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Medicine

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

doi: 10.3791/56025 Published: July 31, 2017

Summary

이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.

Abstract

종양의 미세 환경에 대한 관심이 증대됨에 따라 가장 치명적이고 가장 침습적 인 뇌암 인 아교 모세포종 환자의 표본에서 미세 환경 성분을 구체적으로 결정하는 방법을 개발하기 시작했습니다. 병이있는 조직을 정확하게 묘사하기 위해 정량적 방법이 유용 할뿐만 아니라 잠재적으로 더 정확한 예후, 진단 및 조직 공학 시스템과 대체물의 개발에 기여할 수 있습니다. 아교 모세포종에서, 소교 세포 및 성상 세포와 같은 신경 교세포는 병리학 자의 등급에 기초하여 불량한 예후와 독립적으로 상관되어왔다. 그러나, 이들 세포 및 다른 교세포 구성 요소의 상태는 정량적으로 잘 기술되어 있지 않다. 이러한 glial 세포를 표시하는 큰 프로세스로 인해 어려울 수 있습니다. 또한 대부분의 조직 학적 분석은 전체 조직 표본에 초점을 맞추거나 종양의 대부 분에만 초점을 맞 춥니 다.매우 이질적인 조직. 여기, 우리는 glioblastoma 환자의 종양 절제술의 종양 대량 및 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하고 양적으로 분석하는 방법을 설명합니다. 우리는 색소 성 면역 조직 화학을 사용하여 환자의 종양 절제술에서 glial 세포 집단을 확인하고 ImageJ는 각 glial 집단에 대한 염색의 비율 범위를 분석했습니다. 이러한 기술로 우리는 신경 교종 종양 미세 환경의 영역에 걸쳐 신경아 교세포를 더 잘 묘사 할 수 있습니다.

Introduction

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아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 악성 뇌종양은 주변의 건강한 뇌 실질 1, 2에 기본 종양 부피에서 매우 확산 침공에 의해 특징입니다. 이 확산 침투는 종양을 완전히 절제하는 것을 특히 어렵게 만들고, 치료 후 남아있는 침입 암 세포는 피할 수없는 재발의 가장 흔한 원인입니다 2 , 3 , 4 . 이전에, 우리는 그러나 조금 GBM의 침략에 기여하는 복잡한 메커니즘에 대해 알려진, 확산 신경 교종 세포 침공 (5) 치료 도움이 될 억제 발견했다. 암 주변 종양 미세 환경, 또는 조직은,도 7은 여러 암 6 종양의 진행에 관여한다. 교 모세포종 종양 미세 환경, p관절염은 성상 세포, 미세 아교 세포 및 희소 돌기 아교 세포뿐만 아니라 세포 외 기질, 용해성 인자 및 생물 물리학 적 인자와 같은 다수의 신경교 세포를 구성하는 비교적 특징이 낮고 독특하게 복잡합니다. 실험적으로, 성상 세포 및 미세 아교 세포는 신경 교종의 진행과 침공 8, 9, 10을 증가시키는 것으로,하지만 원래 인간의 뇌의 미세 환경에있는 모든 신경 교세포의 구성을 알 수있다.

우리는 이전에 미세 환경 구성 요소가 glioblastoma microenvironment의 세포 구성 요소를 정량 분석하고 비례 위험 모델 11에 우리의 분석을 통합하여 환자의 생존을 예측할 수 있음을 보여주었습니다. 여기, 우리는 glioblastoma 환자에서 종양 대량 및 종양 절제의 인접 지역 내의 glial 세포의 인구를 식별하기위한 정량 분석 ​​방법을 설명합니다에스. 우리는 각질 세포군에 대한 염색의 비율 적용 범위를 분석하기 위해 염색체 면역 조직 화학을 사용하여 신경 교세포 집단과 ImageJ를 확인했습니다. 커버리지 비율을 평가하면 세포, 특히 암세포와의 상호 작용에 의해 영향을받는 세포의 형태 학적 차이를 측정하기위한 간단한 측정이 가능합니다. 조직 병리학 적 염색을 정량화하기위한 이전의 연구는 항체 기반 면역 조직 화학 염색의 특이성을 이용하지 않는 헤 마톡 실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin) 12 또는 Masson 's trichrome 13 과 같은 표준 염색법을 사용한다. 우리의 방법은 glioblastoma 환자의 종양 절제술에서 glial 집단을 직접 정량화하기 위해 개발되었으며, 복잡한 glioblastoma microenvironment를 밝히기 위해 사용합니다.

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Protocol

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이 프로토콜은 은행 임상 환자 샘플에 일반적 인 것처럼 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 샘플의 세포 구성 요소를 식별합니다. 파라핀 삽입은 세포 및 조직 형태의 최적 유지뿐만 아니라 절편의 수명을 연장시킵니다. 이 분석에 사용 된 샘플은 University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facility를 통해 확인할 수있었습니다. 환자 샘플은 2010 년과 2013 년 사이에 버지니아 대학에서 종양 절제술을 완료했다 아교 모세포종 (성상 세포종, WHO 등급 IV)의 최종 진단에 따라 신경 병리학에 의해 선정되었으며,이 분석 11 이전에 해제 확인되었다.

1. FFPE 샘플 탈 파라핀 및 재수 화

참고 : 프로토콜의이 부분은 FFPE 샘플에만 해당됩니다. 파라핀 포매 된 샘플은 세포 및 t의 보존 때문에이 분석에 더 유용 할 수 있지만형태학 문제를 해결하기 위해이 분석은 고정 된 섹션에서도 수행 할 수 있습니다. 동결 절편을 사용하는 경우이 부분을 생략하고 직접 발색 면역 조직 화학 법으로 진행할 수 있습니다.

  1. 크실렌, 크실렌, 100 % 에탄올, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올, 탈 이온수, 탈 이온수 각각 5 분 동안 다음 세척을 수행하십시오

2. 항원 검색

참고 : 프로토콜 의이 부분은 FFPE 샘플의 포르말린 고정하는 동안 형성된 메틸렌 다리를 깨고 항체가 바인딩 할 항원 사이트를 노출하는 데 필요합니다.

  1. 증류수 제조사의 권장 사항에 따라 Tris 기반 고 pH 항원 비 차단 용액을 희석하십시오.
  2. 전자 레인지를 사용하여 열 매개 항원 검색을 수행하십시오. 다른 형태의 열 중재 검색 (예 : 압력솥, 야채 증기선 또는 끓는 물)도 충분합니다.
    1. 희석 된 언 마스킹 용액을 밀봉되지 않은 전자 레인지에 첨가한다.용기. 슬라이드에 슬라이드를 넣으십시오. 슬라이드를 전자 레인지에 놓습니다.
    2. 고출력으로 20 분간 끓입니다. 증발을위한 액체 레벨을 모니터하고 필요에 따라 증류수를 보충하십시오.
  3. 실온에서 1 시간 동안 시료를 냉각시킨다.

3. 염색체 면역 조직 화학

  1. 샘플을 덮는 데 필요한 시약의 양을 최소화하기 위해 소수성 펜으로 조직 샘플의 윤곽을 잡습니다.
    참고 : 조직 샘플을 수분 상태로 유지하고 염색 효능에 영향을 미치기 때문에 건조시키지 마십시오.
  2. 조직 샘플 (일반적으로 약 100 - 200 μL)을 충당 할 수 있도록 충분한 투과성 용액 (TBS-TBS (Tris-buffered saline) + 0.01 % Triton-X)을 피펫에 넣습니다.
  3. 용액을 제거하고 버리고 3.2 단계를 반복하십시오.
  4. 블로킹 용액 (2.5 % 말 혈청 + 투과 액)으로 실온에서 샘플을 인큐베이션한다.
  5. 4 ºC에서 1 차 항체 희석 한 채 밤새차단 용액.
    참고 : 여기에 사용 된 모든 1 차 항체는 1 : 200으로 희석 되나 제조업체 권장 사항부터 일련 희석을 사용하여 최적 희석을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 항체에 대한 자세한 정보는 이전에 출판되었습니다 11 .
  6. 제조 프로토콜에 따라 일차 항체 호스트 동물에 해당하는 양 고추 냉이 퍼 옥시다아제 폴리머 시약을 사용하여 일차 항체를 검색합니다.
  7. 피펫은 조직 시료를 덮고 5 분 동안 배양하기에 충분한 투과성 솔루션을 제공합니다.
  8. 용액을 제거하고 버리고 3.7 단계를 반복하십시오.
  9. 15 분 1X TBS에서 0.3 % H 2 O 2 로 슬라이드를 품어.
  10. 원하는 염색 강도가 달성 될 때까지 peroxidase diaminobenzidine (DAB) 기질로 시료를 2 ~ 10 분 동안 발색하십시오.
  11. 헤 마톡 실린 (hematoxylin)과 같은 세포 핵을 확인하기 위해 샘플을 대조 제제 (counterstain)하여 제조사 프로토콜을 따른다.
  12. 100 %에탄올 및 자일 렌.
  13. 샘플을 마운팅 미디어로 영구 마운트하십시오.

4. 관심 지역

  1. 밝은 영역 현미경으로 이미지 슬라이드가 고해상도 이미지를 낼 수 있습니다.
    참고 : 이미징 셀룰러 구성 요소는 최소 20x 해상도로 사용하십시오.
  2. 조직 샘플 전체에서 특정 관심 영역으로 카메라를 이동하십시오.
  3. 이미지를 TIFF 파일로 저장하여 정량화하십시오.

5. 이미지 분석

  1. 이미지 적용 범위의 정량화를 위해 ImageJ에서 이미지를 엽니 다.
  2. Threshold Color 플러그인을 사용하여 hematoxylin으로 염색 된 핵에서 자주색을 제거합니다.
  3. 이미지를 8 비트로 변환하십시오.
  4. 어두운 배경없이 임계 값을 추가하십시오.
  5. 17 개의 미리로드 된 ImageJ 임계 값 필터 중 하나 ( 예 : MaxEntropy)를 사용하여 이미지를 처리하므로 DAB로 염색 된 부분 만 임계 값에 포함됩니다.
    참고 : 최소화 된 최적의 미리로드 된 임계 값 필터를 선택하십시오배경 염색의 포함. 이는 항체의 염색 및 특이성에 달려 있습니다. 각 환자 샘플 내의 모든 기술 복제물에 대해 동일한 임계 값을 사용하십시오.
  6. 임계 값을 적용하십시오.
  7. 임계 값 이미지의 백분율을 측정합니다.
  8. 각 표본의 여러 영역에 대한 평균 영역 범위입니다.

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Representative Results

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이 분석을 위해 우리의 종양 절제술 (주로 종양 벌크와 인접한 부위, 주로 확산 성 침윤 암세포가있는 건강한 조직으로 구성된 두 영역)의 두 관심 영역이 헤 마톡 실린과 에오신 염색 환자에서 신경 병리학자를 협동하여 확인되었습니다 ( 그림 1A , 1B ) 견본. 각 환자 표본 내에서 색소 성 면역 조직 화학을 통해 성상 교세포 ( 그림 1C ), 미 글로리아 ( 그림 1D ) 및 희소 돌기 아교 세포 ( 그림 1E )에 대한 양성 염색이 확인되었다. 이들 개체군은 일차 항체 ALDH1L1, Iba1 및 희소 돌기 아교 세포 특정 단백질 (OSP1)은 각각 11을 사용하여 확인 하였다. 항체 희석의 최적화뿐만 아니라 염색법이 정확하고 긍정적인지 확인하기위한 제조업체 프로토콜과의 상담이 권장됩니다 ( 그림 2 ). 예를 들어, 1 : 200 희석 ( 그림 2C )으로 정착하기 전에 음성 대조군 ( 그림 2A ), 제조업체 권장 ( 그림 2B ) 및 추가 희석액 ( 그림 2C , 2D )에 대한 1 차 항체가없는 염색을 수행했습니다 항 ALDH1L1 항체의 배경을 최소화하여 세포 몸과 과정의 최적의 양성 염색.

ImageJ를 사용하여 OSP1 + 희소 돌기 아교 염색의 백분율 범위를 정량화하여 결국 우리의 관심 영역의 차이점을 비교했습니다 ( 그림 3A ). 양성 DAB 염색을 평가하기 위해 Threshold Color 플러그인을 사용하여 이미지에서 대조 염색 된 핵을 제거했습니다 ( 그림 3B ). 이미지를 8 비트로 변환 한 후 (ss = "xfig"> 그림 3C), MaxEntropy 기본 임계 값을 나머지 양성 DAB 염색에 적용했습니다 ( 그림 3D ). 여기서 MaxEntropy 임계 값 기본값을 사용했는데이 기본 임계 값은 백그라운드를 최소화하면서 긍정적 인 얼룩을 가장 잘 잡았으므로 다른 임계 값을 사용하여 관심있는 인구의 분석을 보장 할 수 있습니다. 일단 적절한 임계 값이 이미지에 적용되면 ( 그림 3E ), 임계 값으로부터의 퍼센트 범위를 측정하고 ( 그림 3F ) 여러 환자에 대해 비교할 수 있습니다. 여기서는 관심 영역의 전체 면적에 따라 각 관심 영역 내의 3-5 개 영역을 계량화하고 GraphPad Prism 소프트웨어와 paired t-test를 사용하여 비교 한 그룹을 비교했습니다. 우리는 또한 GBM 분석을 Protein Atlas 데이터베이스의 건강한 뇌 조직에서 발견되는 해당 염색과 비교했습니다 ( 그림 3F ). 우리의 이전 게시, 우리는 전체 환자의 생존율 (11)을 예측하는 비례 위험 모델을 개발하기 위해 여러 microenvrionmental 구성 요소 (성상 세포, 미세 아교 세포, 희소 돌기 아교 세포, 혈관) 33 명에서이 분석을 사용했다.

그림 1
그림 1 : 종양 벌크와 종양의 비교 Glial 세포에 대한 관심 영역.
A) hematoxylin과 eosin으로 염색 된 환자 63의 전체 종양 샘플은 벌크 및 인접 영역이 표시되어 있습니다. B) 헤 마톡 실린과 에오신 염색, C) ALDH1L1 + 성상 교세포, D) Iba1 + microglia, E) 과립구 세포 특이 적 단백질 -1 (OSP1) + 희소 돌기 아교 세포. 스케일 바 = 100 μm. 25fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Anti-ALDH1L1 항체의 적정 예.
A) 음성 대조군, B) 1:70 제조자 권고 희석액, C) 1 : 200 희석액 및 D) 1 : 400 희석액. 1 : 200 희석은 배경을 최소화하면서 세포체 및 공정의 최적 양성 염색으로 인해 염색 및 분석에 사용되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 : 과립구 세포의 영역 범위에 대한 ImageJ 분석 및 정량화.
A) 환자 52의 오리지널 OSP1 + 염색. B) Threshold_Colour 플러그인을 사용하여 자주색 핵을 제거. C) 8 비트로 변환. D) MaxEntropy threshold capture 및 E) 배경 염색을 최소화하기 위해 적용. F) 단백질 아틀라스를 통해 건강한 뇌 조직뿐만 아니라 5 명의 환자 샘플에서 인접 영역과 벌크 영역을 비교하여 OSP1 + 퍼센트 적용 범위. *** p <0.001, **** p <0.0001 paired t-test를 통해. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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우리의 방법은 전통적인 chromogenic immunohistochemistry를 사용하여 염색 된 조직 학적 샘플을 분석하는 정량적 접근법입니다. 이 유형의 분석을위한 현재의 방법론은 유사한 염색 프로토콜과 독립적 인 병리학 자의 채점을 포함합니다. 이 방법은 신뢰할 만하다. 그러나 많은 응용에서 종양과 관련된 이질성에 대한 더 나은 이해와 생체 외 연구를위한 종양의 정확한 재현과 같은 세포 구성에 대한보다 정확한 이해가 필요하다.

이 프로토콜은 뇌종양 microenvironment 내 glial 세포의 인구를 정량 분석을위한 간단한 기술을 보여줍니다. 이 기술은 광범위하게 적용 가능하며 유방이나 췌장과 같은 다른 암뿐만 아니라 혈관, 케모카인 등 미세 환경의 많은 다른 구성 요소를 식별하기 위해 확장 될 수 있습니다.더 큰 parenchymal 지역. 또한이 기법을 사용하면 등방성, 클러스터링, 방향 등 복잡한 형태 결과를 셀 크기, 세포 둘레를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 이러한 염색 및 정량화 방법은 어떤 뇌 분석을위한 건강한 조직의 우리의 대표 단백질 아틀라스 정량화에서 입증 된 바와 같이, 사용 및 간질 뇌 조직 (11)과의 이전에 게시 된 비교 될 수 있다는 점에서 암에 한정되는 것은 아니다.

이 프로토콜 내 중요한 단계는 적절한 부화 및 발색 제 2의 개발을 포함합니다. 발색 염료가 과도하게 발달하지 않도록주의해야합니다. 이렇게하면 양성 염색과 배경을 구별하기가 어려워집니다. 개발 시간은 사용 된 기질 시약 및 1 차 항체의 친 화성에 따라 다릅니다. 우리는 밝은 분야를 사용합니다.현미경으로 발색을 모니터하여 최적의 염색을 보장하면서 배경 염색을 최소화합니다. 염색 후 분석 중 적절한 thresholding은 백그라운드를 양성 염색과 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 한계는 발색 발색 발현의 사용으로 인해 동일한 조직 샘플 내에서 여러 구성 요소를 염색 할 수 없다는 것입니다. Immunofluorescence 분석은 유사한 방법으로 수행 될 수 있지만이 방법에서 논의 된 도구의 수정이 필요합니다.

아교 모세포종에 특이 적으로, 환자 표본을 분석하는 데 사용 된 마커와 세포 얼룩이 많이 있습니다. 여기에는 예후 인자로서 IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 뿐만 아니라 소아암 및 대 식세포 18 , 19에 대한 CD11b와 CD45가 포함됩니다. 우리의 방법은 이러한 유형의 분석을 확장합니다.(glioblastoma)의 종양 미세 환경의 간과 된 구성 요소 인 세포의 미세 환경 (microenvironment)에 영향을 미친다. 연구에 따르면 종양 20 , 21 , 22 및 성상 교세포 9 , 23 , 24의 미량 세포 존재와 밀도가 관찰되었습니다. 여기에 우리는 뇌종양 미세 환경에서 모든 glia - astrocytes, microglia 및 oligodendrocytes를 검사하고이 종양에서 마커가 일반적으로 확인되는 종양 벌크에서 종양의 인접하거나 침습성 영역을 구별하는 프로토콜을 개발했습니다. 이렇게함으로써 우리는 환자 내 이질성을 결정했기 때문에 환자 상황을보다 정확하게 평가할 수 있다고 믿고 있으며 우리의 이전 발표에 따르면이 위치의 분석과 통계 모델에의 포함은 어느 위치에서든지 결과를 예측할 때 더 강력합니다전체 또는 전체 샘플 11 . 아교 모세포종 침공이 어려운 절제 할 수있게, 그래서 확산 때문에 또한, 완전히 1, 2, 우리는 인접 지역의 조직이 불가피 재발에 기여 절제술 후 남아 침입 조직,보다 잘 나타내는 생각합니다. 그러므로 인접 지역에 대한 더 나은 이해는 glioblastoma 환자에서 치료하기 전에 절제되는 전통적으로 연구 된 벌크 조직과는 달리 질병 재발 및 환자 치료 계획에 대한 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

저자는 Drs. Fahad Bafakih와 Jim Mandell, 면역 조직 화학에 도움을 준 Garrett F. Beeghly, 심장 혈관 연구 센터 Histology Core 및 Biorepository and Tissue Research Facility, University of Virginia의 Biomolecular Analysis Facility에 대한 지원 샘플 수집, 면역 조직 화학 및 영상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution Vector Labs H-3301
TBS
Triton-X Amresco 9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1  abcam  ab56777
Anti-Iba1  abcam  ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1  abcam  ab53041
ImmPRESS anti-goat Vector Labs MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) Vector Labs MP-7500
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich 216763
ImmPACT DAB substrate Vector Labs SK-4105
Hematoxylin counterstain ThermoScientific 72404
Histochoice Mounting Media Amresco H157-475
Aperio Scanscope Leica Biosystems
Image Scanscope Leica Biosystems
Super HT PAP Pen Research Products International 195506

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References

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Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).More

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).

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