Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties
Summary
Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.
Abstract
Met de groeiende interesse in de micro-omgeving van de tumor, ontwikkelden we een methode om de micro-milieukomponenten specifiek te bepalen in patiëntenmonsters van glioblastoom, de dodelijkste en meest invasieve hersenkanker. Niet alleen zijn kwantitatieve methoden die gunstig zijn voor het nauwkeurig beschrijven van zieke weefsels, ze kunnen ook potentieel bijdragen tot een nauwkeuriger prognose, diagnose en de ontwikkeling van weefsel-gemanipuleerde systemen en vervangingen. Bij glioblastoom zijn gliale cellen, zoals microglia en astrocyten, onafhankelijk gecorreleerd met een slechte prognose gebaseerd op patholoog-gradering. Echter, de toestand van deze cellen en andere gliale celcomponenten is niet kwantitatief goed beschreven. Dit kan moeilijk zijn door de grote processen die deze glialcellen markeren. Bovendien richten de meeste histologische analyses op het algehele weefselmonster of alleen in het grootste deel van de tumor, in tegenstelling tot het kwantificeren van kwantificaties op basis van regio's witHin het zeer heterogene weefsel. Hier beschrijven we een methode voor het identificeren en kwantitatief analyseren van de populaties van gliale cellen in het tumorvolume en de aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoompatiënten. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties bij patiënten tumor resecties en ImageJ te identificeren om de percentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Met deze technieken kunnen we de glialcellen beter omschrijven doorheen de regio's van de glioma tumor micro-omgeving.
Introduction
Glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en kwaadaardige hersenkanker, wordt gekenmerkt door een zeer diffuse invasie van het primaire tumorvolume in het omliggende gezonde hersenparenchym 1 , 2 . Deze diffuse invasie maakt de tumor bijzonder moeilijk om volledig te resecteren en de invasieve kankercellen die post-therapie blijven, is de meest voorkomende reden voor onvermijdelijk herhaling 2 , 3 , 4 . Vroeger vonden we de diffuse glioma-celinval te remmen om therapeutisch voordelig te zijn 5 , maar weinig bekend is over de complexe mechanismen die bijdragen aan GBM-invasie. De tumor micro-omgeving, of weefsel rondom de kanker, is betrokken bij de progressie van tumoren bij meerdere kankers 6 , 7 . De glioblastoom tumor micro-omgeving, in pArticulair, is relatief onderschat en is uniek complex, het vormen van meerdere gliale cellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, evenals extracellulaire matrix, oplosbare factoren en biofysische factoren. Experimenteel zijn astrocyten en microglia aangetoond dat de progressie van gliomen en invasie 8 , 9 , 10 toeneemt, maar de samenstelling van alle gliale cellen in de micro-omgeving van de menselijke hersenen is onbekend.
We hebben eerder laten zien dat micro-componenten de overleving van patiënten kunnen voorspellen door cellulaire componenten van de glioblastoom micro-omgeving kwantitatief te analyseren en onze analyses te integreren in een proportioneel risico model 11 . Hier beschrijven we de kwantitatieve analysemethode voor het identificeren van de populaties van glialcellen binnen het tumorvolume en aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoom patients. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties en ImageJ te identificeren om de procentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Het beoordelen van de procentuele dekking creëert een simpele meting voor het bepalen van de morfologische verschillen in cellen, met name die welke beïnvloed zijn door interacties met kankercellen. Eerdere studies voor het kwantificeren van histopathologische kleuring gebruiken standaard kleuring zoals hematoxyline en eosin 12 of Masson's trichroom 13 , die niet profiteren van de specificiteit van immunohistochemische kleuring op antilichamen. Onze methode is ontwikkeld om de glialpopulaties rechtstreeks te kwantificeren binnen glioblastoom patiënten tumor resecties, die we willen gebruiken om de complexe glioblastoom micro-omgeving te verhelderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onze methode die hier wordt voorgesteld is een kwantitatieve aanpak voor het analyseren van histologische monsters die zijn gekleurd met behulp van traditionele chromogene immunohistochemie. Huidige methodologie voor dit soort analyses bevat soortgelijke kleurenprotocollen, gevolgd door gradering door onafhankelijke pathologen. Deze methode is betrouwbaar, maar voor een aantal toepassingen is een nauwkeuriger inzicht in de cellulaire samenstelling nodig, zoals beter inzicht in de heterogeniteit in verband met tumoren en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Drs. Fahad Bafakih en Jim Mandell voor het verkrijgen en identificeren van patiëntmonsters, Garrett F. Beeghly voor hulp bij immunohistochemie, en de Biorepository and Tissue Research Facility, de Histologie Core van het Cardiovasculaire Research Center en de Biomoleculaire Analysefaciliteit aan de Universiteit van Virginia voor hulp bij Voorbeeldverwerving, immunohistochemie en beeldvorming.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?. Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
