Summary
我々は、マウス肝臓および牛乳中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の定量のためのHPLCベースの方法を記載する。
Abstract
CMAH（シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ）は、哺乳動物におけるシチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸の酸化を担う。しかしながら、ヒトは、 CMAH遺伝子の一次エクソン欠失のために、シチジンモノホスフェート-N-アセチルノイラミン酸をシチジンモノホスフェート-N-グリコリルノイラミン酸に酸化することができない。 CMAH活性の欠如の影響および影響をより詳細に理解するために、マウスにおけるCmahノックアウトモデルは、基礎および応用研究に非常に興味深い。このマウスモデルの表現型を決定するための分析方法は、本明細書中に詳細に記載されており、野生型およびCmahノックアウトマウスの肝臓および乳汁中のN-アセチルノイラミン酸およびN-グリコリルウラミン酸の両方の検出に基づく。内因性シアル酸は、放出され、o-フェニレンジアミンで誘導体化されて蛍光発生誘導体を生成し、その後、HPLCによって分析することができる。提示されたプロトコルは、様々な他の起源の乳および組織サンプルの分析にも適用され、N-グリコリルノイラミン酸の栄養および健康への影響を調査するのに有用である可能性がある。
Introduction
N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）は、ほとんどの哺乳動物において最も一般的なシアル酸である1 。内因性のNeu5Acを合成することができるが、人間が原因CMP-Neu5Acをヒドロキシラーゼ2、3 CMAHをコードする遺伝子上の主要エクソン欠失へのNeu5Gcを産生することができません。しかし、動物性食品は、抗のNeu5Gc抗体の産生につながるのNeu5Gc 4、5、6の栄養源となり、したがってのNeu5Gc 7に対する免疫応答を誘発することができます。 Neu5Gcこの食物効果は、慢性炎症および種々の他の疾患8、9、10に寄与することが疑われます。 hでのNeu5Gcの効果を包括的に理解するために食品由来のシアル酸の影響を体系的に研究するための動物モデルが非常に望ましい。ノックアウトマウスの解析のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくプロトコールは十分に確立されており、遺伝子型評価のための簡便な方法であるが、代謝レベルでの表現型の機能解析にはより特異的な分析方法が必要である。 Cmahノックアウトマウスモデルの表現型は、肝臓または乳試料中のシアル酸の組成物を単離および分析することによって評価することができる。シアル酸をレゾルシノール11またはチオバルビツール酸12と反応させると、発色団生成物が形成され、プレートリーダベースの設定を用いて簡単に分析することができるが、シアル酸のみを分析することができる酸含量を決定することができる。あるいは、シアル酸の分析は、ガスクロマトグラフィー13 、MALDI-ToF質量分析14または電流測定法15 。しかし、最も一般的に適用されるシアル酸分析方法は、加水分解放出に基づく蛍光誘導体化およびその後の高速液体クロマトグラフィー16、17、18が続きます。
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Protocol
動物被験者に関する手順は、SPFに収容された動物を用いて、実験的動物福祉に関する国家ガイドライン（科学技術省、中国、2006年）に従って、南京農業大学の実験動物センターの倫理委員会によって承認されている施設（許可ID：SYXK-J-2011-0037）。
1. Cmahノックアウトマウスモデル
- 揚州大学（中国）の比較医学センターの野生型C57Bl / 6マウスを使用する。
注：CMAHノックアウトマウスもあるCMAH遺伝子のエクソン6から92個の塩基対を除去することによって商業的にCRISPR / Cas9 20ストラテジーを使用して前CMAHノックアウト研究17、19及び得られたのから提供された情報に基づいて生成されましたヒトCMAH遺伝子で欠失している19 。正のF 0 </サブ> -mice（2人）は、ヘテロ接合F 1 -miceを得るために、野生型マウスと交配しました。ヘテロ接合F 1 -mice（5個体）と交差した後、ホモ接合CMAHノックアウトF 2 -mice正常（3個体）を得ることができました。 - 市販のDNA精製キットを用いて、Zangala 21で示される方法に従ってゲノムDNAを用いてマウスの遺伝子型決定を行う。
- 市販のDNAポリメラーゼおよびプライマー対5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'および5'tttaaagtcccgggtgagaagc3'を用いて、 Cmah遺伝子の対応するDNA断片を増幅する。 94℃で40秒間の変性、63℃で40秒間のアニーリング、72℃で1分間の伸長からなる34回のPCRサイクルを用いて遺伝子増幅を行う。
- PCR産物を1％アガロースゲルで視覚化する。野生型個体については単一のバンド（0.5kb）を、野生型個体については二重バンド（0.4および0.5kb）を観察すべきである。ヘテロ接合性ノックアウト個体、およびホモ接合性ノックアウト個体の単一バンド（0.4kb）を含む。
2.サンプル収集
- Willingham らによって記載されたプロトコルを用いてマウスミルクを収集する。 22 。
- ゴンザレス（Gonçalves） らによって記載されたプロトコールを用いてマウス肝臓組織を収集する。 -80℃で23や店舗サンプル。
ミルクからのシアル酸の単離
- 蒸留H 2 Oの88ミリリットルに氷酢酸12ミリリットルを添加することにより、2 M酢酸溶液100mLを調製
- ミルク50μLを1.5 mL遠心チューブに移し、調製した酢酸水溶液1.2 mLを加えます。
- 懸濁液を80℃で4時間インキュベートし、14,000 xgで10分間遠心する。
- 上清のトップ1,000μLを新鮮な1.5mL遠心分離管に移し、rem室温で遠心蒸発によって溶媒を除去して乾燥させる（付着した真空ポンプに応じて、これは4〜20時間かかる）。蒸留H 2 Oの500μlのサンプルを再溶解
- マイクロ陰イオン交換カラムを準備する。この工程は、アニオン性化合物を特異的に富化し、カゼインおよび中性化合物をミルクおよび肝臓サンプルから除去し、したがってシアル酸誘導体化のための蛍光発生OPD標識剤の選択性を増加させる。
- 陰イオン交換樹脂（Dowex 1X8）200 mgを空の3 mLカラムチューブに移して、それぞれのサンプルを移します。
- ステップ3.1で調製した2mLの酢酸水溶液を加えて、樹脂中の塩化物イオンを酢酸イオンで置換する。溶剤が樹脂の上部に達するとすぐに、コックを閉じます。
- 優しく、蒸留H 2 Oの2 mLを加えストップコックを開いて、すぐに溶媒に達するの最もとして流れを止めます樹脂の頂部。樹脂が常に溶媒で覆われていることを確認してください。
- 過剰の酢酸を除去するための蒸留H 2 O 2mLで樹脂カラムを2回洗浄します。
- ステップ3.4のサンプル溶媒を500μL移します。樹脂カラム上に流し、フロースルーを廃棄する。穏やか1.5mLの中に50mMの酢酸アンモニウム溶液（蒸留H 2 O 100mLに溶解し、酢酸アンモニウムの386 mg）を1mLのを用いて蒸留H 2 Oで溶出2mLで樹脂からサンプルアニオンを樹脂を洗浄遠心チューブ。室温で遠心蒸発によって溶媒を除去して乾燥させる。
注：乾燥サンプルは、4〜6℃で12ヶ月まで保存できます。
肝臓組織からのシアル酸の単離
- マウス肝臓20〜50 mgを静かに解凍し、Dounce組織粉砕機（1 mLまたは2 mLの容量）に移します。 1.2mLの酢酸水溶液ステップ3.1で調製し、10秒間穏やかに剪断することによって組織をホモジナイズする。得られた懸濁液を1.5mLの遠心管に移す。
- ステップ3.3に従ってください。 3.6まで。
注：乾燥サンプルは、4〜6℃で12ヶ月まで保存できます。
5.混合シアル酸標準液の調製
- 分析用天秤に5〜8mgのN-アセチルノイラミン酸を1.5mL遠心分離管に量り入れる。正確な重量に注意し、各mgについて164μLの蒸留H 2 Oを加える（ すなわち 、Neu5Acの重量が7.2mgである場合、7.2x164 =1,181μLの蒸留H 2 Oを加える）。この結果、20mM Neu5Acストック溶液が得られ、-20℃で最大12ヶ月保存することができます。
- 1mgアリコートなどの中程度の価格で、より少量のN-グリコリルノイラミン酸を得る。約20mMのNeu5Gcストック溶液を得るために、154μLの蒸留H 2 Oを化合物に直接添加する。転送する1.5mLの遠心チューブに加えた。この溶液は、-20℃で最大12ヶ月間保存することができます。
- ステップ5.1および5.2の各ストック溶液から5μLを新鮮な1.5mL遠心分離チューブに混合し、室温で乾燥させる遠心蒸発によって溶媒を除去する。
注：混合シアル酸標準は、4〜6℃で最大12ヶ月間保存することができます。
シアル酸の蛍光誘導体化
- 100mLのo-フェニレンジアミンおよび208mgの亜硫酸水素ナトリウムからなる10mLのOPD溶液を10mLの蒸留H 2 O中に調製する。
- マウスミルク（ステップ3）、マウス肝臓（ステップ4）、または混合シアル酸標準（ステップ5）に由来するシアル酸サンプルに20μLのOPD溶液を加える。 30秒間激しくボルテックスし、サンプルを暗所で80℃で4時間インキュベートする（ すなわち 、マイクロチューブをアルミニウム箔で包む）。
- サンプルを5分間冷却し、80μ、蒸留H 2 OのL 1分間14,000×gでチューブを遠心分離。
- 上清から80μLを300μL高回収率HPLCバイアルに移す。誘導体化されたシアル酸サンプルは、4〜6℃で最大1週間保存することができます。
シアル酸誘導体のHPLC分析
- オンライン蛍光検出器に接続された標準HPLCシステムを使用してサンプルを分析する。
- 分析には、長さ250mm、直径4.6mmの標準寸法の逆相C18カラムを使用します。
- 200mLのストック溶液を800mLのLCMSグレード水で希釈することにより溶媒Aを調製する（LCMS-液体クロマトグラフィー質量分析法）。原液自体は以下のように調製することができる：
- 46gのギ酸を800mLのLCMSグレードのH 2 Oに加える。
- 水酸化アンモニウム溶液（puriss.pa）を滴下してpHを4.5に調整する。
- 溶媒をLCMSグレードのH 2 Oで1,000mLまで充填してください。このストック溶液は、4〜6℃で3ヶ月まで保存できます。
- 溶媒Bについては、LCMS級アセトニトリルを使用します。
- 次の勾配溶離を用いて1mL /分の流速でシアル酸誘導体を分離する：
- まず溶剤Aに混合した溶剤Bを10％加える。
- 0分から15分まで、直線勾配で60％まで溶媒Bの割合を徐々に増加させる。
- 15分から16分まで、溶媒Bの割合を60％から90％の直線勾配で急速に増加させる。これにより、HPLCカラムの洗浄が開始される。
- HPLCカラムをさらに洗浄するには、溶媒Bのレベルを16分〜18分の間に90％に保ち、その後溶媒Bのレベルを18分〜19分の間に徐々に10％に徐々に低下させる。
- HPLCカラムを19〜24分の10％Bの開始条件に再平衡させる。
- に50μLのサンプルをHPLCシステムに注入する。
- 373 / 488nmの蛍光検出器励起/発光波長を用いて溶離液をモニターし、誘導体化されたシアル酸は、約9分（Neu5Gc-OPDについて）および10分（Neu5Ac-OPDについて）の予想保持時間で期待することができる。
- F Neu5Gc [％] = 100×A Neu5Gc /（A Neu5Ac + A Neu5Gc ）のように、Neu5Ac（A Neu5Ac ）およびNeu5Gc（A Neu5Gc ）の蛍光ピーク面積からのNeu5Gc（F Neu5Gc ）の相対量を計算する。ヘテロ接合性及び野生型マウスのF のNeu5Gcの値はマウスの年齢と2％の間の組織のタイプ（に応じて広範囲に変化し得るのに対し、ホモ接合CMAHノックアウトマウスからミルクおよび肝臓のサンプルの場合にはF のNeu5Gcは 、0％であるべきですおよび> 90％）、予測誤差マージンは±12％です。
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Representative Results
記載された分析方法の概略図は図1に示されており、野生型およびCmahノックアウト突然変異体マウスの乳および肝臓サンプルからのシアル酸の単離およびこれらの成分の蛍光誘導体化およびHPLC分析が含まれる。 図2および図3は、ホモおよびヘテロ接合ノックアウトCmahマウス（ - / - および+/-）および野生型マウス由来の乳および肝臓試料の誘導体化シアル酸の代表的なHPLCクロマトグラムを示す。 図4は、HPLCピーク面積から計算した分析マウス試料のN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）の相対量を示す。
図
図2 ： ホモおよびヘテロ接合性ノックアウトCmahマウス（ - / - および+/-）および野生型マウス由来の乳サンプルからの蛍光標識シアル酸のHPLCクロマトグラム。上部のクロマトグラムは混合シアル酸標準です。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3 ： ホモおよびヘテロ接合性ノックアウトCmahマウス（ - / - および+/-）および野生型マウス由来の肝臓試料からの蛍光標識シアル酸のHPLCクロマトグラム。上部のクロマトグラムは混合シアル酸標準です。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ： HPLCピーク領域から計算した分析マウスサンプルのN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）の相対量。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に提示されたプロトコールは、乳及び肝臓試料のNeu5Gcの相対量を分析及び定量することにより、ホモ接合Cmahノックアウトマウスの表現型評価を可能にする。分析は、蛍光検出を伴う標準的なHPLC設定を用いて行った。この手順の最も重要なステップは、陰イオン交換カラムの調製および陰イオン交換クロマトグラフィーの実施である。樹脂を適切に沈殿させ、適切な洗浄および溶出画分を集めることは、少しの練習を要する。
あるいは、本明細書で使用する誘導体化剤OPDは、より高価な誘導体化剤DMB（1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシベンゼン）で容易に置換することができる。さらに、得られたシアル酸誘導体を工程6.5から分析した。蛍光検出（ すなわち 、MS-2020検出器と結合したShimadzu Nexera UPLCシステム）の代わりに質量分析検出を用いて分析することもできる。 Aステップ7.2-7.6を適用すると、382.0および398.0のm / z比（これらはそれぞれ、Neu5Ac-OPDおよびNeu5Gc-OPDのH + -付加物である）の正イオン化モード走査を用いてシアル酸誘導体を直接検出する。
この方法の1つの限界は、Neu5Gc含量がNeu5Ac量に対してのみ定量化されるが、絶対的には定量化されないことである。そのためには、試料調製の初期段階で、内部標準として明確で定量可能なシアル酸を添加する必要があります。別の欠点は、Neu5Gcヘテロ接合ノックアウトマウスの相対的な量が、個々のマウスの試料の種類（ すなわち組織）および年齢に依存して強く変化し得ることから、ホモ接合であるがヘテロ接合のCmahノックアウトマウスのみが明白に同定され得ることである。この方法の今後の発展には、内部標準の添加およびマウスにおけるシアル酸の絶対定量化が含まれ得る。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、中国の自然科学財団（助成金番号31471703、A0201300537および31671854、JVおよびLL）および100の外国人才能計画（助成番号JSB2014012からJV）によって部分的に支持された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
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