Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse av sialsyre i lever og melkprøver av villtype og Published: July 14, 2017 doi: 10.3791/56030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University

Summary

Vi beskriver en HPLC-basert metode for bestemmelse av N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i muselever og melk.

Abstract

CMAH (cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrehydroksylase) er ansvarlig for oksydasjonen av cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyrer i pattedyr. Imidlertid kan mennesker ikke oksidere cytidinmonofosfat-N-acetylneuraminsyre til cytidinmonofosfat-N-glykolylneuraminsyre på grunn av en primær exon-deletjon av CMAH- genet. For å forstå effektene og implikasjonene av mangel på CMAH-aktivitet mer detaljert, er en Cmah- knock-out-modell i mus av stor interesse for grunnleggende og anvendt forskning. Analysemetoden for å bestemme fenotypen til denne musemodellen er her beskrevet i detalj, og er basert på deteksjon av både N-acetylneuraminsyre og N-glykolylenuraminsyre i leveren og melk av vill-type og Cmah- knock-out-mus. Endogene sialinsyrer frigjøres og derivatiseres med o-fenylendiamin for å danne fluorogene derivater, som deretter kan analyseres ved HPLC. Den presenterte protokollen kan væreOgså søkt om analyse av melke- og vevsprøver fra forskjellige andre opprinnelser, og kan være nyttig for å undersøke nærings- og helseeffekter av N-glykolylneuraminsyre.

Introduction

N-acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc) er de vanligste sialinsyrene i de fleste pattedyr 1 . Selv om det er i stand til å syntetisere Neu5Ac endogent, er mennesker ikke i stand til å produsere Neu5Gc på grunn av en primær ekson deletion på CMAH genet som koder for en CMP-Neu5Ac hydroksylase 2 , 3 . Imidlertid kan animalske matvarer være kostholdskilder til Neu5Gc 4 , 5 , 6 , som fører til produksjon av anti-Neu5Gc-antistoffer og dermed utløse en immunrespons mot Neu5Gc 7 . Denne diettvirkningen av Neu5Gc er mistenkt for å bidra til kronisk betennelse og ulike andre sykdommer 8 , 9 , 10 . For å forstå forståelsen av Neu5Gc i hUmans, er en dyremodell for den systematiske studien av virkningene av matbårne sialinsyrer, svært ønskelig. Selv om protokoller basert på polymerasekjedereaksjon (PCR) for analyse av knock-out-mus er veletablert og en praktisk måte for den genotypiske vurderingen, krever funksjonell analyse av fenotype på metabolsk nivå mer spesifikke analysemetoder. Fenotypen av en Cmah- knock-out-musemodell kan vurderes ved å isolere og analysere sammensetningen av sialinsyrer i lever- eller melkeprøver. Flere metoder for påvisning av sialinsyrer i animalsk vev har tidligere blitt rapportert: omsetning av sialinsyrer med resorcinol 11 eller tiobarbitursyre 12 resulterer i dannelsen av et kromoforisk produkt og kan enkelt analyseres ved hjelp av en platereaderbasert oppsett, men bare den totale sialiske Syreinnhold kan bestemmes. Alternativt ble analysen av sialinsyrer også beskrevet under anvendelse av gaskromatografi13 , MALDI-ToF massespektrometri 14 eller amperometriske metoder 15 . Imidlertid er de mest anvendte sialinsyreanalysemetoder basert på hydrolytisk frigjøring, etterfulgt av fluorescensderivatisering og etterfølgende høyytelsesvæskekromatografi 16 , 17 , 18 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer som involverer dyrefag, er godkjent av Etikkutvalget for Experimentell dyresenter ved Nanjing landbruksuniversitet i samsvar med de nasjonale retningslinjene for dyrevelferd (Vitenskapsministeriet, PR i Kina, 2006) med dyrene som er plassert i en SPF Anlegg (Tillatelses ID: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah Knock-out Mus Modell

  1. Bruk wild-type C57Bl / 6-mus fra Comparative Medicine Center of Yangzhou University (Kina).
    MERK: Cmah knock-out mus ble generert basert på informasjon fra tidligere Cmah knock-out-studier 17 og 19 og som oppnås kommersielt ved hjelp av en CRISPR / Cas9 20 strategi ved å fjerne 92 basepar fra exon 6 i Cmah genet, som også er Slettet i det humane CMAH- genet 19 . Positiv F 0 </ Sub> -mus (2 personer) ble krysset med villtype mus for å oppnå heterozygotisk F 1- mus. Etter krysning av heterozygotiske F 1- mus (5 personer) kunne homozygot Cmah- knock-out F 2- mus oppnås med suksess (3 personer).
  2. Utfør genotyping av mus ved bruk av genomisk DNA i henhold til metoden vist av Zangala 21 ved bruk av et kommersielt DNA-rensingssett.
    1. Amplifiser et tilsvarende DNA-fragment av Cmah- genet ved bruk av kommersiell DNA-polymerase og primerparet 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'og 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Utfør genforsterkningen ved å bruke 34 PCR-sykluser bestående av denaturering ved 94 ° C i 40 s, annealing ved 63 ° C i 40 s og forlengelse ved 72 ° C i 1 min.
    2. Visualiser PCR-produkter på en 1% agarosegel. Man bør observere et enkelt bånd (0,5 kb) for den villtype-typen, et dobbeltbånd (0,4 og 0,5 kb) forHeterozygot utløsende individ, og et enkeltbånd (0,4 kb) for den homozygote utløsende personen.

2. Prøveinnsamling

  1. Samle musemelk ved hjelp av protokollen beskrevet av Willingham et al. 22 .
  2. Samle muselevervev ved hjelp av protokollen beskrevet av Gonçalves et al. 23 og lagre prøver ved -80 ° C.

3. Isolering av sialsyre fra melk

  1. Forbered 100 ml av en 2 M eddiksyreoppløsning ved tilsetning av 12 ml iseddik i 88 ml destillert H2O
  2. Overfør 50 μl melk i et 1,5 ml sentrifugerør og tilsett 1,2 ml av den tilberedte vandige eddiksyreoppløsningen.
  3. Inkuber suspensjonen i 4 timer ved 80 ° C og sentrifuger prøven ved 14.000 xg i 10 minutter.
  4. Overfør topp 1000 μL av supernatanten i et nytt 1,5 ml sentrifugerør og remAv løsningsmidlet ved sentrifugalfordampning ved romtemperatur for å fullføre tørrhet (avhengig av den tilkoblede vakuumpumpen vil dette ta 4-20 timer). Re-oppløse prøven i 500 ul destillert H2O
  5. Klargjør en mikroanionbytterkolonne. Dette trinnet vil spesifikt anrikere anioniske forbindelser og fjerne kationiske og nøytrale forbindelser fra melke- og leverprøvene, og øker dermed selektiviteten til det fluorogene OPD-merkemidlet for sialinsyrederivatisering.
    1. Overfør for hver prøve 200 mg av anionbytterharpiks (Dowex 1X8) i tomme 3 ml kolonnør med en festet stoppeklokke.
    2. Tilsett 2 ml av den vandige eddiksyreoppløsningen fremstilt i trinn 3.1 for å erstatte kloridioner i harpiksen med acetationer. Lukk stoppekranen så snart løsningsmidlet når toppen av harpiksen.
    3. Tilsett forsiktig 2 ml destillert H 2 O, åpne stoppekranen og stopp strømmen så snart det meste av løsningsmidlet nårToppen av harpiksen. Pass på at harpiksen alltid er dekket med løsningsmiddel.
    4. Vask harpiksen kolonnen to ganger til med 2 ml destillert H2O for å fjerne overskytende ester.
  6. Overfør den resulterende 500 ul prøve løsningsmiddel fra trinn 3.4. På harpiks-kolonnen og kaste bort gjennomstrømmingen. Forsiktig vaske resinet med 2 ml destillert H2O Elute prøve anionene fra harpiksen ved anvendelse av 1 ml av en 50 mM ammoniumacetat-løsning (386 mg ammoniumacetat ble oppløst i 100 ml destillert H2O) inn i et 1,5 mL Sentrifugerør. Fjern oppløsningsmidlet ved sentrifugalfordampning ved romtemperatur til tørrhet.
    MERK: Tørre prøver kan lagres ved 4-6 ° C i opptil 12 måneder.

4. Isolering av sialsyre fra leverenvev

  1. Tørk forsiktig 20 - 50 mg muselever og overfør den til en Dounce-vevkvern (1 ml eller 2 ml volum). Tilsett 1,2 ml av den vandige eddiksyreoppløsningenFremstilt i trinn 3.1 og homogenisere vevet ved forsiktig avskjæring i 10 s. Overfør den resulterende suspensjonen i et 1,5 ml sentrifugerør.
  2. Følg trinnene 3.3. Til 3,6.
    MERK: Tørre prøver kan lagres ved 4-6 ° C i opptil 12 måneder.

5. Fremstilling av en blandet sialsyre standard

  1. Vekt mellom 5 - 8 mg N-acetylneuraminsyre på en analytisk balanse i et 1,5 ml sentrifugerør. Legg merke til nøyaktig vekt og tilsett 164 μl destillert H 2 O for hver mg ( dvs. hvis vekten av Neu5Ac er 7,2 mg og deretter tilsette 7,2 x 164 = 1, 181 μl destillert H 2 O). Dette resulterer i en 20 mM Neu5Ac stamløsning som kan lagres ved -20 ° C i opptil 12 måneder.
  2. Oppnå N-glykolylneuraminsyre i mindre mengder til en moderat pris, som i 1 mg alikvoter. Legg 154 mL av destillert H2O direkte til forbindelsen for å oppnå en ~ 20 mM Neu5Gc stamløsning. OverførOppløsning i et 1,5 ml sentrifugerør. Denne løsningen kan lagres ved -20 ° C i opptil 12 måneder.
  3. Kombiner 5 μL fra hver stamløsning fra trinn 5.1 og 5.2 i et nytt 1,5 ml sentrifugerør og fjern løsningsmidlet ved sentrifugalfordampning ved romtemperatur til tørrhet.
    MERK: Den blandede sialinsyrestandarden kan lagres ved 4 - 6 ° C i opptil 12 måneder.

6. Fluorescens-derivatisering av sialsyre

  1. Fremstill 10 ml OPD-oppløsning, bestående av 100 mg o-fenylendiamin og 208 mg av natriumhydrogensulfitt i 10 ml destillert H2O
  2. Tilsett 20 μL OPD-løsning til sialinsyreprøver avledet fra musmelk (trinn 3), muselever (trinn 4) eller blandet sialinsyrestandard (trinn 5). Vortex kraftig i 30 s og inkuber prøver i 4 timer ved 80 ° C i mørket ( dvs. vikle mikrotubes i aluminiumsfolie).
  3. La prøvene kjøle ned i 5 minutter, tilsett 80 μ; Liter destillert H2O og sentrifugere rørene ved 14.000 x g i 1 min.
  4. Overfør 80 μL fra supernatanten til et 300 μL HPLC-hetteglass med høy gjenvinning. De derivatiserte sialinsyreprøver kan lagres ved 4 - 6 ° C i opptil en uke.

7. HPLC-analyse av sialsyre-derivater

  1. Analyser prøvene ved hjelp av et standard HPLC-system koblet til en elektronisk fluorescensdetektor.
  2. Bruk en omvendt fase C18 kolonne med standard dimensjoner på 250 mm lengde og 4,6 mm diameter for analysen.
  3. Tilbered løsningsmiddel A ved å fortynne 200 ml stamløsning med 800 ml LCMS-klasse vann (LCMS - væskekromatografi massespektrometri). Selve bestandeløsningen kan fremstilles som følger:
    1. Legg 46 g maursyre i 800 ml LCMS-klasse H 2 O.
    2. Juster pH til 4,5 ved dråpevis tilsetning av ammoniumhydroksydoppløsning (puris. Pa).
    3. Overfør løsningsmidlet til aMålesylinder og fyll opptil 1000 ml med LCMS-klasse H 2 O. Denne stamopløsningen kan lagres ved 4 - 6 ° C i opptil 3 måneder.
  4. For løsningsmiddel B, bruk LCMS-klasse acetonitril.
  5. Separat sialinsyrederivatene ved en strømningshastighet på 1 ml / min med følgende gradienteluering:
    1. Begynn med å tilsette 10% løsningsmiddel B blandet til løsemiddel A.
    2. Fra 0 min til 15 min øker du gradvis løsningen av løsningsmiddel B med en lineær gradient til 60%.
    3. Fra 15 min til 16 min øker du raskt andelen løsemiddel B med en lineær gradient fra 60% til 90%. Dette initierer vaskingen av HPLC-kolonnen.
    4. For ytterligere å vaske HPLC-kolonnen, hold nivået av løsningsmiddel B ved 90% mellom 16 minutter og 18 minutter før det gradvis reduserer nivået av løsningsmiddel B igjen til 10% mellom 18 minutter og 19 minutter.
    5. Re-ekvilibrere HPLC-kolonnen til startbetingelsene på 10% B mellom 19 og 24 minutter.
  6. IFordel 50 μL prøve i HPLC-systemet.
  7. Overvåk eluenter ved hjelp av fluorescensdetektorens eksitasjons- / utslippsbølgelengder på 373/448 nm, og de derivatiserte sialinsyrene kan forventes ved omtrentlige retensjonstider på 9 minutter (for Neu5Gc-OPD) og 10 minutter (for Neu5Ac-OPD).
  8. Beregn den relative mengden Neu5Gc (F Neu5Gc ) fra fluorescens toppområdene i Neu5Ac (A Neu5Ac ) og Neu5Gc (A Neu5Gc ) som følger: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). I tilfelle melke- og leverprøver fra den homozygote Cmah- knock- outmusen F Neu5Gc skal være 0%, mens verdiene for F Neu5Gc av heterozygote og villtype mus kan variere mye avhengig av musalder og vevstype (mellom 2% Og> 90%) med forventede feilmarginer på ± 12%.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk oversikt over den beskrevne analysemetoden er vist i figur 1 og inkluderer isolering av sialinsyrer fra melke- og leverprøver av vildtype- og Cmah- knock-out- mutantmus , og fluorescensderivatiseringen og HPLC-analysen av disse komponentene. Figur 2 og Figur 3 viser representative HPLC-kromatogrammer av derivatiserte sialinsyrer av melke- og leverprøver fra homo- og heterozygote utblokkende Cmah- mus (- / - og +/-) og villtype-mus. Figur 4 viser de oppnådde relative mengder av N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc) av de analyserte musprøver beregnet fra HPLC-toppområdene.

Figur 1
Figur Ng class = "xfig"> 1 : Skjematisk oversikt over den beskrevne analysemetode for sialsyre fra mus-avledet melk og leverprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : HPLC-kromatogrammer av fluorescensmerkede sialsyre fra melksampler avledet fra homo- og heterosygote knock-out Cmah- mus (- / - og +/-) og villtype -mus. Det øverste kromatogrammet er den blandede sialinsyrestandarden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

"Src =" / files / ftp_upload / 56030 / 56030fig3.jpg "/>
Figur 3 : HPLC-kromatogrammer av fluorescensmerkede sialsyre fra leverprøver avledet fra homo- og heterosygote utblokkende Cmah- mus (- / - og +/-) og villtype -mus. Det øverste kromatogrammet er den blandede sialinsyrestandarden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4 : Relative mengder av N-glykolylneuraminsyre (Neu5Gc) av de analyserte musprøver beregnet fra HPLC-toppområdene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den her presenterte protokollen tillater fenotypisk vurdering av homozygote Cmah- knock-out-mus ved å analysere og kvantifisere de relative mengder av Neu5Gc av melk og leverprøver. Analysen ble utført ved bruk av en standard HPLC-oppsett med fluorescensdeteksjon. Det mest kritiske trinn i denne prosedyren er fremstilling av anionbytterkolonnene og utførelse av anionutvekslingskromatografi; Å avgjøre harpiksen riktig og å samle de riktige vaske- og elueringsfraksjonene tar litt øvelse.

Alternativt kan det her anvendte derivatiseringsmiddel OPD enkelt erstattes med det dyrere derivatiseringsmiddel DMB (1,2-diamino-4,5-metylendioxybenzen). Videre ble analysen av de oppnådde sialinsyrederivater fra trinn 6,5. Kan også analyseres ved hjelp av massespektrometrisk deteksjon i stedet for fluorescensdeteksjonen ( dvs. Shimadzu Nexera UPLC-system kombinert med MS-2020-detektor). ENVed bruk av trinnene 7.2 - 7.6 blir sialinsyrederivatene detektert direkte ved bruk av positiv ioniseringsmodusskanning for m / z-forholdene 382,0 og 398,0 (disse er H + -adduktene henholdsvis Neu5Ac-OPD og Neu5Gc-OPD).

En begrensning av denne metoden er at Neu5Gc-innholdet kun kan kvantifiseres i forhold til Neu5Ac-mengden, men ikke på absolutt måte. For å gjøre dette, ville tilsetning av en tydelig og kvantifiserbar sialinsyre som en intern standard være nødvendig i den første fase av prøvepreparatet. En annen mangel er at bare homozygote, men ikke heterozygote Cmah- knock-out-mus kan bli entydig identifisert, da den relative mengden av Neu5Gc-heterozygote utslagningsmus kan variere sterkt avhengig av prøvetype ( dvs. vev) og alder av de enkelte mus. Fremtidig utvikling av denne metoden kan omfatte tillegg av interne standarder og absolutt kvantifisering av sialinsyrer i mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av Natural Science Foundation of China (bevilgningsnummer 31471703, A0201300537 og 31671854 til JV og LL), og 100 Foreign Talents Plan (bevilgningsnummer JSB2014012 til JV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid Sigma A0812
N-glycolylneuraminic acid Sigma 50644 1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine Sigma 694975
Sodium hydrogen sulfite J&K Scientific Ltd 75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes Supelco Sigma 57024 empty solid phase extraction columns
Luer stopcock Sigma S7396 to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8 Dow Chemicals Sigma 44340 200 - 400 mesh
Dounce tissue grinder Sigma D8938 tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial Agilent Technologies #5188-2788
HPLC System Shimadzu Nexera
Fluorescence Detector for HPLC Shimadzu RF-20Axs
HPLC Column Phenomenex Hyperclone ODS 250 x 4.6 mm
LCMS-grade H2O Merck Millipore #WX00011
LCMS-grade Acetonitrile Merck Millipore #100029 Hypergrade
Ammonium hydroxide solution Fluka #44273 puriss. P.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
  2. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
  3. Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
  4. Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
  5. Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
  6. Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
  7. Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
  8. Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
  9. Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
  10. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  11. Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
  12. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
  13. Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
  14. Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
  15. Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
  16. Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
  17. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  18. Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
  19. Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246 (2007).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169 (2007).

Tags

Biochemistry utgave 125 CMAH sialinsyre Neu5Gc N-glykolylneuraminsyre Neu5Ac HPLC-FLD musemelk
Bestemmelse av sialsyre i lever og melkprøver av villtype og<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mus.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cao, C., Wang, W. J., Huang, Y. Y.,… More

Cao, C., Wang, W. J., Huang, Y. Y., Yao, H. L., Conway, L. P., Liu, L., Voglmeir, J. Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.. J. Vis. Exp. (125), e56030, doi:10.3791/56030 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter