionation supplies |
| EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters | Fisher Scientific | SCGPS05RE | Subcellular fractionation supplies |
| Iris Scissors | WPI (World Precision Instruments) | 500216-G | Subcellular fractionation supplies |
| 30 mm tissue culture dish | Fisher Scientific | 08-772B | Subcellular fractionation supplies |
| Glass homogenizer and a Teflon pestle | VWR | 89026-384 | Subcellular fractionation supplies |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002) | Subcellular fractionation supplies |
| Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004521 | Subcellular fractionation supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Western blot supplies |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot supplies |
| SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Western blot supplies |
| Running Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel | BIO-RAD | #1658004 | Western blot supplies |
| Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane | Milipore | IPVH00010 | Western blot supplies |
| Transfer Buffer | Made in the lab | Western blot supplies. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot supplies |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | Western blot supplies |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot supplies |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot supplies |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent for PSD isolation |
| Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Western blot supplies |
| Nonfat instant dry milk | Great value | Western blot supplies | |
| Multi-purposee rotator | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot supplies |
| Hyblot CL Autoradiography Film | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365) | Western blot supplies |
| Enhanced chemifluorescence substrate | Thermo Scientific | 32106 | Western blot supplies |
| a Konica SRX-101A film processor | KONICA MINOLTA | SRX-101A | Western blot supplies |
| Name of Antibody | |||
| PSD-95 | Cell Signaling | #2507 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| Synaptophysin | Cell Signaling | #4329 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| alpha-Tubulin | Santacruz | SC-5286 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluN2B | Neuromab | 75-097 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 715-035-150 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
| Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoReserch laboratory | 711-035-152 | Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey |
References
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
- Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
- Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869 (2013).
- Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
- Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
- Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
- Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
- Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
- Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
- Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230 (2016).
- Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
- Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
- Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
- Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
- Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896 (2014).
- Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
- Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
- Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269 (2007).
- Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
- Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
- Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
- Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
- Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
- Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
- Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
- Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
- Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
- Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
- Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
- Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
- Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
- Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
- Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
- Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
- Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
- Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
- Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
- Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
- Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
- Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
- Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55 (2015).
