Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen
Summary
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.
Abstract
Mit dem wachsenden Interesse an der Tumor-Mikroumgebung haben wir uns bemüht, eine Methode zur spezifischen Bestimmung der Mikroumgebungskomponenten innerhalb von Patientenproben von Glioblastom, dem tödlichsten und am meisten invasiven Hirntumor, zu entwickeln. Es sind nicht nur quantitative Methoden, die für die genaue Beschreibung von erkrankten Geweben von Vorteil sind, sondern auch potenziell zu einer genaueren Prognose, Diagnose und Entwicklung von gewebetechnischen Systemen und Ersetzungen beitragen. Im Glioblastom wurden Gliazellen, wie Mikroglia und Astrozyten, unabhängig mit einer schlechten Prognose auf der Grundlage der Pathologieabstufung korreliert. Der Zustand dieser Zellen und anderer Gliazellenkomponenten ist jedoch nicht quantitativ gut beschrieben worden. Dies kann aufgrund der großen Prozesse, die diese Gliazellen markieren, schwierig sein. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten histologischen Analysen auf die gesamte Gewebeprobe oder nur innerhalb der Masse des Tumors, im Gegensatz zu der Abgrenzung von Quantifizierungen, die auf Regionen basierenHin das sehr heterogene Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode zur Identifizierung und quantitativen Analyse der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumormasse und angrenzenden Regionen der Tumorresektionen von Glioblastompatienten. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen bei Patienten-Tumor-Resektionen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Glia-Population zu analysieren. Mit diesen Techniken sind wir in der Lage, die Gliazellen in allen Regionen der Gliom-Tumor-Mikroumgebung besser zu beschreiben.
Introduction
Glioblastom (GBM), der häufigste und bösartige Hirntumor, zeichnet sich durch eine stark diffuse Invasion aus der primären Tumormasse in das umgebende gesunde Gehirnparenchym 1 , 2 aus . Diese diffuse Invasion macht den Tumor besonders schwierig, vollständig zu resezieren, und die eindringenden Krebszellen, die nach der Therapie bleiben, ist der häufigste Grund für unvermeidliches Rezidiv 2 , 3 , 4 . Bisher fanden wir die diffuse Gliom Zellinvasion Hemmung therapeutisch vorteilhaft 5, wird jedoch wenig über die komplexen Mechanismen bekannt ist GBM Invasion beitragen. Die Tumor-Mikroumgebung oder das Gewebe, das den Krebs umgibt, wurde in die Progression von Tumoren in mehreren Krebsarten 6 , 7 verwickelt. Die Glioblastom-Tumor-Mikroumgebung, in pArtikulär, ist relativ unter- charakterisiert und ist eindeutig komplex und komponiert mehrere Gliazellen wie Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten sowie extrazelluläre Matrix, lösliche Faktoren und biophysikalische Faktoren. Experimentell wurde gezeigt, dass Astrozyten und Mikroglia die Gliomprogression und Invasion 8 , 9 , 10 erhöhen, aber die Zusammensetzung aller Gliazellen in der nativen menschlichen Gehirnmikroumgebung ist unbekannt.
Wir haben zuvor gezeigt, dass mikroumweltliche Komponenten das Überleben des Patienten durch quantitative Analyse der zellulären Komponenten der Glioblastom-Mikroumgebung vorhersagen und unsere Analysen in ein proportionales Gefahrenmodell 11 einbinden können. Hier beschreiben wir die quantitative Analyse Methode zur Identifizierung der Populationen von Gliazellen innerhalb der Tumor-Masse und angrenzenden Regionen der Tumor-Resektionen von Glioblastom-PatientenS. Wir verwendeten die chromogene Immunhistochemie, um die Gliazellpopulationen und ImageJ zu identifizieren, um die prozentuale Abdeckung der Färbung für jede Gliapopulation zu analysieren. Die Beurteilung der prozentualen Abdeckung schafft eine einfache Messung zur Bestimmung der morphologischen Unterschiede der Zellen, insbesondere derjenigen, die durch Wechselwirkungen mit Krebszellen betroffen sind. Frühere Studien zur Quantifizierung der histopathologischen Färbung verwenden Standardfärbung wie Hämatoxylin und Eosin 12 oder Masson's Trichrom 13 , die nicht die Spezifität der Antikörper-basierten Immunhistochemie-Färbung nutzen. Unsere Methode wurde entwickelt, um die Gliapopulationen innerhalb der Glioblastom-Patienten-Tumor-Resektionen direkt zu quantifizieren, die wir zur Aufklärung der komplexen Glioblastom-Mikroumgebung anstreben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere hier vorgeschlagene Methode ist ein quantitativer Ansatz zur Analyse von histologischen Proben, die mit der traditionellen chromogenen Immunhistochemie gefärbt wurden. Die aktuelle Methodik für diese Art von Analyse umfasst ähnliche Färbeprotokolle, gefolgt von der Einstufung durch unabhängige Pathologen. Diese Methode ist zuverlässig, aber für eine Reihe von Anwendungen ist ein präziseres Verständnis der zellulären Make-up erforderlich, wie ein besseres Verständnis der Heterogenität im Zusammenhang m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Drs. Fahad Bafakih und Jim Mandell für die Erfassung und Identifizierung von Patientenproben, Garrett F. Beeghly für die Unterstützung der Immunhistochemie sowie die Biorepository und Tissue Research Facility, das Herz-Kreislauf-Forschungszentrum Histology Core und die Biomolekulare Analyse-Fazilität an der University of Virginia für die Unterstützung mit Probenerfassung, Immunhistochemie und Bildgebung.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
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