Summary
Bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion reglerar holme blod distribution och upprätthåller den fysiologiska funktionen av β cellöar. Det här protokollet beskriver använder en laser Doppler bildskärm att fastställa funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i vivo och bedöma bidragen från bukspottskörteln holme mikrocirkulation att bukspottskörteln-relaterade sjukdomar.
Abstract
Som funktionella status av mikrocirkulationen är mikrovaskulära vasomotion viktigt för leveransen av syre och näringsämnen och avlägsnande av koldioxid och avfallsprodukter. Nedskrivning av mikrovaskulära vasomotion kan vara ett avgörande steg i utvecklingen av mikrocirkulationen-relaterade sjukdomar. Högt vaskulariserad bukspottskörteln Holmen är dessutom anpassade för att stödja endokrina funktion. I detta avseende verkar det möjligt att dra slutsatsen att bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion funktionella status kan påverka bukspottskörteln holme funktion. Analysera de patologiska förändringarna av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion funktionella status kan vara en genomförbar strategi att bestämma bidrag att bukspottskörteln holme mikrocirkulation gör att relaterade sjukdomar, såsom diabetes mellitus, pankreatit, etc. Därför beskriver det här protokollet använder en laser Doppler blod flödesvakt att fastställa funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion, och att upprätta parametrar (inklusive genomsnittliga blodgenomströmning, amplitud, frekvens och relativ hastighet av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion) för utvärdering av blodcirkulationens funktionella status. I en streptozotocin-inducerad diabetes musmodell observerade vi ett nedsatt funktionell status på bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion. Sammanfattningsvis kan detta tillvägagångssätt för att bedöma bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i vivo visar på mekanismer som rör bukspottskörteln holme sjukdomar.
Introduction
Som en parameter för den funktionella statusen mikrocirkulationen, mikrovaskulära vasomotion tar ansvar för leverans och utbyte av syre, näringsämnen och hormoner och är avgörande för avlägsnande av metaboliska produkter, såsom koldioxid och cell avfall 1. mikrovaskulära vasomotion reglerar också blod flödesfördelning och vävnadsperfusion, vilket påverkar lokala blodcirkulationens blodtryck och Svaren till inflammation, som kan framkalla ödem i många sjukdomar. Mikrovaskulära vasomotion är därför mycket viktigt att bibehålla den fysiologiska funktionen av organ2,3,4, vävnader och komponent celler. Nedskrivning av mikrovaskulära vasomotion kan vara en av de viktigaste stegen i utvecklingen av mikrocirkulationen sjukdomar5.
Laser Doppler utvecklades ursprungligen för observation och kvantifiering i fältet av mikrocirkulationen forskning6. Denna teknik, tillsammans med andra tekniska metoder (t.ex. laser speckle7, transkutan syre, etc.), har betraktats som den gyllengula standarden för bedömning av blodflöde i mikrocirkulationen. Motiven att blod perfusionen av lokala mikrocirkulation (dvs, kapillärer, arterioler, venoler, etc.) kan bestämmas genom apparater utrustade med laser Doppler, bygger på principen Dopplereffekten. Den våglängd och frekvens av stimulerad emission ljus ändras när ljusa partiklar stöter rörliga blodkroppar i microvesselsna, de förblir oförändrade. Därför i mikrocirkulationen är numret och hastigheten av blodkroppar nyckelfaktorer avseende omfattning och frekvens distribution av Doppler-skiftat ljuset, medan riktningen av mikrovaskulära blodflödet är irrelevant. Med olika metoder, en mängd olika vävnader har använts för blodcirkulationens studier, inklusive mesenteries och dorsala skinfold avdelningar med möss, råttor, hamstrar, och även människor8. Men i det nuvarande protokollet, vi fokuserar på funktionell status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion, som utvärderas med hjälp av laser Doppler och en hemmagjord bedömningssystemet parameter.
Bukspottskörteln holme mikrocirkulationen huvudsakligen består av bukspottskörteln holme microvesselsna och uppvisar särdrag. Ett bukspottskörteln holme kapillära nätverk visar en fem-gånger-högre densitet än välutbyggt nät av dess exokrina motsvarighet9. Ger en kanal för leverans av ingående glukos och sprida insulin, leverera holme endotelceller syre till metaboliskt aktiva celler i islet β-celler. Dessutom visar nya bevis också att holme microvesselsna är inblandade inte bara reglera insulin genuttryck och β-cellen överlevnad, men också i att påverka β-cellernas funktion; att främja β-cell spridning; och producera ett antal vasoaktiva, angiogena ämnen och tillväxtfaktorer10. Därför i detta avseende som vi dra slutsatsen att bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion funktionella status kan påverka holme β-cellernas funktion och engagera sig i patogenesen av sjukdomar såsom akut/kronisk pankreatit, diabetes och andra bukspottkörteln-relaterade sjukdomar.
Analysera de patologiska förändringarna av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion funktionella status kan vara en genomförbar strategi att avgöra bidragen från bukspottskörteln holme mikrocirkulationen för de sjukdomar som nämns ovan. Detaljerade stegvisa anvisningar som beskriver metoden för att bestämma bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i vivo ger här. Typiska mätningar visas i Representativa resultat. Slutligen, fördelar och begränsningar av metoden är markerade i diskussion, tillsammans med ytterligare applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök avrättades i enlighet med alla relevanta riktlinjer, regler och tillsynsmyndigheter. Detta protokoll som demonstreras utfördes under vägledning och godkännande av de institutet av mikrocirkulationen djur etik kommittén (IMAEC) på den Peking Union Medical College (PUMC).
1. djur
- Innan start av försöket, hålla tre BALB/c-möss per bur, med kontrollerad temperatur (24 ± 1 ° C) och luftfuktighet (55 ± 5%), under en 12-h ljus-mörker cykel. Låta mössen fri tillgång till vanlig mat och vatten.
- Slumpmässigt dela mössen i en icke-diabetiker kontrollgrupp och en diabetiker grupp. Noggrant väga varje individuell mus och beräkna injektionsvolymen använder kroppsmassa varje mus.
- Snabb på möss för 4 h före streptozotocin (STZ) injektion och ge vanligt vatten som vanligt på experimentell dag 1.
- Förbereda 0,1 M natriumcitrat buffert med pH 4.3. Placera 1 mL lösning i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och Linda mikrocentrifug röret i aluminiumfolie att undvika ljus exponering.
- Lös STZ i natriumcitrat buffert (pH 4.3) till en slutkoncentration på 5 mg/mL före användning i arbetande.
- Ge mössen av diabetiker grupp intraperitoneal injektionerna av STZ vid en dos på 40 mg/kg med en 1 mL spruta och en 25-G nål. Injicera möss i kontrollen icke-diabetiker med samma volym av natriumcitrat buffert (pH 4.3).
- Sätta mössen tillbaka på burarna och förse dem med vanlig mat och 10% sackaros vatten.
- Upprepa steg 1,3-1,7 på experimentell dagar 2-5 (dvs. de nästa 4 dagarna).
- Ersätta 10% sackaros vattnet med vanligt vatten efter den sista STZ-injektionen.
- Snabbt på möss för 6 h, men ge dem fri tillgång till vatten, och mäta sina blodsockernivåer nio dagar senare (experimental dag 14). Samla ett blodprov från svans venen att bekräfta hyperglykemi med ett blod glukos övervakningssystem.
Obs: Möss med blod glukos nivåer > 200 mg / dL anses diabetiker.
2. beredning av instrumentet
- Rengöra optiska ytorna på sondens spets och sonden kontakt på laser Doppler apparaten med en mjuk, icke-slipande trasa att avlägsna damm och partiklar. Anslut kabeln till porten på instrumentet (figur 1A).
- Montera kalibrering ställningen genom att låta flux standard vara i termisk jämvikt med experimentella omgivning (rumstemperatur, oftast i 30 min). Skaka fluxen standard försiktigt för 10 s och låt det vila i 2 min.
- Placera behållaren flux standard mitt i kalibrering basen. Justera klämman till den maximala höjden och säkra sonden i klämman så att det pekar nedåt till behållaren. Kontrollera standarden flux är korrekt placerad under sonden.
- Långsamt flytta sonden ner tills spetsen är korrekt nedsänkt i flux-standarden. Välj och tryck på ”kalibrering” på laser Doppler apparater och kanalen arbeta som sonden är ansluten till. Kör programmet kalibrering tills ett ”kalibrering framgångsrika” meddelande visas på skärmen på laser Doppler apparater.
- Säkra sonden med hjälp av sonden innehavare. Manuellt säkra sonden för att undvika rörelse.
- Upprätthålla testrummet vid konstant temperatur (24 ± 1 ° C) och luftfuktighet (~ 50-60%).
- Stäng av något yttre ljus (t.ex. fluorescerande och spot lampor) innan du utför experimentet för att undvika yttre ljus-inducerad förändring.
3. förberedelse av djuren
- Autoklav den kirurgiska instrument och låt dem svalna till rumstemperatur före användning.
- Ge mössen 10 min acklimatisera sig till den experimentella miljön innan upptäcka bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion av laser Doppler.
- Fyll en 1 mL spruta med 1 mL 3% pentobarbital natrium. Injicera lösningen pentobarbital natrium (75 mg/kg i.p.) för att söva möss.
- Täcka ögonen på musen med pre-fuktad medicinsk gasväv att förhindra torrhet.
- Säkerställa att musen helt förlorar medvetandet och inte längre svarar på svansen eller hindfoot klämmer med pincett. Övervaka anestesi under narkos och intraoperativ evenemanget var 15 min. underhåll av anestesi genom att komplettera med 10% av den inledande injektionsvolymen av pentobarbital lösningen vid behov.
- Placera en värmedyna med en semi isolerande skikt under djuret och placera djuret i ryggläge och överföra den till arbetande stationen av laser Doppler apparater. Fixa musen för att arbetsplattformen med kirurgisk tejp.
- Provstickan bukhuden musen med betadine, och därefter 75% etanol används att svabba buken ren.
- Injicera 2% lidocaine/0.5% bupivakain (50/50) blandning subkutant. Klipp en ~ 3 cm-diameter hål i mitten av en gasbinda svamp. Täcka buken regionen med gasväv svamp.
- Lyft magen huden med pincett och gör ett inledande vertikala snitt längs mittlinjen av buken med hjälp av en skalpell eller hud sax.
- Förstå den underliggande muskeln med pincett och incisionsfilm ange bukhålan. Inte skada några organ. Vik i huden och underliggande muskler över bröstet för att avslöja bukhålan. Försiktigt exponera den pankreas kroppen och mjälte med hjälp av ett par blunt-nosed pincett.
4. datainsamling för analys
- Köra programvaran av laser Doppler apparaten genom att klicka på ”Arkiv” → ”ny” för att skapa en ny mätning-fil. Om du vill konfigurera anslutna bildskärmarna, under fliken ”Allmänt” ställa in övervakning varaktighet till ”gratis kör”. Använda fabriksinställningarna för fliken ”LDF Monitor” Klicka på ”Nästa”.
- Ställa in grafen displayen ”display setup dialogrutan”. Välja ”Flux, Conc, Speed” kanaler genom att markera respektive rutor. Välj följande parametrar: ”datakälla för kanalen” och ”etikett, enheter och färg”. Klicka på ”Nästa”.
- Ange användarinformation om föremålet och mätning (dvs. namn och ämne nummer, operatör, övervakning tid, kommentarer, etc.) i ”filen dialogrutan information” och klicka ”Nästa” för att slutföra konfigurationen av mätning.
Obs: En Mätfönster skapas automatiskt av programvaran (figur 1B). - Manuellt avancera elektroden till bukspottkörteln. Kontrollera att avståndet mellan sonden och bukspottkörteln vävnader är inom 1 mm. Ett olämpligt avstånd ger en artificiellt ökad eller minskad blod flöde läsning.
- Klicka på ikonen ”Start” verktygsfältet för att starta inspelningen mikrovaskulära blod perfusion enheter (PU) data. Samla in PU data kontinuerligt under 1 min varje kör. Klicka på ”Stop” för att avsluta mätningen. Välj ”fil” → ”Spara som” till namn och spara filen färdiga mätning.
- Manuellt flytta sonden efter varje körning att undvika additiva effekter och lokaliserade konsumtion av kontraktila och avkoppling kapacitet. Upprepa steg 4.1-4.4 skörda flerpunkts (dvs. tre slumpvis utvalda punkter från bukspottskörteln vävnad) mikrovaskulära PU data för varje mus. Mäta PU data av en icke-reflekterande platta som baslinjen kontroll.
- Nära magmuskelstation lagret och hudlagret med en sutur. Placera djuren i rena burar efter experimenten.
- Hålla den animaliska varmt genom att placera återhämtning buren halv-på en värmedyna.
Obs: Var uppmärksam på värmen, hygien, vätska och födointag och infektion. Administrera möss med 2 mg/kg karprofen för 48 h som postoperativ smärtlindring. Utföra dödshjälp genom att injicera 150 mg/kg natrium pentobarbital i.p. När möss observeras för att vara i ett tillstånd av svår smärta eller lidande som inte kan lindras.
5. beräkning av parametrarna för mikrovaskulära Vasomotion
- Använda kommandot ”Exportera” av laser Doppler programvaran för att exportera tid och PU rådata som *.xlsx fil och öppna filen i ett kalkylblad.
- Beräkna genomsnittlig baslinje perfusion enheten (PUb) (se steg 4,6).
- Beräkna den genomsnittliga blodgenomströmning (PUen) för 1 min av en mätning enligt följande: genomsnittlig blodgenomströmning (PUen) = PU - PUb (ekvation 1).
- Beräkna frekvensen (cykler/min) för varje 1 min mätning.
Obs: Frekvensen av mikrovaskulära vasomotion definieras som antalet toppar som inträffade i en mikrovaskulära vasomotion våg per minut. - Beräkna amplituden (ΔPU) för varje 1 min mätning.
- Beräkna amplituden av mikrovaskulära vasomotion som skillnaden mellan den högsta (PUmax) och lägsta (PUmin): amplitud (ΔPU) = PUmax - PUmin (ekvation 2).
- Beräkna den relativa hastigheten (PU) för varje 1 min mätning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett fotografi av mikrovaskulära vasomotion mätning laser Doppler apparater utrustade med en halvledare laser-diod visas i figur 1A. User interface programvara presenteras i figur 1B. Använder den metod som nämns ovan, upptäcktes hemodynamiska parametrar i bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion för både icke-diabetiker kontroll och diabetiska möss. En mängd olika tekniker, inklusive laser Doppler flowmetry, återspeglas spridda ljus, infraröd spektroskopi och avbildningstekniker, har använts för att studera mikrovaskulära vasomotion eftersom den definierades först. Tabell 1 sammanfattar forskargrupper och publicerade artiklar som använder laser Doppler teknik för att bestämma rollen av mikrocirkulationen i diabetes och relaterade sjukdomar.
I allmänhet representeras blodcirkulationens villkoren i bukspottskörteln Holmen av funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion med mikrovaskulära parametrar, inklusive genomsnittliga blodgenomströmning, amplitud, frekvens, relativ hastighet (figur 2). Det representativa mikrovaskulära vasomotion schematiskt diagrammet består huvudsakligen av periodiska kontraktion och avslappning faser (figur 2A). De hemodynamiska fenomen presenterar ett mönster av flöde blodgenomströmning i mikrovaskulära nätverk. PU data insamlade av laser Doppler apparater var anställda att diagrammet scatter diagram och Visa distribution mönstret av mikrovaskulära blodgenomströmning. I det nuvarande protokollet var distribution mönster av bukspottskörteln holme mikrovaskulära blodgenomströmning i icke-diabetiker och diabetiska möss helt annorlunda (figur 2B). En lägre skala av blodgenomströmning av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion observerades hos diabetiska möss jämfört med icke-diabetiker kontroll. Rytmen av sammandragningar och lättnader av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion var kaotisk och oregelbundna i STZ-inducerad diabetes möss, medan icke-diabetiker kontroller hade rytmiska svängningar (figur 2 c och figur 2D). Vi extraherade 5-s data av bukspottskörteln holme mikrovaskulära blodgenomströmning inom de streckade linjerna i figur 2 c och 2D-diagram och visat att de kaotiska fluktuationerna av bukspottskörteln holme mikrovaskulära blod perfusion hos diabetiska möss förlorat förmågan att reglera funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion, som skulle inträffa i svar på blod glukos fluctuation (figur 2E).
Vidare för att svara på hyperglykemi, behöver Langerhanska tillräckliga och biorhythmic blodgenomströmning flöde att transportera insulin. Den pankreas holme mikrovaskulära vasomotion parametrar (inklusive genomsnittliga blodgenomströmning, amplitud, frekvens och relativa hastigheten) var då beräknas och kvantitativt analyserade utifrån de PU-profilerna. Som visas i figur 3, jämfört med icke-diabetiker, minskade den genomsnittliga blodgenomströmning av bukspottskörteln holme mikrocirkulationen i STZ-inducerad diabetes möss (figur 3A). Samtidigt fanns det väsentliga minskningar anges i amplitud (figur 3B) och frekvens (figur 3 c) av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i STZ-inducerad diabetes möss. Den relativa hastigheten av bukspottskörteln holme blodgenomströmning minskat betydligt i STZ-inducerad diabetes gruppen jämfört med icke-diabetiker kontroll (figur 3D). Som nämnts ovan, var funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion nedsatt hos diabetiska möss. Vi spekulerar att rytm avvikelser, tillsammans med en minskad frekvens, amplitud och relativa hastigheten av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion, kan resultera i en underskrids av mikrovaskulära blodgenomströmning, vilket kan skada β cellöar och minska insulinutsöndringen.
Figur 1. Apparaten används för att bestämma bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i vivo. A. fotografi av mätning apparaten används för att bestämma den pankreas holme mikrovaskulära vasomotion möss. Den sonden sockets och laser strömbrytare är i den vänstra panelen. Bildskärmens flytande kristaller är i mellersta panelen. Menyknapparna (dvs, upp, ner, och ange knappar) och den makt lysdiod är i den högra panelen. Kringutrustning (dvs. datorer och kablar) visas inte. B. skärmdump som illustrerar den typiska beståndsdelar och Graf kanaler av laser Doppler apparater programvara. ”Flux”, ”Conc”,, ”DC”, och ”Speed” mätning mätvärden visas i grafen kanaler. ”Flux” representerar vävnadsperfusion mikrovaskulära blod, ”Conc” representerar vävnad mikrovaskulära blodkroppar koncentrationen, ”DC” representerar medelvärdet intensiteten av reflekterande ljus och ”Speed” representerar den relativa hastigheten av mikrovaskulära blodflödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Funktionella status bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i möss. Blodgenomströmning av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion bedömdes genom en laser Doppler apparater och funktionella status analyserades. A. Schematisk bild av parametrar avseende mikrovaskulära vasomotion. AC representerar amplituden för en mikrovaskulära vasomotion sammandragning, Ar representerar amplituden för en mikrovaskulära vasomotion avkoppling, Tc representerar längden på tiden av en mikrovaskulära vasomotion sammandragning och Tr representerar längden av tid av en mikrovaskulära vasomotion avkoppling. B. spridningsbild av bukspottskörteln holme mikrovaskulära blodgenomströmning i icke-diabetiker och diabetiska möss. Röda prickar: icke-diabetiker möss. Blå prickar: diabetiska möss. Den streckade gröna linjen visar avgränsningen mellan icke-diabetiker och diabetes mikrovaskulära blod perfusion mönstret. C. bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i kontrollgruppen bedömdes på grundval av dynamiska mikrovaskulära perfusionen av det blod flödet. D. bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i diabetiska möss bedömdes på grundval av dynamiska mikrovaskulära perfusionen av det blod flödet. E. Diagram över representant (5-s intervall) bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion mellan icke-diabetiker kontroll och diabetiska möss. Röda linjen: icke-diabetiker kontroll. Blå linje: diabetiska möss. PU: perfusion enheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Quantification av parametrarna för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion. Bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion parametrar, inklusive genomsnittliga blodgenomströmning, amplitud, frekvens och relativa hastigheten var analyseras och jämförs mellan icke-diabetiker kontroll och diabetiska möss. A. Quantification av den genomsnittliga blodgenomströmning (PU/min) av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion hos icke-diabetiker och diabetiska möss. B. amplitud (ΔPU), C. frekvens (cykler/min), och D. släktinghastighet (PU) av bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion var lägre hos diabetiska möss än hos icke-diabetiker kontroll möss. Amplituden av mikrovaskulära vasomotion beräknas som skillnaden mellan den högsta (PUmax) och lägsta (PUmin). Frekvensen av mikrovaskulära vasomotion definierades som antalet toppar eller dalar som inträffade i en mikrovaskulära vasomotion våg per minut. Uppgifterna presenterades som det medelvärde ± SD (n = 6 i varje grupp). P < 0,05, **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sjukdomar | Objekt | Apparater | ReFS No. |
| Endotelfunktion | H | LDF, LSCI | 11, 12, etc. |
| DN | H, R | LDF | 13, 14, 15, m.m. |
| DR | H | LDF | 16, 17, 18, osv |
| Hud/kutana mikrocirkulationen | H | LDF | 11, 19, 20, m.m. |
| Hjärt mikrocirkulationen | R | LDF | 21 |
| Nedsatt hörsel | M | LDF | 22 |
| DN, diabetesneuropati. DR, diabetesretinopati. LDF, laser Doppler flowmetry. | |||
| LSCI, laser speckle kontrast imaging. R, råtta. H, människa, M, mus. | |||
Tabell 1. Rollen av mikrocirkulationen i diabetes och dess komplikationer. Forskargrupper har använt laser Doppler för att bestämma rollen av mikrocirkulationen i diabetes och dess komplikationer i årtionden. Relaterade artiklar på senare år listas här. Dessa publicerade artiklar fokusera främst på endoteldysfunktion, diabetisk neuropati (DN), diabetesretinopati (DR), hud och kutan mikrovaskulära njurfunktion och relativt sällsynta komplikationer såsom hjärt mikrocirkulationen dysfunktion och hörsel njurfunktion. DN: diabetesneuropati. DR: diabetesretinopati. LDF: laser Doppler flowmetry. LSCI: laser speckle kontrast imaging. R: råtta. H: mänskliga. M: mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de fall som involverar mikrovaskulära dysfunktion (t.ex. diabetes, akut pankreatit, perifer mikrovaskulära sjukdomar, etc.), leder vissa sjukdomar till minskat blodflöde. Andra än förändringar i blodflödet finns det viktiga indikatorer, såsom mikrovaskulära vasomotion, som speglar den funktionella statusen mikrocirkulationen. Den särskilda indikatorn, mikrovaskulära vasomotion, definieras allmänt som svängningen av mikrovaskulära tonen i mikrovaskulära sängar. I det nuvarande protokollet tillåter en mikrovaskulära blodgenomströmning övervakningssystem för direkt visualisering och kvantitativ analys av mikrovaskulära vasomotion funktionella status. Våra blodcirkulationens utvärderingsmetod kan tillämpas selektivt på riktade vävnader och organ genom att identifiera dynamiska förändringar i blodgenomströmning. Rapporter publicerade av andra grupper om att använda laser Doppler för att bestämma rollen för mikrovaskulära blodgenomströmning i diabetes och dess komplikationer var sammanfattas i tabell 1. I den aktuella studien, för att demonstrera vårt angreppssätt, utvärderades funktionella status av den pankreas holme mikrovaskulära vasomotion av diabetiska möss.
Mikrovaskulära vasomotion är erkänt som en parameter för den funktionella statusen mikrocirkulationen och kan reglera flödet blodgenomströmning genom att justera fördelningen i lokal vävnadsreaktion23. Mikrocirkulation i bukspottkörteln, som kan delas in i holmar, acini och kanaler, har studerats i årtionden. I grund och botten är detta avskiljande i bukspottkörteln i olika delar för bekvämlighet bara eftersom mikrocirkulation faktiskt är sammankopplade och homogena som en organisk enhet24. Detta mikrocirkulation nätverk stöder regleringen av bukspottskörteln holme blodflödet. Därför använde vi parametrar av funktionella status, bestäms av laser Doppler, för att representera bukspottskörteln holme mikrocirkulation vasomotion. Dock på grund av egenskaperna hos bukspottskörteln arkitekturen, vi fortfarande inte att göra en bedömning efter tillämpning av den nuvarande metoden för att fastställa om blodgenomströmning är härledd från den endokrina delen eller den exokrina delen av bukspottkörteln. Använda holme-specifik kan märkning färgämnen, såsom dithizone och neutralrött, bli ett av de möjliga sätten att förstå problemet, åtminstone till viss del.
En viktig aspekt av steget mätning är avståndet mellan sonden och bukspottkörteln vävnad. Ett olämpligt avstånd ger ett artificiellt ökat blodflöde läsning. Den fysiska kraft till vävnader och organ som en Sondspetsen minskar mikrovaskulära blodflödet. Minimal trycket bör därför tillämpas när mätningar. En annan punkt att notera är kraften av lasrar. Hög effekt lasrar generellt skadar lätt microvesselsna i bukspottskörteln Holmen, så att frekvensen av laserstrålen behöver kontrolleras, inom begränsningar. För allmänna och temporal mätningar rekommenderas en frekvens av 1 Hz eller mindre. För att undvika lokaliserade konsumtion av mikrovaskulära vasomotion kapacitet (inklusive kontraktila och avkoppling) och additiv effekt, föreslås multipoint beslutsamhet och ompositionering webbplats efter varje mätning i alla experiment.
I den nuvarande metoden används PU uppgifterna för att representera blod flödet av mikrovaskulära blodflödet. På grund av egenskaperna hos mikrovaskulära blodflödet i mikrocirkulationen är det inte möjligt att bestämma den absoluta flöde enheten (t.ex., mL/min/100 g av specifika organ eller vävnader). Därför är bedömning parametern systemet används här baserat på den relativa blod flöde perfusion enheten. Wavelet analys, snabba fouriertransformen och andra spektralanalys algoritmer är vanliga metoder att genomföra laser Doppler signaler. I detta protokoll etablerade vi ett arbetssätt som använder hemodynamiska parametrar (dvs blodgenomströmning, amplitud, frekvens, och relativa hastigheten) för att Visa funktionella status för mikrovaskulära vasomotion. Noggrannheten i mätningen är dessutom närstående till djupet av målet och den probe-design, som är i allmänhet ca 1 mm. Således, tjockare eller kompakt organ och vävnader kan vara olämplig för tillämpning av laser Doppler och den nuvarande metoden. Dessutom, eftersom de data som härrör från blod flöde perfusion kan påverkas av andra förhållanden som orsakar märkbara förändringar, inklusive temperatur, luftfuktighet, yttre ljus och förändringar i position av möss, ska vissa regler följas under experimentella förfarandet. Laboratoriet måste behålla konstant temperatur och fuktighet, och extern belysning behöver vara skärmade. Det rekommenderas att fixa möss för att undvika förändringar i position. Man tror att dessa strategier kan övervinna de begränsningar som nämns ovan och kommer att öka noggrannheten för blod flöde perfusion.
Fördelen med detta protokoll jämföra med andra rapporterade i litteraturerna är att det är känsliga och lyhörda för den lokala mikrovaskulära vasomotion av vävnader och organ. Detta kommer att underlätta en bredare tillämpning av metoden för bedömning eller utredning av mikrocirkulationen, särskilt funktionella status för mikrovaskulära vasomotion, i både kliniska och ravinens forskning. Programmen inkluderar men begränsas inte till: ischemi visualisering, blod perfusion bedömning och utvärdering av funktionell status för mikrovaskulära vasomotion. Sammanfattningsvis, vår metod kan användas för att undersöka och utvärdera funktionella status för bukspottskörteln holme mikrovaskulära vasomotion i möss i vivo och kanske kunna möta kliniska behovet av att bedöma mikrocirkulationen funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från Peking Union Medical College ungdom fonden och den grundläggande forskningsmedel för Central universiteten (Grant nr 3332015200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data |
| MoorVMS-PC Software | Moor Instruments | GI80-1 | Software of MoorVMS-LDF2 |
| Calibration stand | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration base | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| Calibration flux standard | Moor Instruments | GI-cal | Calibration tool |
| One Touch UltraEasy glucometer | Johnson and Johnson | #1955685 | Confirm hyperglycemia |
| One Touch UltraEasy strips | Johnson and Johnson | #1297006 | Confirm hyperglycemia |
| Streptozotocin | Sigma-Aldrich | S0130 | Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3) |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | Working concentration 3 % |
| Ethanol | Sinopharm Inc. | 200121 | Working concentration 75 % |
| Sucrose | Amresco | 335 | Working concentration 10 % |
| Medical gauze | China Health Materials Co. | S-7112 | Surgical |
| Blunt-nose forceps | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Surgical |
| Surgical tapes | 3M Company | 3664CU | Surgical |
| Gauze sponge | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Surgical |
| Scalpel | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Surgical |
| Skin scissor | Carent | 255-17 | Surgical |
| Suture | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Surgical |
| Syringe and 25-G needle | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Scale: 1 ml |
References
- Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
- Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
- Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
- Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301 (2008).
- De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
- Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
- Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
- Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
- Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
- Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
- de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
- Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
- Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
- Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
- Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
- Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
- Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
- Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
- Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
- Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
- Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
- Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).
