Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Kvantitativ immunohistokemi hos den cellulära mikromiljön vid patientglioblastomresektioner

doi: 10.3791/56025 Published: July 31, 2017

Summary

Detta protokoll utvecklades för att kvantitativt identifiera tumörmikromiljökomponenter i glioblastom-patientresektioner med användning av kromogen immunhistokemi och ImageJ.

Abstract

Med det växande intresset för tumörmiljömiljö, satte vi fram för att utveckla en metod för att specifikt bestämma mikromiljökomponenterna inom patientprover av glioblastom, den dödligaste och mest invasiva hjärncancer. Inte bara är kvantitativa metoder som är fördelaktiga för att noggrant beskriva sjuka vävnader, de kan också potentiellt bidra till mer noggrann prognos, diagnos och utveckling av vävnadstekniska system och ersättningar. I glioblastom har glialceller, såsom mikroglia och astrocyter, oberoende korrelerats med dålig prognos baserad på patologens klassificering. Dock har tillståndet för dessa celler och andra glialcellskomponenter inte beskrivits väl kvantitativt. Detta kan vara svårt på grund av de stora processerna som markerar dessa glialceller. Vidare fokuserar de flesta histologiska analyserna på det totala vävnadsprovet eller endast inom huvuddelen av tumören, i motsats till att avgränsa kvantifieringar baserade på regioner vitHin den mycket heterogena vävnaden. Här beskriver vi en metod för att identifiera och kvantitativt analysera populationerna av glialceller inom tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatienter. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna i patienttumörresektioner och ImageJ för att analysera procenttäckning av färgning för varje glialpopulation. Med dessa tekniker kan vi bättre beskriva glialcellerna i regionerna av gliomörkermikro-miljön.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastom (GBM), den vanligaste och maligna hjärncancer, präglas av mycket diffus invasion från den primära tumörmassan i den omgivande friska hjärnparenchynen 1 , 2 . Denna diffusa invasion gör tumören speciellt svår att resekta fullständigt, och de invaderande cancercellerna som förblir postterapi är den vanligaste orsaken till oundviklig återkommande 2 , 3 , 4 . Tidigare fann vi att den diffusa gliomcellinvasionen hämmades för att vara terapeutiskt fördelaktig 5 , men lite är känt om de komplexa mekanismerna som bidrar till GBM-invasionen. Tumörmiljömiljön, eller vävnaden som omger cancer, har blivit involverad i progressionen av tumörer i flera cancerformer 6 , 7 . Glioblastom-tumörmiljömiljön, på sidArtikulär, är relativt underkännetecknad och är unikt komplex, komposition av flera glialceller, såsom astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter, såväl som extracellulär matris, lösliga faktorer och biofysiska faktorer. Experimentellt har astrocyter och microglia visat sig öka gliomprogressionen och invasionen 8 , 9 , 10 , men sammansättningen av alla glialceller i den ursprungliga mänskliga hjärnmikro-miljön är okänd.

Vi visade tidigare mikromiljökomponenter kan förutsäga patientöverlevnad genom att kvantitativt analysera cellkomponenter i glioblastommikro-miljön och införliva våra analyser i en proportionell riskmodell 11 . Här beskriver vi den kvantitativa analysmetoden för att identifiera populationerna av glialceller i tumörmassan och intilliggande regioner av tumörresektioner från glioblastompatientens. Vi använde kromogen immunhistokemi för att identifiera glialcellspopulationerna och ImageJ för att analysera procent täckningsfärg för varje glialpopulation. Att bedöma procent täckning skapar en enkel mätning för att bestämma de morfologiska skillnaderna i celler, särskilt de som påverkas av interaktioner med cancerceller. Tidigare studier för kvantifiering av histopatologisk färgning använder standardfärgning, såsom hematoxylin och eosin 12 eller Massons trichrom 13 , vilka inte utnyttjar specificiteten av antikroppsbaserad immunohistokemisk färgning. Vår metod har utvecklats för direkt kvantifiering av glialpopulationerna inom glioblastom-patienttumörresektioner, som vi syftar till att använda för att belysa den komplexa glioblastommikro-miljön.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll identifierar cellulära komponenter i formalin-fixerade paraffininkopplade (FFPE) prover, vilket är typiskt för kliniska patientprover i banker. Paraffininkapsling möjliggör det bästa underhållet av cell- och vävnadsmorfologi samt har bättre livslängden av sektioner. Proverna som användes för denna analys användes genom University of Virginia Biorepository och Tissue Research Facility. Patientprover valdes av en neuropatolog baserat på en slutgiltig diagnos av glioblastom (astrocytom, WHO-klass IV) som hade avslutat tumörresektioner vid University of Virginia mellan 2010 och 2013 och de-identifierades före denna analys 11 .

1. FFPE-prov-deparaffinisering och rehydratisering

OBS: Denna del av protokollet är specifik för FFPE-prover. Medan paraffin-inbäddade prover kan vara mer användbara för denna analys på grund av bevarande av cellulär och tUtfärda morfologi, kan denna analys också göras med frusna avsnitt. Om man använder frysta sektioner kan denna del utelämnas och fortsätt direkt till kromogen immunhistokemi.

  1. Utför följande tvättar i 5 minuter vardera: Xylen, Xylen, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 95% etanol, 70% etanol, avjoniserat vatten, avjoniserat vatten

2. Antigenhämtning

OBS: Denna del av protokollet är nödvändigt för att bryta metylenbroar bildade under formalinfixering av FFPE-prover och exponera antigenställen för antikroppar att binda.

  1. Späd Tris-baserad lösning med hög pH-antigen avmaskning vid tillverkarens rekommendation i destillerat vatten.
  2. Utför värmemedierad antigenhämtning med hjälp av en mikrovågsugn. Andra former av värmemedierad hämtning (såsom tryckkokare, vegetabilisk ångare eller kokande vatten) skulle också vara tillräckliga.
    1. Tillsätt den utspädda uppmaskningslösningen i en otätbar mikrovågsugnfartyg. Placera glidbanorna i kärlet. Placera diabilder i mikrovågsugn.
    2. Koka i 20 minuter vid hög effekt. Övervaka vätskenivåerna för avdunstning och fyll i med destillerat vatten efter behov.
  3. Låt proven svalna i lösning i 1 h vid rumstemperatur.

3. Kromogen immunhistokemi

  1. Skissera vävnadsprov med en hydrofob penna för att minimera volymen av reagenser som är nödvändiga för att täcka provet.
    OBS! Var noga med att hålla vävnadsproverna hydrerade och låt dem inte torka ut eftersom detta kommer att påverka färgningseffekten.
  2. Pipett tillräckligt permeabiliseringslösning (Tris-buffrad saltlösning (TBS) + 0,01% Triton-X) för att täcka vävnadsprovet (vanligen ca 100-200 μl).
  3. Ta bort och kassera lösningen och upprepa steg 3.2.
  4. Inkubera prov vid rumstemperatur med blockeringslösning (2,5% hästserum + permeabiliseringslösning).
  5. Inkubera prov över natten i 4 ºC med primära antikroppar utspäddaI blockerande lösning.
    OBS! Alla primära antikroppar som används här späds ut vid 1: 200, men optimala utspädningar kan bestämmas med användning av seriella utspädningar som börjar med tillverkarens rekommendation. Detaljerad information om antikroppar som används i detta protokoll har tidigare publicerats 11 .
  6. Detektera primära antikroppar med användning av ett pepparrotperoxidaspolymerreagens motsvarande det primära antikropps värddjuret, enligt tillverkarens protokoll.
  7. Pipett tillräckligt permeabiliseringslösning för att täcka vävnadsprovet och inkubera i 5 min.
  8. Ta bort och kassera lösningen och upprepa steg 3.7.
  9. Inkubera objektglasen i 0,3% H 2 O 2 i 1x TBS under 15 min.
  10. Utveckla prover med ett substrat av peroxidas diaminobenzidin (DAB) i 2 - 10 min tills önskad fläckintensitet uppnås.
  11. Motverka prover för att identifiera cellkärnor, såsom med hematoxylin, enligt tillverkarens protokoll.
  12. Dehydratprover med 100%Etanol och xylen.
  13. Montera prov permanent med monteringsmedia.

4. Identifieringsregioner

  1. Bildskärmar under ljusfältmikroskopi som kan ge högupplösta bilder.
    OBS! Använd bildkamera-komponenter med minst 20x upplösning.
  2. Flytta kameran till specifika regioner av intresse genom vävnadsprover.
  3. Spara bilder som TIFF-filer för kvantifiering.

5. Bildanalys

  1. Öppna bilder i ImageJ för kvantifiering av procent täckning.
  2. Använd tröskelfärg-plugin för att ta bort lila färg från hematoxylinfärgade kärnor.
  3. Konvertera bild till 8-bitars.
  4. Lägg till tröskelvärde utan mörk bakgrund.
  5. Processbild med ett av de 17 förinstallerade ImageJ-tröskelfilterna ( dvs. MaxEntropy) så att endast DAB-färgade delar ingår i tröskeln.
    OBS! Välj det optimala förbelastade tröskelfiltret som minimerarS inkludering av bakgrundsfärgning. Detta kan bero på kvaliteten på färgning och specificitet av antikropp. Använd samma tröskel för alla tekniska replikat inom varje patientprov.
  6. Applicera tröskelvärdet.
  7. Mät procentenhet av den trösklade bilden.
  8. Genomsnittlig procent täcknings täckning för flera regioner inom varje prov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För denna analys identifierades två intressegrupper inom våra tumörresektioner - den primära tumörmassan och de intilliggande regionerna, huvudsakligen sammansatta av hälsosam vävnad med diffusa invaderande cancerceller ( Figur 1A , 1B ) - samordnade neuropatologer på hematoxylin och eosinfärgad patient prover. Inom varje patientprov identifierades positiv färgning för astrocyter ( Figur 1C ), microglia ( Figur 1D ) och oligodendrocyter ( Figur 1E ) via kromogen immunhistokemi. Dessa populationer identifierades med användning av primära antikroppar ALDH1L1, Ibba och Oligodendrocytspecifikt Protein (OSP1) 11 respektive. Optimering av antikroppspädningar rekommenderas samt samråd med tillverkarens protokoll för att bekräfta om färgning är korrekt och positiv ( Figur 2 ). Exempelvis utförde vi färgning utan primär antikropp för negativ kontroll ( Figur 2A ), tillverkarens rekommenderade ( Figur 2B ) och ytterligare utspädningar ( Figur 2C , 2D ) före avfettning på 1: 200-spädningen ( Figur 2C ) på grund av Optimal positiv färgning av cellkroppen och processer med minimering av bakgrunden för anti-ALDH1L1-antikroppen.

Med hjälp av ImageJ kvantifierades procentdelen av OSP1 + oligodendrocytfärgning för att slutligen jämföra skillnader i våra intressanta regioner ( Figur 3A ). Vi avlägsnade de motsträckta kärnorna från bilden med hjälp av tröskelfärg-plugin för att enbart bedöma den positiva DAB-färgningen ( Figur 3B ). Efter att konvertera bilden till 8bit (Ss = "xfig"> Figur 3C), tillämpade vi sedan MaxEntropy standard tröskeln till den återstående positiva DAB-färgningen ( Figur 3D ). Här använde vi MaxEntropy-tröskelvärdet eftersom detta speciella standardgränsvärde bäst fångade vår positiva fläck samtidigt som bakgrund minimeras, men olika tröskelvärden kan användas för att säkerställa analys av befolkningen av intresse. När lämpligt tröskelvärde har applicerats på bilden ( Figur 3E ), kan den procentuella täckningen från tröskeln mätas ( Figur 3F ) och jämförs för flera patienter. Här kvantifierade vi 3 - 5 områden inom varje region av intresse, beroende på det totala området av intresseområdet, och jämförde grupper med parade t-tester med GraphPad Prism-programvara. Vi jämförde också våra GBM-analyser med motsvarande färgning som finns i frisk hjärnvävnad i Protein Atlas-databasen ( Figur 3F ). I vår Tidigare publicering använde vi denna analys för flera mikroenvolutionella komponenter (astrocyter, microglia, oligodendrocyter och blodkärl) över 33 patienter för att utveckla en proportionell riskmodell för att förutsäga övergripande patientöverlevnad 11 .

Figur 1
Figur 1 : Jämförelse av tumörbulk och tumör närliggande intressegrupper för glialceller.
A) Hela tumörprovet från patient 63 färgat med hematoxylin och eosin med bulk och intilliggande regioner indikerade. B) hematoxylin och eosinfärgning, C) ALDH1L1 + astrocyter, D) Iba1 + mikroglia och E) Oligodendrocyt-specifikt Protein-1 (OSP1) + oligodendrocyter. Skalstång = 100 μm. 25fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2
Figur 2 : Exempel Titrering av Anti-ALDH1L1 Antikropp.
A) Negativ kontroll, B) 1:70 Tillverkarens rekommendation utspädning från lager, C) 1: 200 utspädning från lager, och D) 1: 400 utspädning från lager. 1: 200 utspädning användes för färgning och analys på grund av optimal positiv färgning av cellkropp och processer med minimering av bakgrund. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Jpg "/>
Figur 3 : ImageJ-analys och kvantifiering av områdets täckning för oligodendrocyter.
A) Original OSP1 + färgning av patient 52. B) Avlägsnande av lila kärnor med hjälp av Threshold_Colour-plugin. C) Omvandling till 8bit. D) MaxEntropy-tröskeln fångad och E) applicerad för att minimera bakgrundsfärgning. F) Jämförelse av intilliggande och bulkregioner i fem patientprover, såväl som hälsosam hjärnvävnad genom Protein Atlas, för OSP1 + procent täckning. *** p <0,001, **** p <0,0001 via parade t-tester. Skalstång = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vår metod som föreslås här är ett kvantitativt tillvägagångssätt för att analysera histologiska prover färgade med traditionell kromogen immunhistokemi. Nuvarande metodik för denna typ av analys innefattar liknande färgningsprotokoll följt av gradering av oberoende patologer. Denna metod har varit pålitlig, men för ett antal tillämpningar krävs en mer exakt förståelse av cellulär smink, såsom bättre förståelse för heterogeniteten i samband med tumörer och exakt rekapitulation av tumörer för in vitro-studier.

Detta protokoll demonstrerar en enkel teknik för att kvantitativt analysera populationerna av glialceller inom hjärntumörmikro-miljön. Denna teknik är allmänt anpassningsbar och kan utökas för att identifiera många andra komponenter i mikromiljön, såsom blodkärl, kemokiner och mer, liksom andra cancerformer, såsom bröst- eller bukspottskörtel, där tumörresektionerna kan haStörre parenkymregioner. Vidare kan denna teknik anpassas för att förvärva andra mätningar, såsom räkningar och perimeter av celler för att bedöma cellformen, liksom mer komplexa morfologiska resultat isotropi, kluster, orientering och mer. Dessa tekniker är inte heller begränsade till cancer, eftersom dessa färgnings- och kvantifieringsmetoder kan användas för alla hjärnanalyser, vilket visas i vår representativa Protein Atlas-kvantifiering av frisk vävnad och vår tidigare publicerade jämförelse med epileptisk hjärnvävnad 11 .

Kritiska steg inom detta protokoll innefattar korrekt inkubation och utveckling av det kromogena sekundära. Försiktighet bör vidtas så att det kromogena färgämnet inte överutvecklas. Detta gör det svårt att skilja mellan positiv färgning och bakgrund. Utvecklingstiden varierar beroende på det använda substratreagenset och affiniteten hos den primära antikroppen. Vi använder ljusfältMikroskopi för att övervaka utvecklingen för att säkerställa optimal färgning under minimering av bakgrundsfärgning. Efter färgning kan korrekt tröskel under analysen bidra till att skilja bakgrunden från positiv färgning. En huvudbegränsning för denna metod är oförmågan att fläcka flera komponenter inom samma vävnadsprov på grund av användningen av kromogen färgningsutveckling. Immunofluorescensanalys kan utföras på ett liknande sätt, men kräver modifiering av de verktyg som diskuteras i denna metod.

Specifikt för glioblastom finns ett antal markörer och cellulära fläckar som har använts för att analysera patientprover. Dessa innefattar IDH1 14 , 15 , EGFRvIII 16 , 17 som prognostiska markörer, såväl som CDllb och CD45 för mikroglia och makrofager 18 , 19 . Vår metod utökar denna typ av analysTill den cellulära mikromiljön, en ofta förbisedd komponent i tumörmikromiljön i glioblastom. Studier har tittat på microglia närvaro och densitet i tumörer 20 , 21 , 22 samt bidrag från astrocyter 9 , 23 , 24 . Här utvecklade vi ett protokoll som undersökte alla glia-astrocyterna, microglia och oligodendrocyter - i hjärntumörmikromiljön och att skilja de intilliggande eller invasiva regionerna i tumören från tumörbulken, vilket är där markörer brukar identifieras i dessa tumörer. Genom att göra detta tror vi att vi bättre kan bedöma patientsituationen eftersom vi bestämde intra-patient heterogenitet och vår tidigare publikation visade att analys av dessa platser och inkludering i statistiska modeller är starkare för att förutsäga resultat än vardera platsen aloNe eller övergripande prover 11 . Eftersom glioblastominvasionen är så diffus, vilket gör det svårt att återskapa fullständigt 1 , 2 tror vi att vävnaden i de intilliggande regionerna är mer representativ för den invasiva vävnaden kvar efter resektion, vilket bidrar till oundviklig återkommande. Därför kan bättre förståelse för de intilliggande regionerna ge mer information om sjukdomsåterfall och planering av patientbehandlingen, i motsats till den traditionellt studerade bulkvävnaden som resekteras före behandling hos patienter med glioblastom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Författarna tackar Drs. Fahad Bafakih och Jim Mandell för förvärv och identifiering av patientprover, Garrett F. Beeghly för hjälp med immunhistokemi och Biorepository and Tissue Research Facility, Histology Core Cardiovascular Research Center och Biomolecular Analysis Facility vid University of Virginia för hjälp med Provförvärv, immunhistokemi och bildbehandling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Xylene Fisher Chemical X3P
Ethanol
High pH antigen unmasking solution Vector Labs H-3301
TBS
Triton-X Amresco 9002-93-1
Horse serum
Anti-ALDH1L1  abcam  ab56777
Anti-Iba1  abcam  ab5076
Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1  abcam  ab53041
ImmPRESS anti-goat Vector Labs MP-7405
ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) Vector Labs MP-7500
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich 216763
ImmPACT DAB substrate Vector Labs SK-4105
Hematoxylin counterstain ThermoScientific 72404
Histochoice Mounting Media Amresco H157-475
Aperio Scanscope Leica Biosystems
Image Scanscope Leica Biosystems
Super HT PAP Pen Research Products International 195506

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114, (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61, (6), (2001).
  4. Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135, (9), 1239-1244 (2009).
  5. Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4, (127), 127ra36 (2012).
  6. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15, (1-2), 39-49 (2012).
  7. Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19, (1), 144-149 (2009).
  8. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103, (4), 351-355 (2002).
  9. Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23, (10), 4034-4043 (2003).
  10. Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
  11. Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. (2016).
  12. Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4, (157), (2012).
  13. Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162, (4), 1577-1586 (2000).
  14. Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483, (7390), 479-483 (2012).
  15. Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103, (2), 269-273 (2012).
  16. Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
  17. Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand? Mol. Cancer Res. 7, (7), 1000-1012 (2009).
  18. Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54, (2), 106-113 (2001).
  19. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81, (3), 447-455 (2005).
  20. Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89, (15), 532-539 (2011).
  21. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19, (1), 20-27 (2015).
  22. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, (3), 472-485 (2011).
  23. Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37, (1), 61-69 (2016).
  24. Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8, (1), e54752 (2013).
Kvantitativ immunohistokemi hos den cellulära mikromiljön vid patientglioblastomresektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).More

Yuan, J. X., Munson, J. M. Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections. J. Vis. Exp. (125), e56025, doi:10.3791/56025 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter