Detta protokoll utvecklades för att kvantitativt identifiera tumörmikromiljökomponenter i glioblastom-patientresektioner med användning av kromogen immunhistokemi och ImageJ.
Med det växande intresset för tumörmiljömiljö, satte vi fram för att utveckla en metod för att specifikt bestämma mikromiljökomponenterna inom patientprover av glioblastom, den dödligaste och mest invasiva hjärncancer. Inte bara är kvantitativa metoder som är fördelaktiga för att noggrant beskriva sjuka vävnader, de kan också potentiellt bidra till mer noggrann prognos, diagnos och utveckling av vävnadstekniska system och ersättningar. I glioblastom har glialceller, såsom mikroglia och astrocyter, oberoende korrelerats med dålig prognos baserad på patologens klassificering. Dock har tillståndet för dessa celler och andra glialcellskomponenter inte beskrivits väl kvantitativt. Detta kan vara svårt på grund av de stora processerna som markerar dessa glialceller. Vidare fokuserar de flesta histologiska analyserna på det totala vävnadsprovet eller endast inom huvuddelen av tumören, i motsats till att avgränsa kvantifieringar baserade på regioner vitHin den mycket heterogena vävnaden. Här beskriver vi en metod för att identifiera och kvantitativt analysera populationerna av glialceller inom tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatienter. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna i patienttumörresektioner och ImageJ för att analysera procenttäckning av färgning för varje glialpopulation. Med dessa tekniker kan vi bättre beskriva glialcellerna i regionerna av gliomörkermikro-miljön.
Glioblastom (GBM), den vanligaste och maligna hjärncancer, präglas av mycket diffus invasion från den primära tumörmassan i den omgivande friska hjärnparenchynen 1 , 2 . Denna diffusa invasion gör tumören speciellt svår att resekta fullständigt, och de invaderande cancercellerna som förblir postterapi är den vanligaste orsaken till oundviklig återkommande 2 , 3 , 4 . Tidigare fann vi att den diffusa gliomcellinvasionen hämmades för att vara terapeutiskt fördelaktig 5 , men lite är känt om de komplexa mekanismerna som bidrar till GBM-invasionen. Tumörmiljömiljön, eller vävnaden som omger cancer, har blivit involverad i progressionen av tumörer i flera cancerformer 6 , 7 . Glioblastom-tumörmiljömiljön, på sidArtikulär, är relativt underkännetecknad och är unikt komplex, komposition av flera glialceller, såsom astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter, såväl som extracellulär matris, lösliga faktorer och biofysiska faktorer. Experimentellt har astrocyter och microglia visat sig öka gliomprogressionen och invasionen 8 , 9 , 10 , men sammansättningen av alla glialceller i den ursprungliga mänskliga hjärnmikro-miljön är okänd.
Vi visade tidigare mikromiljökomponenter kan förutsäga patientöverlevnad genom att kvantitativt analysera cellkomponenter i glioblastommikro-miljön och införliva våra analyser i en proportionell riskmodell 11 . Här beskriver vi den kvantitativa analysmetoden för att identifiera populationerna av glialceller i tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatientens. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna och ImageJ för att analysera procent täckningsfärg för varje glialpopulation. Att bedöma procent täckning skapar en enkel mätning för att bestämma de morfologiska skillnaderna i celler, särskilt de som påverkas av interaktioner med cancerceller. Tidigare studier för kvantifiering av histopatologisk färgning använder standardfärgning, såsom hematoxylin och eosin 12 eller Massons trichrom 13 , vilka inte utnyttjar specificiteten av antikroppsbaserad immunohistokemisk färgning. Vår metod har utvecklats för direkt kvantifiering av glialpopulationerna inom glioblastom-patienttumörresektioner, som vi syftar till att använda för att belysa den komplexa glioblastommikro-miljön.
Vår metod som föreslås här är ett kvantitativt tillvägagångssätt för att analysera histologiska prover färgade med traditionell kromogen immunhistokemi. Nuvarande metodik för denna typ av analys innefattar liknande färgningsprotokoll följt av gradering av oberoende patologer. Denna metod har varit pålitlig, men för ett antal tillämpningar krävs en mer exakt förståelse av cellulär smink, såsom bättre förståelse för heterogeniteten i samband med tumörer och exakt rekapitulation av tumörer för i…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Drs. Fahad Bafakih och Jim Mandell för förvärv och identifiering av patientprover, Garrett F. Beeghly för hjälp med immunhistokemi och Biorepository and Tissue Research Facility, Histology Core Cardiovascular Research Center och Biomolecular Analysis Facility vid University of Virginia för hjälp med Provförvärv, immunhistokemi och bildbehandling.
Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
Ethanol | |||
High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
TBS | |||
Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
Horse serum | |||
Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |