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Medicine

रोगी ग्लोबब्लास्टोमा शर्त्तेंशन में सेल्यूलर माइक्रोएनेरनर की मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री

doi: 10.3791/56025 Published: July 31, 2017

Summary

क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजजे का उपयोग करते हुए glioblastoma रोगी शोधन में ट्यूमर माइक्रोएन्निनर घटकों की मात्रात्मक रूप से पहचान करने के लिए यह प्रोटोकॉल विकसित किया गया था।

Abstract

ट्यूमर माइक्रोएनेवायरमेंट में बढ़ती रुचि के साथ, हम ग्लिब्ब्लास्टोमा के सबसे खराब और सबसे आक्रामक मस्तिष्क कैंसर के रोगी के नमूनों के भीतर विशेष रूप से microenvironment घटकों का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए तैयार हैं। न केवल रोगग्रस्त ऊतकों का सही वर्णन करने के लिए फायदेमंद मात्रात्मक विधियां हैं, वे संभावित सटीक पूर्वानुमान, निदान और ऊतक-इंजीनियर प्रणाली और प्रतिस्थापन के विकास में भी योगदान कर सकते हैं। ग्लियोब्लास्टोमा में, माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स जैसे ग्लिएल कोशिका, रोगविज्ञानी ग्रेडिंग के आधार पर स्वतंत्र रूप से खराब निदान के साथ जुड़े हुए हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं और अन्य ग्लियाय सेल घटकों की स्थिति को मात्रात्मक रूप से वर्णित नहीं किया गया है। बड़ी प्रक्रियाओं के कारण यह ग्लियाल कोशिकाओं को चिह्नित करने में मुश्किल हो सकती है। इसके अलावा, सबसे ऊतक विज्ञान समग्र टिशू नमूने पर केंद्रित है या केवल ट्यूमर के थोक के भीतर, जैसा कि क्षेत्रों के आधार पर वर्णित मात्रा के अनुसार विरोधबेहद विषम ऊतक हिन यहां, हम ग्लूब्लास्टोमा के मरीजों से ट्यूमर बल्क और ट्यूमर रिसेशंस के आसन्न क्षेत्रों के भीतर ग्लील कोशिकाओं की आबादी को पहचानने और मात्रात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। हम क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री का उपयोग रोगी ट्यूमर रिजक्शन और इमेजजे में ग्लियाल सेल आबादी की पहचान करने के लिए किया था, जो प्रत्येक ग्लैबल आबादी के लिए धुंधला के प्रतिशत कवरेज का विश्लेषण करता है। इन तकनीकों के साथ हम glioma tumor microenvironment के क्षेत्रों में glial cells का बेहतर वर्णन करने में सक्षम हैं।

Introduction

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ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), सबसे आम और घातक मस्तिष्क कैंसर है, जिसे प्राथमिक ट्यूमर बल्क से लेकर अत्यधिक स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा 1 , 2 में फैलता हुआ आक्रमण होता है। यह फैलाना आक्रमण ट्यूमर को विशेष रूप से resect के लिए मुश्किल बना देता है, और अपरिवर्तनीय पुनरावृत्ति 2 , 3 , 4 का सबसे आम कारण पोस्ट-थेरेपी वाले हमलावर कैंसर कोशिकाएं हैं। इससे पहले, हम बाधा फैलाना तंत्रिकाबंधार्बुद सेल आक्रमण उपचारात्मक लाभकारी 5 हो पाया, हालांकि थोड़ा जीबीएम आक्रमण के लिए योगदान दे जटिल तंत्र के बारे में जाना जाता है। कैंसर के आस-पास ट्यूमर माइक्रोएनेरिवन या ऊतक, कई कैंसर 6 , 7 में ट्यूमर की प्रगति में फंस गया है। ग्लोबोब्लास्टोमा ट्यूमर माइक्रोएनेयरमेंट, पी मेंसांप की तरफ, अपेक्षाकृत कम-विशेषता है और विशिष्ट ग्लोबल कोशिकाओं, जैसे कि एस्ट्रोसाइट्स, माइक्रोग्लिया, और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, साथ ही बाह्य मैट्रिक्स, घुलनशील कारक, और बायोफिजिकल कारकों को बनाते हुए विशिष्ट रूप से जटिल है। प्रयोगात्मक रूप से, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोलिया को ग्लियोमा प्रगति और आक्रमण 8 , 9 , 10 को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, लेकिन देशी मानव मस्तिष्क सूक्ष्म वातावरण में सभी ग्लिअल कोशिकाओं की संरचना अज्ञात है।

हमने पहले दिखाया है कि माइक्रोएनेनलिअनल घटकों ने ग्लिब्लास्टोमा माइक्रोएनेरमेंट के सेल्यूलर घटकों का मात्रात्मक विश्लेषण करके रोगी के अस्तित्व का अनुमान लगाया है और हमारे विश्लेषण को आनुपातिक खतरे मॉडल 11 में शामिल कर सकते हैं । यहां, हम ग्लोब्लास्टोमा रोगी से ट्यूमर बल्क और ट्यूमर रिजक्शन के आसन्न क्षेत्रों में ग्लील कोशिकाओं की आबादी की पहचान करने के लिए मात्रात्मक विश्लेषण पद्धति का वर्णन करते हैं।रों। हम glial सेल आबादी और ImageJ प्रत्येक glial आबादी के लिए धुंधला के प्रतिशत कवरेज का विश्लेषण करने के लिए पहचान करने के लिए क्रोमोजेनिक immunohistochemistry का इस्तेमाल किया। प्रतिशत कवरेज का आकलन कोशिकाओं के आकार संबंधी मतभेदों को निर्धारित करने के लिए एक साधारण माप बनाता है, खासकर कैंसर कोशिकाओं के साथ बातचीत से प्रभावित। हिस्टोपैथोलॉजिकल स्टेंसिंग का इस्तेमाल करने के लिए पिछला अध्ययन मानक स्टेनाइकिंग जैसे कि हेमटोक्सीलीन और ईोसिन 12 या मैसन ट्राइकोम 13 , जो एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्केनिंग की विशिष्टता का लाभ नहीं लेते। ग्लोबोब्लास्टोमा रोगी ट्यूमर रिजक्शन के भीतर सीधे ग्लिबल आबादी को मापने के लिए हमारी पद्धति विकसित की गई थी, जिसका उद्देश्य हम जटिल ग्लोबोब्लास्टोमा माइक्रोएन्नेन्मेंट को स्पष्ट करने के लिए उपयोग करना चाहते हैं।

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Protocol

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यह प्रोटोकॉल सेल्युलर अवयवों को औपचारिक-निर्धारण वाले पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) नमूनों में पहचानता है, जैसा कि बैंकेड नैदानिक ​​रोगी के नमूने के लिए विशिष्ट है। पैराफिन एम्बेडिंग सेलुलर और टिशू आकृति विज्ञान के सर्वोत्तम रखरखाव के साथ-साथ अनुभागों की बेहतर लंबी अवधि भी प्रदान करता है। इस विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया नमूने वर्जीनिया बायोरपोशटरी और ऊतक अनुसंधान सुविधा विश्वविद्यालय के माध्यम से उपयोग किया गया। रोगी के नमूनों का चयन ग्लूब्लास्टोमा (एस्ट्रोसाइटोमा, डब्लूएचओ ग्रेड IV) के एक निश्चित निदान के आधार पर एक न्यूरोपैथोलॉजिस्ट द्वारा किया गया था, जिन्होंने 2010 और 2013 के बीच वर्जीनिया विश्वविद्यालय में ट्यूमर रिजक्शन पूरा किया था, और इस विश्लेषण 11 से पहले की पहचान नहीं की गई थी।

1. एफएफपीईई नमूना डिपार्फिनाइजेशन और रीहायड्रेशन

नोट: प्रोटोकॉल का यह भाग FFPE नमूनों के लिए विशिष्ट है। सेलुलर और टी के संरक्षण के कारण पैराफिन-एम्बेडेड नमूने इस विश्लेषण के लिए अधिक उपयोगी हो सकते हैंमुद्दा आकारिकी, यह विश्लेषण जमे हुए वर्गों के साथ भी किया जा सकता है। अगर जमे हुए वर्गों का उपयोग करना है, तो यह भाग छोड़ा जा सकता है और सीधे क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पर आगे बढ़ सकता है।

  1. प्रत्येक 5 मिनट के लिए निम्नलिखित व्यंजन करें: Xylene, Xylene, 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 70% इथेनॉल, विआयनीकृत जल, विहीन पानी

2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति

नोट: एफएफपीई नमूनों के औपचारिक रूप से फिक्सिंग के दौरान बनाई गई मेथिलिन पुलों को तोड़ने के लिए प्रोटोकॉल का यह हिस्सा आवश्यक है और एंटीबॉडी बाइंड करने के लिए एंटीजन साइट्स को बेनकाब करना है।

  1. डिस्टिल्ड वॉटर में निर्माता की सिफारिश में ट्रिस-आधारित उच्च पीएच एंटीजन अनमास्किंग समाधान को पतला करें।
  2. एक माइक्रोवेव का उपयोग करके गर्मी-मध्यस्थता एंटीजन पुनर्प्राप्ति करें। अन्य प्रकार के गर्मी-मध्यस्थता पुनर्प्राप्ति (जैसे प्रेशर कुकर, सब्जी स्टीमर या उबलते पानी) भी पर्याप्त होगा।
    1. गैर सीलबंद माइक्रोवेवयोग्य में पतला अनमास्किंग समाधान जोड़ेंपतीला। पोत में स्लाइड लगाएं। माइक्रोवेव में स्लाइड्स रखें
    2. उच्च शक्ति पर 20 मिनट के लिए उबाल लें। वाष्पीकरण के लिए तरल स्तर की निगरानी करें, और आसुत जल के साथ जरूरी रूप से फिर से भरें।
  3. नमूनों को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान में ठंडा करने दें।

3. क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री

  1. नमूना को कवर करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा को कम करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक पेन के साथ बाह्यरेखा ऊतक नमूना।
    नोट: ऊतक के नमूने हाइड्रेटेड रखने के लिए सुनिश्चित करें और उन्हें सूखा न दें क्योंकि इससे धुंधला प्रभावकारिता को प्रभावित होगा।
  2. पाइप के लिए पर्याप्त permeabilization समाधान (ट्रिस-बफ़ेड खारा (टीबीएस) + 0.01% ट्राइटॉन-एक्स) ऊतक नमूना को कवर करने के लिए (आमतौर पर लगभग 100 - 200 μL)।
  3. निकालें और समाधान त्यागें और चरण 3.2 दोहराएं।
  4. अवरुद्ध समाधान (2.5% घोड़े सीरम + पारगम्यता समाधान) के साथ कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं।
  5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस से रातोंरात सेते हैं जो प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पतला होते हैंअवरुद्ध समाधान में
    नोट: यहां इस्तेमाल किए जाने वाले सभी प्राथमिक एंटीबॉडी 1: 200 में पतले हैं, लेकिन निर्माता की सिफारिश के साथ शुरू होने वाले धारावाहिक द्रव्यों के उपयोग से इष्टतम मंथन निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एंटीबॉडी के बारे में विस्तृत जानकारी पहले 11 प्रकाशित हुई थी
  6. निर्माता प्रोटोकॉल के बाद प्राथमिक एंटीबॉडी होस्ट पशु से संबंधित एक हॉर्सडाडिश पेरोक्साइड पॉलिमर अभिकर्मक का उपयोग कर प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाएं।
  7. ऊतक के नमूने को कवर करने और 5 मिनट के लिए सेते रहने के लिए पाइप पर्याप्त पारगम्यता समाधान
  8. समाधान निकालें और त्याग दें और चरण 3.7 को दोहराएं।
  9. 15 मिनट के लिए 1x टीबीएस में 0.3% एच 22 में स्लाइड करें।
  10. एक पेरोक्साइड हिरिनोबेंजिडाइन (डीएबी) सब्सट्रेट के साथ 2 से 10 मिनट तक नमूनों का विकास करना आवश्यक वांछित दाग की तीव्रता प्राप्त होती है।
  11. निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद सेल नाभिक की पहचान करने के लिए काउंटरस्टेन नमूनों, जैसे कि हेमटैक्साइलिन के साथ।
  12. 100% के साथ नमूनों का निर्जलीकरणइथेनॉल और xylene
  13. बढ़ते मीडिया के साथ स्थायी रूप से माउंट नमूने

4. ब्याज पहचान के क्षेत्र

  1. उच्च संकल्प छवियों में सक्षम चमकदार माइक्रोस्कोपी के तहत छवि स्लाइड।
    नोट: न्यूनतम 20x रिजोल्यूशन पर इमेजिंग सेल्युलर घटकों का उपयोग करें।
  2. ऊतक नमूनों में रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों में कैमरे को ले जाएं।
  3. मात्रात्मकता के लिए चित्रों को TIFF के रूप में सहेजें

5. छवि विश्लेषण

  1. प्रतिशत कवरेज की मात्रा का ठहराव के लिए ImageJ में ओपन छवियां।
  2. हेमटॉक्सिलीन सना हुआ नाभिक से बैंगनी रंग को हटाने के लिए थ्रेसहोल्ड रंग प्लगइन का उपयोग करें।
  3. छवि को 8-बिट में कनवर्ट करें
  4. गहरा पृष्ठभूमि के बिना थ्रेशोल्ड जोड़ें
  5. 17 प्री लोडेड इमेजजे थ्रेसहोल्ड फिल्टर ( यानी मैक्सएएनट्रॉपी) में से एक का उपयोग कर छवि को प्रोसेस करें, इसलिए केवल थपका दाग वाले भाग को थ्रेशोल्ड में शामिल किया गया है।
    नोट: इष्टतम पूर्व लोड थ्रेसहोल्ड फ़िल्टर का चयन करें जो न्यूनतमपृष्ठभूमि धुंधला हो जाना शामिल है यह एंटीबॉडी के धुंधला हो जाना और विशिष्टता की गुणवत्ता पर निर्भर कर सकता है प्रत्येक रोगी के नमूने के भीतर सभी तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए समान दहलीज का उपयोग करें।
  6. थ्रेशोल्ड लागू करें
  7. थ्रेसहोल्ड छवि का प्रतिशत क्षेत्र मापें।
  8. प्रत्येक नमूने के भीतर कई क्षेत्रों के लिए औसत प्रतिशत क्षेत्र कवरेज।

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Representative Results

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इस विश्लेषण के लिए, हमारे ट्यूमर रिजक्शन के अंदर हितों के दो क्षेत्रों - प्राथमिक ट्यूमर बल्क और आसन्न क्षेत्रों, मुख्य रूप से कैंसर कोशिकाओं ( चित्रा 1 ए , 1 बी ) पर आक्रमण के साथ स्वस्थ ऊतक से बना है - हेमटॉक्साइलिन और ईोसिन सना हुआ रोगी नमूने हैं। प्रत्येक मरीज के नमूने के भीतर, क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से एस्ट्रोसाइट्स ( चित्रा 1 सी ), माइक्रोग्लिया ( चित्रा 1 डी ), और ऑलिगोडेन्ड्रोसाइट्स ( चित्रा 1 ई ) के लिए सकारात्मक धुंध की पहचान की गई थी। ये आबादी क्रमश: 11 प्राथमिक प्रतिरक्षी ALDH1L1, Iba1, और Oligodendrocyte विशिष्ट प्रोटीन (OSP1) का उपयोग पहचान की गई। एंटीबॉडी dilutions के अनुकूलन की सिफारिश की है, साथ ही निर्माता प्रोटोकॉल के साथ परामर्श करने के लिए यह पुष्टि करने के लिए कि धुंधला हो जाना सही और सकारात्मक है ( चित्रा 2 )। उदाहरण के लिए, हमने नकारात्मक नियंत्रण ( चित्रा 2 ए ) के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला किया, निर्माता ने सिफारिश की ( चित्रा 2 बी ), और आगे dilutions ( चित्रा 2 सी , 2 डी ) 1: 200 कमजोर पड़ने पर निपटने से पहले ( चित्रा 2 सी ) के कारण सेल बॉडी के इष्टतम सकारात्मक धुंधला और विरोधी ALDH1L1 एंटीबॉडी के लिए पृष्ठभूमि को कम करने के साथ प्रक्रियाएं

इमेजजे का उपयोग, ओएसपी 1 + ऑलिगोडेंड्रोसाइट स्टेनिंग का प्रतिशत कवरेज ब्याज के हमारे क्षेत्रों ( चित्रा 3 ए ) में अंतर की तुलना करने के लिए मात्रा निर्धारित किया गया था। सकारात्मक दाग धुंधला हो जाना ( चित्रा 3 बी ) का आकलन करने के लिए हमने थ्रेसहोल्ड रंग प्लगइन का उपयोग करते हुए छवि से काउंटरस्टेडेड नाभिक को निकाल दिया। छवि को 8bit में परिवर्तित करने के बाद (Ss = "xfig"> चित्रा 3C), हमने मैक्सएन्ट्रोपी डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड को शेष सकारात्मक डेब स्नेनिंग ( चित्रा 3 डी ) में लागू किया। यहां, हमने मैक्स एंट्रोपी थ्रेसहोल्ड डिफॉल्ट का इस्तेमाल किया है क्योंकि पृष्ठभूमि को कम करने के दौरान इस विशेष डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड ने सबसे अच्छा कब्जा कर लिया है, लेकिन ब्याज की आबादी का विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए अलग थ्रेसहोल्ड का उपयोग किया जा सकता है। एक बार उचित सीमा को छवि ( चित्रा 3 ई ) पर लागू किया गया है, थ्रेसहोल्ड से प्रतिशत कवरेज ( चित्रा 3F ) मापा जा सकता है और कई मरीजों की तुलना में। यहां, हम ब्याज के क्षेत्र के कुल क्षेत्रफल के आधार पर, हित के प्रत्येक क्षेत्र के भीतर 3-5 क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित करते हैं, और ग्राफपेड प्रिज्म सॉफ्टवेयर के साथ युग्मित टी-टेस्ट का उपयोग करते हुए समूहों की तुलना करते हैं। हमने हमारे जीबीएम की तुलना प्रोटीन एटलस डाटाबेस ( चित्रा 3 एफ ) में स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों में पाया गया है। हमारे में पिछले प्रकाशन, हमने पूरे 33 मरीजों में एक से अधिक माइक्रोएनवियोननल घटकों (एस्ट्रोसाइट्स, माइक्रोलिआ, ऑलिउडोडेक्रेसाइट्स और रक्त वाहिकाओं) के लिए इस विश्लेषण का इस्तेमाल किया था ताकि कुल मरीज के अस्तित्व 11 की भविष्यवाणी के लिए एक आनुपातिक खतरे मॉडल विकसित किया जा सके।

आकृति 1
चित्रा 1 : ग्लियाल सेल के लिए ट्यूमर बल्क और ट्यूमर के ब्याज क्षेत्र के साथ तुलना।
ए) रोगी 63 से पूरे ट्यूमर का नमूना हेमटॉक्साइलिन और ईओसिन के साथ थोक और आसन्न क्षेत्रों के साथ दाग लगा। बी) हेमटॉक्सिलिन और ईोसिन धुंधला, सी) ALDH1L1 + astrocytes, डी) Iba1 + माइक्रोग्लिया, और ई) ऑलिगोडेड्रोसाइट विशिष्ट प्रोटीन -1 (ओएसपी 1) + ऑलिगोडेन्ड्रोसाइट्स। स्केल बार = 100 माइक्रोन 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 : एंटी- ALDH1L1 एंटीबॉडी का उदाहरण का शीर्षक
ए) नकारात्मक नियंत्रण, बी) स्टॉक 1:70 निर्माता स्टॉक से सिफारिश कमजोर पड़ने, सी) स्टॉक से 1: 200 कमजोर पड़ने, और डी) 1: 400 कमजोर पड़ने। 1: 200 कमजोर पड़ने का उपयोग धुंधला हो जाना और विश्लेषण के लिए किया गया था जिससे सेल बॉडी के इष्टतम सकारात्मक धुंधला हो और पृष्ठभूमि को कम से कम किया जा सके। स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 3 : ImageJ विश्लेषण और Oligodendrocytes के लिए क्षेत्र कवरेज का मात्रा।
ए) मूल OSP1 + रोगी का धुंधला 52. बी) थ्रेसहोल्ड_Colour प्लगइन का उपयोग करके बैंगनी नाभिक को हटाने सी) 8 बिट रूपांतरण डी) मैक्सएन्ट्रॉपी दहलीज पर कब्जा कर लिया और ई) पृष्ठभूमि धुंधला को कम करने के लिए लागू। एफ) पांच मरीज के नमूनों में आसन्न और थोक क्षेत्रों की तुलना, साथ ही ओएसपी 1 + प्रतिशत कवरेज के लिए प्रोटीन एटलस के माध्यम से स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतक। *** पी <0.001, **** p <0.0001 बनती टी-टेस्ट के माध्यम से स्केल बार = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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हमारे यहां प्रस्तावित पद्धति पारंपरिक क्रोमोजेनिक इम्यूनोहिस्टोकेमिसरी का उपयोग करते हुए दाँव के ऊतक संबंधी नमूने का विश्लेषण करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण है। इस प्रकार के विश्लेषण के लिए मौजूदा पद्धति में स्वतंत्र रोगविज्ञानियों द्वारा ग्रेडिंग के बाद के समान धुंधला प्रोटोकॉल शामिल हैं। यह विधि विश्वसनीय है, फिर भी कई अनुप्रयोगों के लिए, सेलुलर मेक-अप की एक अधिक सटीक समझ आवश्यक है, जैसे ट्यूमर से संबंधित विविधता की बेहतर समझ और इन विट्रो अध्ययन के लिए ट्यूमर के सटीक पुनर्लेखन।

यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएनेरेंचर के भीतर ग्लील कोशिकाओं की आबादी का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक सरल तकनीक को दर्शाता है। यह तकनीक व्यापक रूप से अनुकूलनीय है और सूक्ष्म ऊर्जा के कई अन्य घटकों, जैसे कि रक्त वाहिकाओं, केमोकाइंस, और अधिक, साथ ही अन्य कैंसर, जैसे स्तन या अग्नाशयी, की पहचान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है, जहां ट्यूमर के रिजक्शन हो सकते हैंबड़े पैरेन्चिमल क्षेत्रों इसके अलावा, इस तकनीक को अन्य माप प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि गिनती और कोशिका आकृति का आकलन करने के लिए कोशिकाओं की परिधि, साथ ही अधिक जटिल आकारिकी परिणाम आइसोटोप, क्लस्टरिंग, अभिविन्यास और अधिक। इन तकनीकों को कैंसर तक भी सीमित नहीं किया जाता है, क्योंकि इन धुंधलापन और मात्रा का ठहराव के तरीकों का उपयोग किसी भी मस्तिष्क के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जैसा कि हमारे प्रतिनिधि प्रोटीन एटलस स्वस्थ ऊतकों की मात्रा का ठहराव में दर्शाया गया है, और हमारे पहले प्रकाशित मिर्गी मस्तिष्क के ऊतक 11 के साथ

इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदमों में उचित ऊष्मायन और क्रोमोजेनिक माध्यमिक के विकास शामिल हैं। देखभाल की जानी चाहिए कि क्रोमोोजेनिक डाई अधिक विकसित नहीं होता है। इससे सकारात्मक धुंधला हो जाना और पृष्ठभूमि के बीच अंतर करना मुश्किल हो जाएगा। विकास का समय सब्सट्रेट अभिकर्मक और प्राथमिक एंटीबॉडी के संबंध के आधार पर भिन्न होता है। हम उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करते हैंमाइक्रोस्कोपी पृष्ठभूमि धुंधला को कम करते हुए इष्टतम धुंधला सुनिश्चित करने के लिए विकास की निगरानी करने के लिए धुंधला होने के बाद, विश्लेषण के दौरान उचित थ्रेसहोल्डिंग सकारात्मक धुंधला होने से पृष्ठभूमि को अलग करने में मदद कर सकता है। क्रोमोजेनिक धुंधला विकास के उपयोग के कारण इस विधि के लिए एक बड़ी सीमा एक ही ऊतक के नमूने के भीतर कई घटकों को दागने में असमर्थता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण इसी प्रकार से किया जा सकता है, लेकिन इस विधि में चर्चा की गई उपकरणों के संशोधन की आवश्यकता है।

ग्लोबोब्लास्टोमा के लिए विशिष्ट, रोगियों के नमूनों के विश्लेषण के लिए कई मार्कर और सेलुलर दाग हैं। इसमें आईडीएच 1 14 , 15 , ईजीएफआरवीआईआईआई 16 , 17 को पूर्वनिश्चित चिन्हक के रूप में, साथ ही साथ सीडी 11 बी और सीडी 45 माइक्रोग्लिया और मैक्रोफेज 18 , 1 9 शामिल हैं । हमारी पद्धति इस प्रकार के विश्लेषण का विस्तार करती हैसेलुलर माइक्रोएनेयरमेंट के लिए, ग्लिब्ब्लास्टोमा में ट्यूमर माइक्रोएनेयरमेंट का एक अनदेखी वाला घटक अध्ययन ने माइक्रोग्लिया उपस्थिति और ट्यूमर 20 , 21 , 22 के साथ-साथ एस्ट्रोसाइट 9 , 23 , 24 के योगदान में घनत्व को देखा है। यहां हमने ट्यूमर बल्क से ट्यूमर के आसन्न या इनवेसिव क्षेत्रों को अलग करने के लिए मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएनेयरमेंट में सभी ग्लिया - एस्ट्रोसाइट्स, माइक्रोलिआ, और ऑलिउडोडेन्डोसाइट्स की जांच कर एक प्रोटोकॉल विकसित किया है, जहां पर इन ट्यूमर में आमतौर पर मार्करों की पहचान की जाती है। ऐसा करने से, हम मानते हैं कि हम मरीज की स्थिति का अधिक सटीक आकलन कर सकते हैं क्योंकि हमने अंतर-रोगी की विविधता निर्धारित की है और हमारे पिछले प्रकाशन से पता चला है कि इन स्थानों का विश्लेषण और सांख्यिकीय मॉडल में शामिल किए जाने से परिणाम या तो स्थान की तुलना में परिणामों की भविष्यवाणी में मजबूत है।Ne या समग्र नमूने 11 इसके अलावा, चूंकि ग्लोबब्लास्टोमा आक्रमण बहुत फैल गया है, इसलिए इसे पूरी तरह से 1 , 2 को रीसेट करने में मुश्किल होती है, हम मानते हैं कि निकटवर्ती क्षेत्रों में ऊतक को आक्षेपकारी ऊतक का अधिक प्रतिनिधि है जो लापरवाही के पीछे छोड़ दिया जाता है, जिससे अनिवार्य पुनरुत्थान में योगदान होता है। इसलिए, आसन्न क्षेत्रों की बेहतर समझ, रोग पुनरावृत्ति और रोगी उपचार योजना के बारे में अधिक जानकारी दे सकती है, क्योंकि पारंपरिक रूप से अध्ययनित थोक टिशू के विपरीत जो कि ग्लोबोब्लास्टोमा मरीज़ों में चिकित्सा से पहले शोधित होता है।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

लेखक डीआरएस को धन्यवाद देते हैं फहद बफकिह और जिम मंडेल को रोगी के नमूने के अधिग्रहण और पहचान के लिए, गैरेट एफ बीगली को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ सहायता के लिए, और बायोरपोसिटरी और ऊतक अनुसंधान सुविधा, कार्डियोवस्कुलर रिसर्च सेंटर हिस्टोलोजी कोर और वर्जीनिया विश्वविद्यालय में बायोमोलेकुलर विश्लेषण सुविधा के साथ सहायता के लिए नमूना अधिग्रहण, immunohistochemistry, और इमेजिंग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution Vector Labs H-3301
TBS
Triton-X Amresco 9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1  abcam  ab56777
Anti-Iba1  abcam  ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1  abcam  ab53041
ImmPRESS anti-goat Vector Labs MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) Vector Labs MP-7500
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich 216763
ImmPACT DAB substrate Vector Labs SK-4105
Hematoxylin counterstain ThermoScientific 72404
Histochoice Mounting Media Amresco H157-475
Aperio Scanscope Leica Biosystems
Image Scanscope Leica Biosystems
Super HT PAP Pen Research Products International 195506

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References

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रोगी ग्लोबब्लास्टोमा शर्त्तेंशन में सेल्यूलर माइक्रोएनेरनर की मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री
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Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).More

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).

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