Hasta Glioblastoma Rezeksiyonlarında Hücresel Mikro Çevrenin Kantitatif İmmünohistokimyası
Summary
Bu protokol, kromojenik immünhistokimya ve ImageJ kullanılarak glioblastoma hasta rezeksiyonlarında tümör mikro çevre bileşenlerini nicel olarak tanımlamak için geliştirildi.
Abstract
Tümör mikro ortamındaki artan ilgiyle, ölümcül ve en invaziv beyin kanseri olan glioblastomun hasta örnekleri içindeki mikro çevre bileşenlerini spesifik olarak belirlemek için bir yöntem geliştirdik. Kantitatif yöntemler hastalıklı dokuları doğru bir biçimde tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda potansiyel olarak daha doğru prognoz, teşhis ve doku mühendisliğindeki sistemlerin ve replasmanların geliştirilmesine katkıda bulunabilirler. Glioblastomada, mikroglia ve astrositler gibi glial hücreler, patoloğun derecelendirmesine dayalı zayıf prognoz ile bağımsız olarak ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin ve diğer glial hücre bileşenlerinin durumu nicel olarak iyi tanımlanmamıştır. Bu, bu glial hücreleri işaretleyen büyük süreçler nedeniyle zor olabilir. Dahası, histolojik analizlerin çoğu, genel doku örneğine veya yalnızca tümör hacmine odaklanır; zira bölgeleri esas alan kantifikasyonları tasvir ederÇok heterojen dokuda. Burada, glioblastoma hastalarından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması ve nicel olarak analiz edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Hastanın tümör rezeksiyonlarında glial hücre popülasyonlarını ve ImageJ'de kromojenik immünohistokimya kullandık ve her glial popülasyon için boyama yüzdesini analiz ettik. Bu tekniklerle, glioma tümör mikro ortamının bölgeleri boyunca glial hücreleri daha iyi tarif edebiliyoruz.
Introduction
En yaygın ve malign beyin kanseri olan Glioblastoma (GBM), birincil tümör hacminden çevreleyen sağlıklı beyin parankimine 1 , 2 oranlarında dağılmış istila ile karakterizedir. Bu dağınık istila, tümörün tamamen kesilmesini zorlaştırır ve tedaviden sonra kalan istilacı kanser hücreleri, kaçınılmaz nüksetmenin en yaygın nedenidir 2 , 3 , 4 . Daha önce, diffüz glioma hücre invazyonunu inhibe ederek terapötik açıdan faydalı 5 bulduk, ancak GBM istilasına katkıda bulunan kompleks mekanizmalar hakkında çok az şey biliniyordu. Tümör mikro ortamı veya kanseri çevreleyen doku, çoklu kanserlerde tümörlerin ilerlemesinde rol oynadı 6 , 7 . Glioblastoma tümör mikro ortamı, pEkstraselüler matriks, çözünür faktörler ve biyofiziksel faktörlerin yanı sıra, astrositler, mikroglia ve oligodendrositler gibi çok sayıda glial hücrenin oluşturduğu benzersiz bir şekilde karmaşıktır. Deneysel olarak, astrositler ve mikrogliaların glioma progresyonunu ve istilasını 8 , 9 , 10 arttırdığı gösterilmiştir, ancak doğal insan beyninin mikro ortamındaki tüm glial hücrelerin kompozisyonu bilinmemektedir.
Daha önce, mikro çevre bileşenleri, glioblastoma mikro ortamının hücresel bileşenlerini nicel olarak analiz ederek ve analizlerimizi orantısal bir tehlike modeli 11 içine dahil ederek, hastanın hayatta kalmasını öngörebildiğini gösterdi. Burada, glioblastoma hastasından tümör rezeksiyonlarının tümör hacmi ve komşu bölgelerindeki glial hücrelerin popülasyonlarının tanımlanması için nicel analiz metodunu açıklıyoruzs. Glial hücre popülasyonlarını tanımlamak için kromojenik immünohistokimya ve her glial popülasyon için boyamanın yüzde kapsama oranını analiz etmek için ImageJ kullanılmıştır. Kapsam yüzdesinin değerlendirilmesi, özellikle kanser hücreleriyle etkileşimlerden etkilenen hücrelerin morfolojik farklılıklarını belirlemek için basit bir ölçüm oluşturur. Histopatolojik boyamanın nicelleştirilmesi için yapılan önceki çalışmalar, hematoksilin ve eozin 12 veya Masson's trikrom 13 gibi standart boyayı antikor esaslı immünhistokimyasal boyanmanın özgüllüğünden yararlanmayan boyayı kullanır. Metodumuz, kompleks glioblastoma mikro ortamını aydınlatmak için kullanmayı düşündüğümüz, glioblastoma hasta tümör rezeksiyonlarında glial popülasyonları doğrudan ölçmek için geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada önerilen yöntemimiz, geleneksel kromojenik immünhistokimyayla boyanan histolojik örneklerin analizinde niceliksel bir yaklaşımdır. Bu tür analizler için güncel metodoloji, bağımsız patologlar tarafından derecelendirilen benzer boyama protokollerini içerir. Bu yöntem güvenilir olmuştur, ancak birçok uygulama için, tümör ile ilişkili heterojenliği daha iyi anlamak ve in vitro çalışmalar için tümörlerin doğru yeniden özetlenmesi gibi, hücresel makyajın daha kesin bir şekilde anlaş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Dr teşekkür ederim. Fahad Bafakih ve Jim Mandell, hasta numunelerinin edinilmesi ve tanımlanması için Garrett F. Beeghly, Biyorepository ve Doku Araştırma Tesisi, Kardiyovasküler Araştırma Merkezi Histoloji Çekirdeği ve Virginia Üniversitesindeki Biyomoleküler Analiz Merkezi ile yardımda bulunmak için yardım ettiler. Örnek alma, immünohistokimya ve görüntüleme.
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Ethanol | |||
| High pH antigen unmasking solution | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Horse serum | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Anti-Oligodendrocyte Specific Protein1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-goat | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrate | Vector Labs | SK-4105 | |
| Hematoxylin counterstain | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Mounting Media | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products International | 195506 |
References
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., Dichgans, J., Wick, W. Sublethal Irradiation Promotes Migration and Invasiveness of Glioma Cells. Cancer Res. 61 (6), (2001).
- Tuettenberg, J., et al. Recurrence pattern in glioblastoma multiforme patients treated with anti-angiogenic chemotherapy. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135 (9), 1239-1244 (2009).
- Munson, J. M., et al. Anti-invasive adjuvant therapy with imipramine blue enhances chemotherapeutic efficacy against glioma. Sci. Transl. Med. 4 (127), 127ra36 (2012).
- Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist. Updat. 15 (1-2), 39-49 (2012).
- Rubin, J. B. Only in congenial soil: the microenvironment in brain tumorigenesis. Brain Pathol. 19 (1), 144-149 (2009).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Le, D. M., et al. Exploitation of astrocytes by glioma cells to facilitate invasiveness: a mechanism involving matrix metalloproteinase-2 and the urokinase-type plasminogen activator-plasmin cascade. J. Neurosci. 23 (10), 4034-4043 (2003).
- Ye, X., et al. Tumor-associated microglia/macrophages enhance the invasion of glioma stem-like cells via TGF-β1 signaling pathway. J. Immunol. 189, 444-453 (2012).
- Yuan, J. X., Bafakih, F. F., Mandell, J. W., Horton, B. J., Munson, J. M. Quantitative Analysis of the Cellular Microenvironment of Glioblastoma to Develop Predictive Statistical Models of Overall Survival. J. Neuropathol. Exp. Neurol. , (2016).
- Yuan, Y., et al. Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling. Sci. Transl. Med. 4 (157), (2012).
- Yi, E. S., et al. Distribution of Obstructive Intimal Lesions and Their Cellular Phenotypes in Chronic Pulmonary Hypertension. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162 (4), 1577-1586 (2000).
- Turcan, S., et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature. 483 (7390), 479-483 (2012).
- Songtao, Q., et al. IDH mutations predict longer survival and response to temozolomide in secondary glioblastoma. Cancer Sci. 103 (2), 269-273 (2012).
- Shinojima, N., et al. Prognostic Value of Epidermal Growth Factor Receptor in Patients with Glioblastoma Multiforme. Cancer Res. 63, 6962-6970 (2003).
- Karpel-Massler, G., Schmidt, U., Unterberg, A., Halatsch, M. E. Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where do we stand?. Mol. Cancer Res. 7 (7), 1000-1012 (2009).
- Badie, B., Schartner, J. Role of microglia in glioma biology. Microsc. Res. Tech. 54 (2), 106-113 (2001).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Alves, T. R., et al. Glioblastoma cells: A heterogeneous and fatal tumor interacting with the parenchyma. Life Sci. 89 (15), 532-539 (2011).
- Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nat. Neurosci. 19 (1), 20-27 (2015).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Placone, A. L., Quiñones-Hinojosa, A., Searson, P. C. The role of astrocytes in the progression of brain cancer: complicating the picture of the tumor microenvironment. Tumor Biol. 37 (1), 61-69 (2016).
- Rath, B. H., et al. Astrocytes Enhance the Invasion Potential of Glioblastoma Stem-Like Cells. PLoS One. 8 (1), e54752 (2013).
