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Biology

जंगली प्रकार के जिगर और दूध नमूनों में शाही एसिड का निर्धारण Published: July 14, 2017 doi: 10.3791/56030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University

Summary

हम माउस लिवर और दूध में एन-एसिटीन्यूरिनमिक एसिड और एन-ग्लाइकोलेनुर्मेनिक एसिड के निर्धारण के लिए एक एचपीएलसी आधारित पद्धति का वर्णन करते हैं।

Abstract

सीएमएएच (साइथिडिन मोनोफोस्फेट-एन-एसिटाइलेनमैनिनिक एसिड हाइड्रोक्साइलेज) स्तनपायी में साइटिडाइन मोनोफोस्फेट-एन-एसिटाइलेनेमैनिक एसिड के ऑक्सीकरण के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, सीएमएएच जीन के प्राथमिक एक्सीन विलोपन के कारण मानव साइटिडिन मोनोफोसाफ्टी-एन-एसिटालेनमरामिनी एसिड को साइटिडाइन मोनोफोस्फेट-एन-ग्लाइकोलाइनेरमिनिक एसिड में ऑक्सीकरण नहीं कर सकते। अधिक विस्तार से सीएमएएच गतिविधि की कमी के प्रभावों और प्रभावों को समझने के लिए, चूहों में एक सीएमए दस्तक आउट मॉडल मूल और व्यावहारिक अनुसंधान में गहरी रुचि का है। इस माउस मॉडल के phenotype को निर्धारित करने के विश्लेषण विधि को यहाँ विस्तार से वर्णित किया गया है, और यह एन-एसिटीन्युरमिनिक एसिड और एन-ग्लाइकोलेनुर्मेनिकिक एसिड दोनों का पता लगाने और जंगली प्रकार के दूध और सीएमह दस्तक-चूहों के दूध पर आधारित है । अंतर्जात sialic एसिड को छोड़ दिया जाता है और ओ-फेनिलेनेडाइनिन के साथ फ्लोरोजेनिक डेरिवेटिव उत्पन्न होता है, जिसे बाद में एचपीएलसी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल हो सकता हैविभिन्न अन्य मूलों से दूध और ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए भी आवेदन किया है, और एन-ग्लाइकोलाइनेमिनिक एसिड के पोषण और स्वास्थ्य प्रभावों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

एन-एसिटाइलेनेमिनिक एसिड (Neu5Ac) और एन-ग्लाइकॉलन्यूरमिनिक एसिड (Neu5Gc) सबसे अधिक स्तनपायी 1 में सबसे आम sialic एसिड हैं। यद्यपि Neu5Ac अंतर्जात रूप से संश्लेषण करने में सक्षम हैं, मानव CMU-Neu5Ac हाइड्रॉक्सीलेज़ 2 , 3 के लिए सीएमएएच जीन एन्कोडिंग पर प्राथमिक एक्सीन हटाने के कारण Neu5Gc पैदा करने में सक्षम नहीं हैं। हालांकि, पशु-आधारित खाद्य उत्पादों Neu5Gc 4 , 5 , 6 के आहार स्रोत हो सकते हैं , जो एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए अग्रणी हैं और इसलिए Neu5Gc 7 के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को गति प्रदान करता है। Neu5Gc के इस आहार प्रभाव को पुरानी सूजन और विभिन्न अन्य रोगों 8 , 9 , 10 में योगदान करने के लिए संदेह है। एच में Neu5Gc के प्रभावों को व्यापक रूप से समझने के लिएUmans, एक पशु मॉडल, भोजनजन्य sialic एसिड के प्रभावों के व्यवस्थित अध्ययन के लिए बहुत ही वांछनीय है यद्यपि नाक-आउट चूहों के विश्लेषण के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) पर आधारित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित हैं और जीनाटिकल मूल्यांकन के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, चयापचय स्तर पर फेनोटाइप के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अधिक विशिष्ट विश्लेषण विधियों की आवश्यकता होती है। सीमाह दस्तक आउट माउस मॉडल की फीनोटाइप को लीवर या दूध के नमूनों में सैसिल एसिड की संरचना को पृथक और विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है। जानवर के ऊतकों में सियालिक एसिड का पता लगाने के लिए कई तरीके पहले से सूचित किये गये हैं: रेमोसीनॉल 11 या थिओबर्बिटुरिक एसिड के साथ एक क्रोमोफोरिक उत्पाद के गठन में 12 परिणाम और एक प्लेटिडर आधारित सेटअप का आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन केवल कुल सैसिल एसिड सामग्री निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सीलिक एसिड का विश्लेषण गैस क्रोमैटोग्राफी का भी वर्णन किया गया था13 , माल्डी-टूफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री 14 या एम्परमेट्रिक मेथड्स 15 हालांकि, सबसे अधिक लागू सिलिका एसिड विश्लेषण विधियों हाइड्रोलाइटिक रिलीज पर आधारित हैं, इसके बाद प्रतिदीप्ति व्युत्पत्तिकरण और बाद में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी 16 , 17 , 18 ।

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Protocol

पशु विषयों से संबंधित प्रक्रियाएं नानजिंग कृषि विश्वविद्यालय के प्रायोगिक पशु केंद्र की एथिकल कमेटी द्वारा प्रायोगिक पशु कल्याण (विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, चीन, पीआर, 2006) के लिए राष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार एसपीएफ़ में रखे गए जानवरों के साथ अनुमोदित हैं सुविधा (अनुमति आईडी: SYXK-J-2011-0037)

1. सीएमह नॉक-आउट माउस मॉडल

  1. यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय (चीन) के तुलनात्मक चिकित्सा केंद्र से जंगली प्रकार का सी 57 बीएल / 6 चूहों का प्रयोग करें।
    नोट: सीएमए नाक-आउट चूहों को पिछले सीमाह दस्तक आउट अध्ययन 17 , 1 9 से उपलब्ध कराई गई जानकारी के आधार पर उत्पन्न किया गया था और सीएमएसआरआर / कास 9 20 रणनीति का इस्तेमाल करके सीएमएएच जीन के एक्सॉन 6 से 92 आधार जोड़े हटाने के लिए व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था। मानव CMAH जीन 1 में हटा दिया गया सकारात्मक एफ 0 </ उप> -मिस (2 व्यक्तियों) जंगली प्रकार की चूहों के साथ पार करने के लिए हेरोर्टोजीजी एफ 1- मिस प्राप्त करने के लिए। विषुववृत्त एफ 1- माइस (5 व्यक्तियों) को पार करने के बाद, होमोजीजस सीमाह दस्तक-आउट एफ 2 -इसका सफलतापूर्वक प्राप्त किया जा सकता है (3 व्यक्तियों)
  2. एक व्यावसायिक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग करते हुए जांगला 21 द्वारा दिखाए गए तरीके के अनुसार जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके चूहों का जीनोटाइपिंग करना।
    1. वाणिज्यिक डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमर जोड़ी 5'गैगग्क्टकागटक्टगटतगा 3 'और 5'टीटाएटगटसीसीसीजीजीटीगगागा 3' का उपयोग कर सीएमए जीन के संबंधित डीएनए टुकड़ा को बढ़ाएं। 40 सी के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण से मिलकर 34 पीसीआर चक्र का उपयोग करते हुए जीन प्रवर्धन, 40 एस के लिए 63 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 72 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट तक बढ़ाएं।
    2. 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पादों को कल्पना। किसी को जंगली प्रकार के व्यक्ति के लिए एकल बैंड (0.5 केबी) का निरीक्षण करना चाहिए, एक डबल बैंड (0.4 और 0.5 केबी)हेटोरोजिगेस दस्तक आउट व्यक्ति, और एकल बैंड (0.4 केबी) homozygous दस्तक आउट व्यक्ति के लिए

2. नमूना संग्रह

  1. Willingham et al द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके माउस का दूध लीजिए 22
  2. गोंसालव्स एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके माउस लीवर ऊतक लीजिए 23 और नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें

3. दूध से सियालिक एसिड का अलगाव

  1. डिस्टिल्ड एच 2 ओ के 88 एमएल में 12 एमएल ग्लैशीय एसिटिक एसिड जोड़कर 2 एम एसिटिक एसिड समाधान के 100 एमएल तैयार करें।
  2. 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 50 μL दूध हस्तांतरण करें और तैयार एसिटिक एसिटिक एसिड समाधान के 1.2 एमएल जोड़ें।
  3. 80 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए निलंबन सेते हैं और नमूने को 10 मिनट के लिए 14,000 xg में अपकेंद्रित करें
  4. सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष 1,000 μL को एक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और रीम में स्थानांतरित करेंसुखाने को पूरा करने के लिए कमरे के तापमान पर केन्द्रापसारक वाष्पीकरण द्वारा विलायक का आविष्कार (संलग्न वैक्यूम पंप के आधार पर यह 4-20 घंटे लग जाएगा)। डिस्टिल्ड एच 2 ओ के 500 μL में नमूना को फिर से भंग कर दें
  5. सूक्ष्म-आयन विनिमय कॉलम तैयार करें। यह कदम विशेष रूप से एनोनिक यौगिकों को समृद्ध करेगा और दूध और यकृत के नमूने से cationic और तटस्थ यौगिकों को हटा देगा, और इसलिए sialic एसिड डेरिवेटिशन के लिए फ्लोरायोजेनिक ओपीडी लेबलिंग एजेंट की चयनात्मकता को बढ़ाता है।
    1. प्रत्येक नमूना के लिए 200 मिलीग्राम आयनों विनिमय राल (Dowex 1X8) के लिए एक खाली स्टॉपकॉक के साथ रिक्त 3 एमएल स्तंभ ट्यूबों में स्थानांतरण करें।
    2. एसीटेट आयनों के साथ राल में क्लोराइड आयनों को बदलने के लिए चरण 3.1 में तैयार जलीय एसिटिक एसिड समाधान के 2 एमएल जोड़ें। जैसे ही विलायक राल के ऊपर पहुंचता है, स्टॉपकॉक को बंद करें।
    3. धीरे से 2 एमएल का डिस्टिल्ड एच 2 ओ जोड़ें, स्टॉपकॉक खोलें और विलायक तक पहुंचने के साथ-साथ प्रवाह को रोकेंराल के ऊपर सुनिश्चित करें कि राल हमेशा विलायक के साथ कवर किया जाता है।
    4. अतिरिक्त एसीटेट निकालने के लिए 2 एमएल के डिस्टिल्ड एच 2 ओ के साथ राल कॉलम दो बार धो लें।
  6. चरण 3.4 से नमूना विलायक के परिणामस्वरूप 500 μL स्थानांतरण। राल कॉलम पर और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। धीरे से राल को 2 एमएल के डिस्टिल्ड एच 2 ओ के साथ धो लें। 50 एमएम अमोनियम एसीटेट समाधान का 1 एमएल का इस्तेमाल करके राल से नमूनों को एलीट करें (386 मिलीग्राम अमोनियम एसीटेट 100 एमएल का डिस्टिल्ड एच 2 ओ में भंग कर) 1.5 मिलीलीटर में अपकेंद्रित्र ट्यूब सुखाने के लिए कमरे के तापमान पर केन्द्रापसारक वाष्पीकरण द्वारा विलायक निकालें।
    नोट: सूखी नमूने को 12 महीने तक 4-6 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. लिवर टिश्यू से सियालिक एसिड का अलगाव

  1. 20 से 50 मिलीग्राम माउस लीवर को धीरे से पिघलना और उसे ड्यूस ऊतक की चक्की (1 एमएल या 2 एमएल की मात्रा) में स्थानांतरित करें। जलीय एसिटिक एसिड समाधान के 1.2 एमएल जोड़ेंचरण 3.1 में तैयार किया गया और 10 एस के लिए कोमल बाल काटना द्वारा ऊतक को होमोजेनिक बनाना। एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप निलंबन स्थानांतरण।
  2. 3.3 चरणों का पालन करें 3.6 के लिए
    नोट: सूखी नमूने को 12 महीने तक 4-6 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. मिश्रित सियालिक एसिड मानक की तैयारी

  1. 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में विश्लेषणात्मक संतुलन पर 5-8 एमजी का एन-एसीटाइलेनेमिनिक एसिड के बीच वजन करें। सटीक वजन नोट करें और हर मिलीग्राम के लिए डिस्टिल्ड एच 2 ओ के 164 μL जोड़ें ( अर्थात अगर Neu5Ac का वजन 7.2 मिलीग्राम है तो 7.2 x 164 = 1, आसुत एच 2 हे के 181 μL जोड़ें)। इसके परिणामस्वरूप 20 एमएम Neu5Ac स्टॉक समाधान होता है जिसे -20 डिग्री सेल्सियस तक 12 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. छोटी मात्रा में एन-ग्लाइकोलिनेरमिनिक एसिड प्राप्त करें, जैसे कि 1 मिलीग्राम aliquots में एक मध्यम कीमत पर। ~ 20 मिमी Neu5Gc स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए सीधे यौगिक के लिए 154 μL आसुत एच 2 ऑउंस जोड़ें। स्थानांतरणएक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में समाधान यह समाधान -20 डिग्री सेल्सियस तक 12 महीनों तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. चरण 5 और 5.2 से प्रत्येक स्टॉक समाधान से 5 μL को एक ताजा 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिलाएं और कमरे के तापमान पर सूखापन के लिए केन्द्रापसारक वाष्पीकरण द्वारा विलायक को हटा दें।
    नोट: मिश्रित सियालिक एसिड मानक को 4 से 6 महीने तक 12 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।

6. सियालिक एसिड के प्रतिदीप्ति व्युत्पत्तिकरण

  1. ओपीडी समाधान के 10 एमएल तैयार करें, 100 मिलीग्राम ओ-फेनिलेनेयमैन और 208 मिलीग्राम सोडियम हाइड्रोजन सल्फाइट 10 एमएल के डिस्टिल्ड एच 2 ओ में तैयार करें।
  2. माउस दूध (चरण 3), माउस जिगर (चरण 4), या मिश्रित सियालिक एसिड मानक (चरण 5) से प्राप्त किए गए सियालिक एसिड नमूनों के 20 μL ओपीडी समाधान जोड़ें। भंवर 30 सांस के लिए सख्ती से और 4 घंटे के लिए नमूने से 80 डिग्री सेल्सियस अंधेरे में ( यानी एल्यूमीनियम पन्नी में माइक्रोट्यूब लपेटें)।
  3. नमूने 5 मिनट के लिए शांत हो जाएं, 80 μ जोड़ें; डिस्टिल्ड एच 2 हे के एल और 1 मिनट के लिए 14,000 xg पर ट्यूबों को अपकेंद्रित करें
  4. सतह पर तैरने वाले से 80 μL को 300 μL उच्च वसूली एचपीएलसी शीशी में स्थानांतरित करें। व्युत्पन्न सियालिक एसिड के नमूनों को 4 से 6 डिग्री सेल्सियस तक एक सप्ताह तक रखा जा सकता है।

7. सियालिक एसिड डेरिवेटिव के एचपीएलसी विश्लेषण

  1. एक ऑनलाइन प्रतिदीप्ति डिटेक्टर से जुड़े एक मानक एचपीएलसी सिस्टम के उपयोग के नमूने का विश्लेषण करें।
  2. विश्लेषण के लिए 250 मिमी की लंबाई और 4.6 मिमी व्यास के मानक आयाम के साथ एक उलट चरण C18 स्तंभ का उपयोग करें।
  3. 800 एमएल एलसीएमएस-ग्रेड पानी (एलसीएमएस - तरल क्रोमैटोग्राफी जन-स्पेक्ट्रोमेट्री) के साथ 200 एमएल के स्टॉक समाधान को कम करके विलायक ए तैयार करें। शेयर समाधान स्वयं निम्नानुसार तैयार किया जा सकता है:
    1. 46 ग्राम फॉर्मिक एसिड को 800 एमएल एलसीएमएस-ग्रेड एच 2 ओ में जोड़ें
    2. अमोनियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (पीआरआईएस) को जोड़कर 4.5 से पीएच को समायोजित करें।
    3. एक को विलायक स्थानांतरित करेंसिलेंडर को मापने और एलसीएमएस-ग्रेड एच 2 ओ के साथ 1000 एमएल तक भरें। यह स्टॉक समाधान 4 से 6 महीने तक 3 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. विलायक बी के लिए, एलसीएमएस-ग्रेड एसिटोनिट्रीले का उपयोग करें।
  5. सैलीक एसिड डेरिवेटिव्स को 1 एमएल / मिन फ्लो रेट पर अलग करें, जिससे निम्न ढाल का अभाव होता है:
    1. विलायक ए के लिए विलायक बी के 10% जोड़कर शुरू करें
    2. 0 मिनट से 15 मिनट तक, धीरे-धीरे विलायक बी के अनुपात को एक रेखीय ढाल के साथ 60% तक बढ़ा दें।
    3. 15 मिनट से 16 मिनट तक, विलायक बी के अनुपात में रैखिक ढाल के साथ 60% से 90% तक बढ़ जाती है। यह एचपीएलसी कॉलम धोने की शुरुआत करता है
    4. एचपीएलसी स्तंभ को आगे धोने के लिए, विलायक बी के स्तर को 16 मिनट और 18 मिनट के बीच 90% से कम रखने के लिए धीरे-धीरे विलायक बी के स्तर को फिर से 18 मिनट और 1 9 मिनट के बीच 10% तक कम करें।
    5. 1 9 से 24 मिनट के बीच 10% बी की प्रारंभिक स्थितियों में एचपीएलसी स्तंभ को फिर से संतुलित करना।
  6. मेंएचपीएलसी प्रणाली में नमूने के 50 μL का पता लगाएं।
  7. 373/448 एनएम के प्रतिदीप्ति डिटेक्टर उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करके एलिवर्स मॉनिटर करें और डेयरीमैटाइज्ड सियालिक एसिड को 9 मिनट (Neu5Gc-OPD के लिए) और 10 मिनट (Neu5Ac-OPD के लिए) के अनुमानित प्रतिधारण समय पर अनुमानित किया जा सकता है।
  8. Neu5Ac (ए Neu5Ac) और Neu5Gc (ए Neu5Gc) के रूप में की प्रतिदीप्ति शिखर क्षेत्रों से Neu5Gc (एफ Neu5Gc) के सापेक्ष राशि की गणना: एफ Neu5Gc [%] = 100 × एक Neu5Gc / (ए Neu5Ac + A Neu5Gc)। समयुग्मक Cmah नॉक-आउट माउस से दूध और जिगर नमूने के मामले में एफ Neu5Gc जबकि विषमयुग्मजी और जंगली प्रकार चूहों के एफ Neu5Gc के लिए मूल्यों माउस उम्र और (2% के बीच ऊतक प्रकार के आधार पर व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, 0% होना चाहिए और> 90%) अपेक्षित त्रुटि मार्जिन के साथ ± 12%

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Representative Results

वर्णित विश्लेषण पद्धति का एक योजनाबद्ध अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है और इसमें जंगली प्रकार के दूध और यकृत के नमूनों और सीएमए दस्तक-आउट उत्परिवर्ती चूहों से सियालिक एसिड का अलगाव और इन घटकों के प्रतिदीप्ति व्युत्पत्तिकरण और एचपीएलसी विश्लेषण शामिल हैं। चित्रा 2 और चित्रा 3 , समलैंगिक और यकृत नमूनों के डेरिवेटेड सियासीक एसिड के प्रतिनिधि एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम का वर्णन करें- और हेटोरोजिग्सर नाक आउट सीमाह चूहों (- / - और +/-) और जंगली प्रकार की चूहों। चित्रा 4 एचपीएलसी पीक क्षेत्रों से गणना किए गए विश्लेषण किए गए माउस नमूनों के एन-ग्लाइकोलाइनेमिनिक एसिड (Neu5Gc) की प्राप्त की गई मात्रा में प्राप्त की गई मात्रा को दर्शाता है।

आकृति 1
आकृति Ng class = "xfig"> 1 : माउस-व्युत्पन्न मिल्क और लीवर नमूने से शाही एसिड के लिए वर्णित विश्लेषण पद्धति का संक्षिप्त विवरण। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2 : एचपीएलसी क्रोमेट्रोग्राम ऑफ फ्लूरोसेन्स लैबैड सियालिक एसिड्स ऑफ़ होक्लो- और हेटोरोज़जीस नॉक-आउट सीमाह चूहों (- / - और +/-) और वाइल्ड-टाइप माइस से प्राप्त दूध नमूनों से। शीर्ष क्रोमैटोग्राम मिश्रित sialic एसिड मानक है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 3 : एचपीएलसी क्रोमेट्रोग्राम ऑफ फ्लूरोसेन्स लैबैड सियालिक एसिड, जो लीवर नमूने से होमो- और हेटोरोजिगेस नॉक-आउट सीएमएएच माईस (- / - और +/-) और वाइल्ड टाइप माइस से प्राप्त किया गया है। शीर्ष क्रोमैटोग्राम मिश्रित sialic एसिड मानक है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : एचपीएलसी पीक क्षेत्रों से परिकलित विश्लेषण किए गए माउस नमूने के एन-ग्लाइकोलाइनेमिनिक एसिड (Neu5Gc) की रिलेटिव राशियाँ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने नीयू 5 जीसी के दूध और यकृत के नमूनों की सापेक्ष मात्रा का विश्लेषण और मात्रा बढ़ाकर homozygous Cmah दस्तक आउट चूहों के फेनोटाइपिकल मूल्यांकन की अनुमति दी है। विश्लेषण प्रतिदीप्ति पहचान के साथ एक मानक एचपीएलसी सेटअप का उपयोग कर किया गया था। इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण चरण आयनों विनिमय कॉलम की तैयारी है और आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी का प्रदर्शन करना है; राल ठीक से व्यवस्थित करने के लिए और सही धुलाई और छुटकारा अंश को लेने के लिए कुछ अभ्यास लेता है

वैकल्पिक रूप से, यहां व्युत्पन्न एजेंट ओपीडी इस्तेमाल किया जा सकता है और इसे आसानी से अधिक महंगी डेरिवेटाइजिंग एजेंट डीएमबी (1,2-हिरिनो -4,5-मेथिलएंडेक्सिबेंजेन) से बदल दिया जा सकता है। इसके अलावा, कदम 6.5 से प्राप्त सियालिक एसिड डेरिवेटिव के विश्लेषण। प्रतिदीप्ति का पता लगाने के बजाय द्रव्यमान-स्पेक्ट्रोमेट्रिक पहचान का उपयोग करके भी विश्लेषण किया जा सकता है ( यानी शिमादज़ू नेक्सरा यूपीएलसी प्रणाली एमएस -2020 डिटेक्टर के साथ मिलकर) ए7.2 - 7.6 उपायों को लागू करने के लिए, सैसिलिक एसिड डेरिवेटिव्स को 382.0 और 3 9 8.0 के एम / जी अनुपात के लिए सकारात्मक आयनीकरण मोड स्कैनिंग का उपयोग किया जाता है (ये क्रमशः Neu5Ac-OPD और Neu5Gc-OPD के एच + हैं)।

इस पद्धति की एक सीमा यह है कि Neu5Gc सामग्री केवल Neu5Ac राशि के सापेक्ष मात्रा निर्धारित की जा सकती है, लेकिन एक पूर्ण रूप से नहीं। ऐसा करने के लिए, नमूना तैयार करने के प्रारंभिक चरण में आंतरिक मानक के रूप में एक विशिष्ट और मात्रात्मक सिलिक एसिड की आवश्यकता होगी। एक और कमी यह है कि केवल homozygous है, लेकिन नहीं हैटेरॉजीजीस सीएमहॉक दस्तक आउट चूहों को स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है, क्योंकि Neu5Gc हेटरोजिग्सर नाक आउट चूहों की सापेक्ष मात्रा अलग-अलग नमूने प्रकार ( यानी ऊतक) और व्यक्तिगत चूहों की उम्र के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस पद्धति के भविष्य के विकास में आंतरिक मानकों को शामिल किया जा सकता है और चूहों में सियालिक एसिड का पूर्ण मात्रा का ठहराव शामिल हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31471703, ए 0010300537 और 31671854 जेवी और एलएलएल), और 100 विदेशी प्रतिभा योजना (जेवी को अनुदान संख्या जेएसबी2014012) द्वारा भाग में समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid Sigma A0812
N-glycolylneuraminic acid Sigma 50644 1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine Sigma 694975
Sodium hydrogen sulfite J&K Scientific Ltd 75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes Supelco Sigma 57024 empty solid phase extraction columns
Luer stopcock Sigma S7396 to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8 Dow Chemicals Sigma 44340 200 - 400 mesh
Dounce tissue grinder Sigma D8938 tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial Agilent Technologies #5188-2788
HPLC System Shimadzu Nexera
Fluorescence Detector for HPLC Shimadzu RF-20Axs
HPLC Column Phenomenex Hyperclone ODS 250 x 4.6 mm
LCMS-grade H2O Merck Millipore #WX00011
LCMS-grade Acetonitrile Merck Millipore #100029 Hypergrade
Ammonium hydroxide solution Fluka #44273 puriss. P.a.

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References

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
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जंगली प्रकार के जिगर और दूध नमूनों में शाही एसिड का निर्धारण<em&gt; CMAH</em&gt; दस्तक आउट चूहों
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