Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties

doi: 10.3791/56025 Published: July 31, 2017

Summary

Dit protocol werd ontwikkeld om tumormicro-milieukomponenten kwantitatief te identificeren bij glioblastoom-patiëntresecties onder toepassing van chromogene immunohistochemie en ImageJ.

Abstract

Met de groeiende interesse in de micro-omgeving van de tumor, ontwikkelden we een methode om de micro-milieukomponenten specifiek te bepalen in patiëntenmonsters van glioblastoom, de dodelijkste en meest invasieve hersenkanker. Niet alleen zijn kwantitatieve methoden die gunstig zijn voor het nauwkeurig beschrijven van zieke weefsels, ze kunnen ook potentieel bijdragen tot een nauwkeuriger prognose, diagnose en de ontwikkeling van weefsel-gemanipuleerde systemen en vervangingen. Bij glioblastoom zijn gliale cellen, zoals microglia en astrocyten, onafhankelijk gecorreleerd met een slechte prognose gebaseerd op patholoog-gradering. Echter, de toestand van deze cellen en andere gliale celcomponenten is niet kwantitatief goed beschreven. Dit kan moeilijk zijn door de grote processen die deze glialcellen markeren. Bovendien richten de meeste histologische analyses op het algehele weefselmonster of alleen in het grootste deel van de tumor, in tegenstelling tot het kwantificeren van kwantificaties op basis van regio's witHin het zeer heterogene weefsel. Hier beschrijven we een methode voor het identificeren en kwantitatief analyseren van de populaties van gliale cellen in het tumorvolume en de aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoompatiënten. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties bij patiënten tumor resecties en ImageJ te identificeren om de percentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Met deze technieken kunnen we de glialcellen beter omschrijven doorheen de regio's van de glioma tumor micro-omgeving.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en kwaadaardige hersenkanker, wordt gekenmerkt door een zeer diffuse invasie van het primaire tumorvolume in het omliggende gezonde hersenparenchym 1 , 2 . Deze diffuse invasie maakt de tumor bijzonder moeilijk om volledig te resecteren en de invasieve kankercellen die post-therapie blijven, is de meest voorkomende reden voor onvermijdelijk herhaling 2 , 3 , 4 . Vroeger vonden we de diffuse glioma-celinval te remmen om therapeutisch voordelig te zijn 5 , maar weinig bekend is over de complexe mechanismen die bijdragen aan GBM-invasie. De tumor micro-omgeving, of weefsel rondom de kanker, is betrokken bij de progressie van tumoren bij meerdere kankers 6 , 7 . De glioblastoom tumor micro-omgeving, in pArticulair, is relatief onderschat en is uniek complex, het vormen van meerdere gliale cellen, zoals astrocyten, microglia en oligodendrocyten, evenals extracellulaire matrix, oplosbare factoren en biofysische factoren. Experimenteel zijn astrocyten en microglia aangetoond dat de progressie van gliomen en invasie 8 , 9 , 10 toeneemt, maar de samenstelling van alle gliale cellen in de micro-omgeving van de menselijke hersenen is onbekend.

We hebben eerder laten zien dat micro-componenten de overleving van patiënten kunnen voorspellen door cellulaire componenten van de glioblastoom micro-omgeving kwantitatief te analyseren en onze analyses te integreren in een proportioneel risico model 11 . Hier beschrijven we de kwantitatieve analysemethode voor het identificeren van de populaties van glialcellen binnen het tumorvolume en aangrenzende gebieden van tumorresecties van glioblastoom patients. We gebruikten chromogene immunohistochemie om de gliale celpopulaties en ImageJ te identificeren om de procentuele dekking van kleuring voor elke gliale populatie te analyseren. Het beoordelen van de procentuele dekking creëert een simpele meting voor het bepalen van de morfologische verschillen in cellen, met name die welke beïnvloed zijn door interacties met kankercellen. Eerdere studies voor het kwantificeren van histopathologische kleuring gebruiken standaard kleuring zoals hematoxyline en eosin 12 of Masson's trichroom 13 , die niet profiteren van de specificiteit van immunohistochemische kleuring op antilichamen. Onze methode is ontwikkeld om de glialpopulaties rechtstreeks te kwantificeren binnen glioblastoom patiënten tumor resecties, die we willen gebruiken om de complexe glioblastoom micro-omgeving te verhelderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol identificeert cellulaire componenten in formaline-gefixeerde paraffine embedded (FFPE) monsters, zoals gebruikelijk voor gebonden klinische patiëntmonsters. Paraffin embedding zorgt voor het beste onderhoud van de cel- en weefselmorfologie en heeft ook een betere levensduur van secties. De monsters die voor deze analyse werden gebruikt werden toegankelijk via de Universiteit van Virginia Biorepository and Tissue Research Facility. Patiëntmonsters werden geselecteerd door een neuropatholoog op basis van een definitieve diagnose van glioblastoom (astrocytoma, WHO grade IV) die tussen 2010 en 2013 aan de Universiteit van Virginia tumorresecties had voltooid en vóór deze analyse 11 werden ontdekt .

1. FFPE Sample Deparaffinization and Rehydration

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is specifiek voor FFPE-monsters. Terwijl paraffine-ingebedde monsters nuttig kunnen zijn voor deze analyse vanwege het behoud van cellulaire en tMorfologie uitmaken, deze analyse kan ook gedaan worden met bevroren secties. Als u bevroren delen gebruikt, kan dit gedeelte worden weggelaten en ga rechtstreeks naar chromogene immunohistochemie.

  1. Doe de volgende wasjes gedurende 5 minuten: Xyleen, Xyleen, 100% Ethanol, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol, Geïoniseerd water, Gegioniseerd water

2. Antigenherwinning

OPMERKING: Dit gedeelte van het protocol is nodig om methyleenbruggen te vormen die worden gevormd tijdens formalinfixatie van FFPE-monsters en blootstelling van antigeenplaatsen voor antilichamen om te binden.

  1. Verdun Tris-gebaseerde hoge pH antigeen ontmaskerende oplossing bij fabrikant aanbeveling in gedistilleerd water.
  2. Voer warmte gemedieerde antigeen herwinning met behulp van een magnetron. Andere vormen van warmtegemedieerde terugwinning (zoals drukkoker, plantaardige stoomboiler of kokend water) zouden ook volstaan.
    1. Voeg de verdunde ontmaskeeroplossing toe in een niet-afgesloten magnetronvaartuig. Plaats de glijbanen in het vat. Plaats de glijbanen in de magnetron.
    2. Kook gedurende 20 minuten bij hoge kracht. Bewaar vloeistofniveaus voor verdamping en vul eventueel met gedestilleerd water aan.
  3. Laat de monsters 1 uur bij kamertemperatuur in de oplossing afkoelen.

3. Chromogene immunohistochemie

  1. Omtrek weefselmonster met een hydrofobe pen om het volume van de reagentia die nodig zijn om het monster te dekken te minimaliseren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat weefselmonsters gehydrateerd zijn en laat ze niet uitdrogen, omdat dit de effectiviteit op de vlek beïnvloedt.
  2. Pipet genoeg permeabilisatieoplossing (Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) + 0,01% Triton-X) om het weefselmonster te dekken (typisch ongeveer 100 - 200 μl).
  3. Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.2.
  4. Incubeer monsters bij kamertemperatuur met blokkerende oplossing (2,5% paars serum + permeabilisatie oplossing).
  5. Incubeer monsters overnacht in 4 ºC met primaire antilichamen verdundIn blokkerende oplossing.
    OPMERKING: Alle primaire antilichamen die hier worden gebruikt worden verdund op 1: 200, maar optimale verdunningen kunnen worden bepaald met behulp van seriële verdunningen, beginnend met de fabrikant aanbeveling. Gedetailleerde informatie over antilichamen gebruikt in dit protocol is eerder gepubliceerd 11 .
  6. Detecteer primaire antilichamen met behulp van een mierikswortelperoxidase polymeer reagens dat overeenstemt met het primaire antilichaam gastheer dier, in navolging van de fabrikant protocol.
  7. Pipet genoeg permeabilisatie oplossing om het weefselmonster te bedekken en gedurende 5 minuten te incuberen.
  8. Verwijder en verwijder oplossing en herhaal stap 3.7.
  9. Incubeer dia in 0,3% H 2 O 2 in 1 x TBS gedurende 15 minuten.
  10. Ontwikkel monsters met een substraat peroxidase diaminobenzidine (DAB) gedurende 2 - 10 minuten totdat de gewenste vlekintensiteit bereikt wordt.
  11. Contrasterende monsters om celkernen te identificeren, zoals bij hematoxyline, volgend fabrikantprotocol.
  12. Ontwater de monsters met 100%Ethanol en xyleen.
  13. Steek monsters permanent op met montagemedia.

4. Regio's van belangidentificatie

  1. Beeldschermen onder brightfieldmicroscopie die geschikt zijn voor hoge resolutiebeelden.
    OPMERKING: Gebruik beeldcamera-componenten met een resolutie van minimaal 20x.
  2. Verplaats camera naar specifieke regio's van belang door weefselmonsters.
  3. Bewaar afbeeldingen als TIFF-bestanden voor kwantificering.

5. Beeldanalyse

  1. Open afbeeldingen in ImageJ voor kwantificering van de procentuele dekking.
  2. Gebruik de invoegtoepassing Threshold Color om paars kleur uit hematoxyline-gekleurde kernen te verwijderen.
  3. Beeld omzetten naar 8-bits.
  4. Voeg drempel toe zonder donkere achtergrond.
  5. Procesafbeelding met een van de 17 vooraf ingestelde ImageJ-drempelfilters ( dwz MaxEntropy), zodat alleen DAB-gebrandde gedeelten in de drempel zijn opgenomen.
    OPMERKING: Selecteer het optimale voorgeladen drempelfilter dat minimaliseertHet opnemen van achtergrondkleuring. Dit kan afhangen van de kwaliteit van kleuring en specificiteit van antilichaam. Gebruik dezelfde drempel voor alle technische replicaten binnen elke patiëntmonster.
  6. Pas drempel toe.
  7. Meet percentage gebied van gedrempeld beeld.
  8. Gemiddelde percentage dekking voor meerdere gebieden binnen elke steekproef.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voor deze analyse werden twee regio's van belangen binnen onze tumorresecties - het primaire tumorvolume en de aangrenzende gebieden, hoofdzakelijk samengesteld uit gezond weefsel met diffuse invallende kankercellen ( Figuur 1A , 1B ) - geïdentificeerd door samenwerkende neuropathologen op hematoxyline en eosin-gekleurde patiënt samples. Binnen elk patiëntmonster werden positieve kleuring voor astrocyten ( Figuur 1C ), microglia ( Figuur 1D ) en oligodendrocyten ( Figuur 1E ) via chromogene immunohistochemie geïdentificeerd. Deze populaties werden geïdentificeerd met behulp van primaire antilichamen ALDH1L1, Iba1 en Oligodendrocytespecifieke eiwitten (OSP1) respectievelijk 11 . Optimalisatie van antilichaamverdunningen wordt aanbevolen, evenals raadpleging met fabrikantprotocollen om te bevestigen of het vlekken accuraat en positief is ( Figuur 2 ). Bijvoorbeeld hebben we vlekken uitgevoerd zonder een primair antilichaam voor een negatieve controle ( Figuur 2A ), de aanbevolen fabrikant ( Figuur 2B ) en verdere verdunningen ( Figuur 2C , 2D ) alvorens de verdunning van 1: 200 ( Figuur 2C ) af te lossen Optimale positieve kleuring van cellichaam en processen met het minimaliseren van de achtergrond voor het anti-ALDH1L1 antilichaam.

Met behulp van ImageJ werd de procentuele dekking van OSP1 + oligodendrocyte-kleuring gekwantificeerd om uiteindelijk verschillen in onze belangengebieden te vergelijken ( Figuur 3A ). We hebben de contrasterende kernen uit de afbeelding verwijderd met behulp van de Threshold Color plugin om alleen de positieve DAB-kleuring te beoordelen ( Figuur 3B ). Na het omzetten van de afbeelding naar 8bit (Ss = "xfig"> Figuur 3C), dan hebben we de MaxEntropy standaard drempel toegepast op de resterende positieve DAB-kleuring ( Figuur 3D ). Hier hebben we de MaxEntropy drempel standaard gebruikt, omdat deze specifieke standaard drempel onze positieve vlek de beste in het geheugen heeft genomen, maar de achtergrond minimaliseert, maar verschillende drempels kunnen worden gebruikt om de populatie van belang te analyseren. Zodra de juiste drempel is toegepast op de afbeelding ( Figuur 3E ), kan de procentuele dekking van de drempel worden gemeten ( Figuur 3F ) en vergeleken voor meerdere patiënten. Hier kwantificeren we 3 tot 5 gebieden binnen elke regio van belang, afhankelijk van het totale gebied van de regio van belang, en vergeleken groepen met gebruik van gepaarde t-tests met GraphPad Prism software. We hebben ook onze GBM-analyses vergeleken met bijbehorende kleuring die in gezond hersenweefsel gevonden werd in de Protein Atlas-database ( Figuur 3F ). In onze Vorige publicatie hebben we deze analyse gebruikt voor meerdere microenvrionmentale componenten (astrocyten, microglia, oligodendrocyten en bloedvaten) bij 33 patiënten om een ​​proportioneel risico model te ontwikkelen voor het voorspellen van de overleving van de patiënt 11 .

Figuur 1
Figuur 1 : Vergelijking van Tumor Bulk en Tumor Aangrenzende Gebieden van Belang voor Glialcellen.
A) Geheel tumormonster van Patiënt 63 gekleurd met hematoxyline en eosine met bulk en aangrenzende gebieden aangegeven. B) Hematoxyline en eosinkleuring, C) ALDH1L1 + Astrocyten, D) Iba1 + Microglia, en E) Oligodendrocyt Specifieke Proteïne-1 (OSP1) + Oligodendrocyten. Schaalbalk = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 2
Figuur 2 : Voorbeeld Titratie van Anti-ALDH1L1 Antilichaam.
A) Negatieve controle, B) 1:70 fabrikant aanbeveling verdunning uit voorraad, C) 1: 200 verdunning uit voorraad, en D) 1: 400 verdunning uit voorraad. 1: 200 verdunning werd gebruikt voor kleuring en analyse door optimale positieve kleuring van cellichaam en processen met minimalisering van de achtergrond. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Jpg "/>
Figuur 3 : ImageJ Analyse en Kwantificering van Gebied Dekking voor Oligodendrocyten.
A) Oorspronkelijke OSP1 + kleuring van patiënt 52. B) Verwijdering van paarse kernen met behulp van Threshold_Colour plugin. C) Omzetten naar 8bit. D) MaxEntropy drempel vastgelegd en E) toegepast om achtergrondkleuring te minimaliseren. F) Vergelijking van aangrenzende en bulkgebieden in vijf patiëntmonsters, evenals gezond hersenweefsel via de Protein Atlas, voor OSP1 + procent dekking. *** p <0,001, **** p <0,0001 via gepaarde t-tests. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onze methode die hier wordt voorgesteld is een kwantitatieve aanpak voor het analyseren van histologische monsters die zijn gekleurd met behulp van traditionele chromogene immunohistochemie. Huidige methodologie voor dit soort analyses bevat soortgelijke kleurenprotocollen, gevolgd door gradering door onafhankelijke pathologen. Deze methode is betrouwbaar, maar voor een aantal toepassingen is een nauwkeuriger inzicht in de cellulaire samenstelling nodig, zoals beter inzicht in de heterogeniteit in verband met tumoren en een accurate herkapitulatie van tumoren voor in vitro studies.

Dit protocol toont een eenvoudige techniek voor het kwantitatief analyseren van de populaties van gliale cellen binnen de micro-omgeving van de hersentumor. Deze techniek is op grote schaal aanpasbaar en kan uitgebreid worden om veel andere componenten van de micro-omgeving te identificeren, zoals bloedvaten, chemokines en meer, evenals andere kankers, zoals borst of alvleesklier, waar de tumorresecties kunnen hebbenGrotere parenchymale gebieden. Bovendien kan deze techniek aangepast worden om andere metingen, zoals tellingen en omtrek van cellen te verkrijgen om celvorm te beoordelen, evenals complexere morfologische uitkomsten isotropie, clustering, oriëntatie en meer. Deze technieken zijn ook niet beperkt tot kanker, doordat deze kleur- en kwantificatiewetenschappen kunnen worden gebruikt voor eventuele hersenanalyses, zoals aangetoond in onze representatieve Protein Atlas-kwantificering van gezond weefsel, en onze eerder gepubliceerde vergelijking met epileptisch hersenweefsel 11 .

Kritieke stappen binnen dit protocol omvatten de juiste incubatie en ontwikkeling van de chromogene secundaire. Zorg ervoor dat de chromogene kleurstof niet overontwikkelt. Dit maakt het moeilijk om te onderscheiden tussen positieve kleuring en achtergrond. De ontwikkelingstijd varieert afhankelijk van het gebruikte substraatreagens en de affiniteit van het primaire antilichaam. We gebruiken helder veldMicroscopie om de ontwikkeling te monitoren om optimale kleuring te waarborgen, terwijl achtergrondkleuring wordt geminimaliseerd. Na het vullen kan de juiste drempel tijdens de analyse helpen om de achtergrond van positief kleuring te differentiëren. Een belangrijke beperking voor deze methode is het onvermogen om meerdere componenten in hetzelfde weefselmonster te vleken door het gebruik van chromogene kleuringontwikkeling. Immunofluorescentie-analyse kan op een soortgelijke manier uitgevoerd worden, maar vereist een wijziging van de in deze werkwijze besproken instrumenten.

Specifiek voor glioblastoom, zijn er een aantal merkers en cellulaire vlekken die gebruikt zijn om patiëntmonsters te analyseren. Deze omvatten IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 als prognostische markers, evenals CD11b en CD45 voor microglia en macrofagen 18 , 19 . Onze methode breidt dit soort analyses uitNaar de cellulaire micro-omgeving, een vaak over het hoofd gezien in de tumor micro-omgeving in glioblastoom. Studies hebben gekeken naar de aanwezigheid en de dichtheid van microglia in tumoren 20 , 21 , 22 en bijdragen van astrocyten 9 , 23 , 24 . Hier hebben we een protocol ontwikkeld om alle glia-astrocyten, microglia en oligodendrocyten te onderzoeken - in de micro-omgeving van de hersentumor en om de aangrenzende of invasieve gebieden van de tumor van het tumorvolume te differentiëren, waar markers gewoonlijk in deze tumoren worden geïdentificeerd. Daardoor vinden wij dat we de patiëntensituatie nauwkeuriger kunnen beoordelen omdat we de intra-patiënt heterogeniteit hebben bepaald en in onze eerdere publicatie bleek dat de analyse van deze locaties en inclusie in statistische modellen sterker is bij het voorspellen van resultaten dan welke locatie aloNe of algemene monsters 11 . Aangezien het invloeden van glioblastoom zo diffuus is, waardoor het moeilijk is om volledig 1 , 2 te resecteren, denken we dat het weefsel in de aangrenzende gebieden meer representatief is voor het invasieve weefsel dat achterblijft na resectie, wat bijdraagt ​​aan onvermijdelijk herhaling. Daarom kan beter inzicht in de aangrenzende gebieden meer informatie geven over ziekteherhaling en planning van patiëntenbehandeling, in tegenstelling tot het traditioneel bestudeerde bulkweefsel dat vóór behandeling bij glioblastomepatiënten wordt geresecteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Drs. Fahad Bafakih en Jim Mandell voor het verkrijgen en identificeren van patiëntmonsters, Garrett F. Beeghly voor hulp bij immunohistochemie, en de Biorepository and Tissue Research Facility, de Histologie Core van het Cardiovasculaire Research Center en de Biomoleculaire Analysefaciliteit aan de Universiteit van Virginia voor hulp bij Voorbeeldverwerving, immunohistochemie en beeldvorming.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution Vector Labs H-3301
TBS
Triton-X Amresco 9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1  abcam  ab56777
Anti-Iba1  abcam  ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1  abcam  ab53041
ImmPRESS anti-goat Vector Labs MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) Vector Labs MP-7500
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich 216763
ImmPACT DAB substrate Vector Labs SK-4105
Hematoxylin counterstain ThermoScientific 72404
Histochoice Mounting Media Amresco H157-475
Aperio Scanscope Leica Biosystems
Image Scanscope Leica Biosystems
Super HT PAP Pen Research Products International 195506

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114, (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61, (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135, (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4, (127), 127ra36 (2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15, (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19, (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103, (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23, (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4, (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162, (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483, (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103, (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7, (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54, (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81, (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89, (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19, (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37, (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8, (1), e54752 (2013).
Kwantitatieve immunohistochemie van de cellulaire microomgeving bij patiëntenglioblastoomresecties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).More

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter