Summary
네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용의 생화학 적 분석에 광범위하게 사용 되어온 분자 생물학의 기본 도구입니다. 이러한 상호 작용은 전통적으로 두 개의 유리판 사이에 생성 된 폴리 아크릴 아미드 젤과 수직으로 전기 영동 된 샘플로 분석되었습니다. 그러나, 폴리 아크릴 아미드 겔은 트레이에 캐스팅되고 수평으로 전기 영동 됨으로써 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어, 형광 RNA 기질과 특정 단백질 사이의 복합체를 분석하는 데 사용되는 수평 젤은 전기 영동이 진행됨에 따라 여러 번 이미지화 될 수 있습니다. 이것은 실험 중 여러 지점에서 RNA- 단백질 복합체를 모니터 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한, 수평 겔 전기 영동으로 많은 샘플을 동시에 분석 할 수 있습니다. 이것은 시간 경과 실험을 용이하게 할뿐만 아니라 여러 반응을 동시에 분석하여 여러 구성 요소와 조건을 비교할 수 있습니다. 여기에 우리가 홍보RNA-Protein 상호 작용을 분석하기 위해 수평 고유 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs)는 특정 단백질 - 핵산 상호 작용을 분석하는 귀중한 생화학 도구임이 입증되었습니다 1 , 2 , 3 . 이 분석법은 핵산 - 단백질 복합체 1 의 구성 화학 양롞 인 RNA 또는 DNA 3 에 대한 단백질의 결합 친 화성에 관한 중요한 정보를 제공하며 기질 경쟁 실험 1을 통해 RNA 결합 단백질의 결합 특이성에 대한 중요한 새로운 통찰력을 제공합니다 1 .
이 assays에 대한 전통적인 실험 설정은 정제 단백질과 방사성 표지 RNA 기판을 혼합하는 것으로 구성됩니다. 얻어진 복합체는 다음과 비 변성 분석 (네이티브) 폴리 아크릴 아미드 겔은 수직 장치 (3)에 시료 전기 영동 개의 유리판 사이에 붓고. 이 접근법은 핵산에 대한 단백질 결합의 기초가되는 생화학 적 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공하기 위해 철저하게 사용되었지만 몇 가지 한계점이 있습니다. 예를 들어,이 기본 전략은 상대적으로 처리량이 낮으며 여러 바인딩 반응을 병렬로 분석해야하는 응용 프로그램에는 쉽게 적용 할 수 없습니다. 또한 전통적인 수직 장치의 경우 전기 영동 중 여러 번 복합체를 모니터링하는 것이 어렵습니다 3 , 4 .
여기에서는 평판 장치, 수평 전기 영동 및 형광 표지 된 RNA 기질 4 , 5 , 6 , 7에 주조 된 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 사용하는 EMSA 분석의 적용을 제시합니다. 기본 스트레인에 대한 이러한 비교적 간단한 변형의 결합tegy는 몇 가지 강력한 이점을 제공합니다. 특히 수평 플랫 베드 형식은 수십 개의 샘플을 동시에 분석하는 데 적합합니다 4 . 또한, Bicaudal-C 단백질과 RNA 기판 사이에 형성된 RNA- 단백질 복합체 (예 : 수평 겔에서 전기 영동)는 서로 다른 RNA- 단백질 복합체를 분해하고 이들을 미 결합 RNA 기질과 구별하는 능력이 향상되었습니다.
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Protocol
1. 수평 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔의 제조 4 .
- 필요한 재료 준비.
- 수평 겔 장치의 경우 27cm x 21cm 쟁반이있는 젤 상자 (37cm x 24cm)와 2 개의 24 웰 빗용 용량을 사용하십시오. 이 설정은 동시에 분석 할 수있는 총 48 개의 샘플을 제공합니다.
- 40 % Acrylamide-Bis 19 : 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8.0), TEMED 및 10 % APS (ammonium persulfate) 시약을 준비하십시오.
- 10 % 천연 아크릴 아마이드 젤 생성.
- 500 mL 플라스크에 5 x TBE 80 mL, 40 % 아크릴 아미드 100 mL 및 물을 넣어 최종 부피 400 mL로 만든다.
- 10 % APS 4 ML 및 TEMED 400 μL를 추가합니다. 잘 섞다.
- 수평 주조 트레이에 혼합물을 붓고 겔을 30 분 동안 중합시킵니다. 젤의 두께는 약 2cm입니다.
참고 : 젤은 흄 후드에서 속도를 낼 수 있습니다.업 중합. 중합 반응 후 얇은 액체 층이 겔 위에 남습니다. - 액체를 털어 내고 흐르는 완충액으로 헹구십시오. 조심스럽게 빗 (들)을 제거하고 주사기를 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어.
- 실행 버퍼 준비.
- 겔 상자에 1x TBE 러닝 버퍼 2 L를 준비하십시오. 5XTBE 400 mL를 1600 mL로 희석하여 혼합한다. 차가운 방에 1x TBE 버퍼를 식힌다.
- 젤 사전 가동
- 2L의 차가운 완충액을 젤 박스에 넣고 젤을 넣으십시오.
- 차가운 방에서 4 ° C에서 1 시간 120V에서 겔을 미리 실행하십시오. 이 시간 동안 결합 반응을 준비하십시오.
2. 결합 반응 8
- 2.1. 다음 반응물을 준비하십시오.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM 효모 tRNA
5X 결합 완충액 (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0.2 % Tween-20)
상업적으로 구입 한 100 nM 형광 표지 RNA
농축 된 Bicaudal-C 단백질
DEPC 처리 된 H 2 O에서 50 % 글리세롤
DEPC 처리 된 H 2 O - RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 바인딩 반응 구성 요소를 조립.
- 관에 10 mM BSA 5 μL, 20 mM DTT 5 μL, 10 mM 효모 tRNA 5 μL, 5x Binding Buffer 10 μL를 넣는다.
- 50 μL에서 250 nM의 최종 농도로 단백질을 첨가하십시오. 45 μL의 최종 부피에 물을 넣으십시오.
- 형광으로 표지 된 RNA 기질 5 μL를 첨가한다. 상업적으로 구입 한 3 'fluorescein으로 표지 된 32 개 뉴클레오타이드 기질을 사용하십시오.
- 혼합하고 암실에서 실온에서 30 분 동안 인큐베이션한다.
3. 네이티브 수평 폴리 아크릴 아미드 젤의 샘플 분석
- 각 반응에 15 %의 50 % 글리세롤을 넣고 부드럽게 섞는다.
- Carefu각 반응 30 μL를 젤에 첨가하십시오. 단일 웰에 적재 할 수있는 시료의 양은 겔의 두께와 웰의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 24-well 빗으로 생성 된 겔의 단일 웰에 15 μL와 45 μL의 부피를 적재하고 2 cm 두께로 쏟아 붓습니다.
- 전원 공급 장치를 젤 장치 스위치에 연결 한 후 전압을 조정하십시오. 120 V에서 4 ° C에서 젤을 실행하십시오.
참고 : 수평 겔 장치의 경우, 이는 약 5V / cm가됩니다. 수직 형 겔 장치의 경우, 이것은 16V / cm이다.- 형광 표지 RNA의 손상이나 표백을 방지하려면 어둠 속에서 전기 영동을하십시오.
- 분석되는 RNA- 단백질 복합체의 특성에 따라 전기 영동 시간이 달라질 수 있습니다.
참고 : 수평 EMSA 분석의 가장 큰 장점은 전기 영동을 멈추고 젤 이미지를 찍은 다음 gel은 장치에 다시 놓일 수 있고 전기 영동은 더 오랜 시간 동안 계속 될 수 있습니다.
4. 이미징 젤
- 형광 물질 검출 및 이미징을 위해 설계된 모든 장비로 분석을 수행하십시오.
- 이미 저에 젤을 올려 놓습니다.
- 이미 저 설정을 조정하십시오. fluorescein-labeled RNA ligand의 경우, FAM (파장 473 nm), 750 Photomultiplier voltage (PMT), 100 μm 픽셀 크기의 세팅을 사용하십시오.
- 젤을 스캔하여 이미지를 캡처하십시오.
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Representative Results
수평 네이티브 겔 전기 영동의 능력과 다양성을 입증하기 위해 우리는 Bicc1 결합 부위를 포함하는 형광 표지 된 RNA에 Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) 단백질의 결합을 분석했습니다. Bicc1 단백질 mRNA의 특정 리프레 병진 동물 개발 9, 10, 11, 12의 모체 단계뿐만 아니라 성인 13, 14의 특정 기관의 기능 중 세포 운명 결정을 제어하는 기능을한다. 제노 우리의 작업은 Bicc1 단백질 8 제 결합 부위를 식별 : 32 뉴클레오티드의 mRNA 영역 8, 12 크립토 (Cripto)-1에서의 3'UTR. 이 결합 사이트는 기술의 조합을 사용하여 정의되었습니다 : RNase protect이온 및 발자국 분석, 생체 내 결합 실험 및 시험 관내 EMSA 분석 8 .
정제 된 Xenopus Bicc1 단백질을 형광 표지 된 32 뉴클레오타이드 RNA와 혼합 하였다; 크립토 (Cripto)-1 mRNA의 8에서 Bicc1 결합 부위. 별도의 반응에서 Bicc1 단백질은 cyclin B1 mRNA의 3'UTR에서 유래 된 형광으로 표지 된 32 nucleotide RNA와 혼합되었다. Bicc1은 cyclin B1 mRNA 8 , 12에 결합하지 않으며이 RNA는 음성 대조군 역할을합니다. 각 부분의 절반을 수직 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤 ( 그림 1A )에서 분석하고 다른 부분은 수평 네이티브 젤 ( 그림 1B )을 사용하여 병렬로 분석했습니다. 두 방법 중 하나를 사용하면 Bicc1이 RNA Cripto-1 RNA에 결합하여 특정 복합체 a그것은 cyclin B1 음성 대조군 RNA에 결합하지 않습니다. 그러나, Bicc1-Cripto-1 복합체는 수평 겔로 분석했을 때 유의하게 더 뚜렷합니다. 검출이 용이하고 단백질 RNA 복합체가 결합되지 않은 RNA를 식별 할 수 있습니다. 이미징 후, 겔을 겔 장치에 다시 넣고 추가 3 시간 반 동안 전기 영동 하였다. 겔을 재 이미징 한 후, 복합체는 더 멀리 이동하고 여전히 쉽게 검출 가능하여 안정성을 나타냅니다 ( 그림 1C ). 초기 이미징 후 전기 영동 및 분석을 계속할 수있는 능력은 불가능하지는 않더라도 수직 겔 형식으로는 어려울 것입니다.
그림 1 : Bicc1과 Cripto1 RNA의 결합을 분석하기위한 수직 및 수평 네이티브 젤의 비교. 비스cc1 결합 실험은 32- 뉴클레오타이드 형광 CyclinB1 RNA 음성 대조군 또는 형광 32- 뉴클레오타이드 Cripto1 RNA 양성 대조군을 사용하여 수행 하였다. 각각의 반응은 0 nM 또는 250 nM의 SUMO-Bicc1 N 말단을 포함하고 4 ℃에서 120 V에서 30 분 동안 ( A ) 수직 폴리 아크릴 아미드 본래 겔상에서 또는 수평 polyacrylamide native 겔에서 이중 샘플로 분석 하였다 ( B ) 4 ℃에서 120V에서 2 시간 또는 ( C ) 4 ℃에서 120V에서 5.5 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
네이티브 폴리 아크릴 아마이드 젤은 단백질 -RNA 상호 작용을 조사하는 데 매우 중요한 도구이며 전통적으로이 젤은 수직으로 전기 영동됩니다 2 , 3 . 우리는 생성 된 전기 폴리 아크릴 아마이드 젤을 대체하여 1 , 4 , 6 , 7 , 15로 전기 영동 한 프로토콜을 수정했습니다. 형광으로 표지 된 RNA 기질과 함께 사용 된 이러한 변화는 단백질 -RNA 결합 상호 작용의 생화학 적 분석에 많은 이점을 제공합니다. 이러한 장점은 다음을 포함합니다 : 버퍼를 하부 챔버에서 상부로 이송하는 펌프를 필요로하는 수직 장치와 비교하여 완충액의 혼합이 단순화되고, Lar를 분석하기위한 증가 된 용량을 제공하는 큰 웰로 수평 겔을 생성 할 수 있습니다Ger 시료의 경우, 수평 젤의 전기 영동은 종종 수직 겔에 비해 RNA- 단백질 복합체의 향상된 해상도를 제공하고, 수평 겔 전기 영동은 분석하는 동안 여러 시점에서의 실험을 이미지화하는 능력을 제공합니다.
또 다른 중요한 이점은 가로 형식으로 평행 한 다수의 샘플을 분석하는 능력을 제공하는 웰을 다수 겔을 생성라는 것으로한다는 것이다. 이 기능은 RNA- 단백질 상호 작용 분석을위한 생화학 도구로서의 용도를 크게 확대합니다. 예를 들어, 기능, 경쟁 실험 (15)의 사용을 통해 단백질 RNA 복합체 형성의 정량적 파라미터를 조사 용이 다중 샘플을 분석하는 분석 (15)뿐만 아니라 결합 복합 부품 (15)의 화학 양론을 정의하기위한 실험을 케이한다. 또한,형광 RNA 기판은 단일 반응으로부터 형광 편광 결합 분석과 같은 다중 분석을 수행하고 양적 및 질적 결합 데이터 5 , 15 모두를 얻을 수있게합니다.
수평 젤 셋업에서 최적의 결과를 얻으려면 이미징을위한 컴플렉스의 품질을 향상시키기 위해 조정할 수있는 다양한 매개 변수가 있습니다. 여기에는 겔의 아크릴 아마이드 비율을 변화시켜 단백질 RNA 복합체를 자유 RNA로부터 분리하는 것을보다 쉽게 처리하고 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 크기 때문에 아크릴 아마이드 겔의 비율을 낮게 취급하는 것이 어려울 수 있습니다. 아크릴 아마이드 농도가 7.5 % 이상인 젤을 사용하는 것이 가장 쉽습니다. 또한 필요한 경우 전기 영동 조건을 변경하여 단백질 -RNA 복합체의 안정성을 향상시킬 수 있습니다. 전기 영동 전압 조정, 실온에서 겔 구동 inst4 ° C의 온도에서 프리 런 조건을 조정합니다.
많은 장점에도 불구하고 수평 네이티브 겔 전기 영동 분석의 한계가 있습니다. 예를 들어, 형광 효소 기질을 사용함으로써 그 유용성이 최대화됩니다. 선택된 형광 물질 및 RNA의 크기에 따라 이러한 기질을 얻는 것이 비용이 많이들 수 있습니다. 또한, 수평 겔은 일반적으로 수직 겔보다 훨씬 크기 때문에 폴리 아크릴 아미드 및 DEPC- 처리 된 용액과 같은 더 많은 양의 재료가 필요하다.
수평 기본 겔 전기 영동은 임상 적으로 RNA - 단백질 상호 작용 (16)을 대상으로 화합물을 식별하기 위해 추구 분자 화면에 대한 유효성 검사 도구로 사용할 수있는 잠재력을 가지고있다. 이러한 스크린은 일반적으로 추가 연구를 위해 관련 화합물을 확인하기 위해 용액 생화학 적 분석법을 사용합니다. 수직 포맷과 비교할 때 수평 포맷의 높은 스루풋 잠재력잠재적 후보자의 2 차 검증을위한 도구로서 네이티브 겔 전기 영동을 적용 할 수있는 기회.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 수치를 준비한 Laura Vanderploeg에게 감사드립니다. Sheets 연구소의 연구는 NSF 보조금 1050395 및 NIH 보조금 (R21HD076828)에 의해 지원됩니다. Ryder 연구소의 연구는 NIH 보조금 R01GM117237 및 R01GM117008에서 지원됩니다. Megan Dowdle은 위스콘신 - 매디슨 대학 (University of Wisconsin-Madison) 대학원 및 생명 공학 교육 프로그램을 통해 National Institute of Health (T32GM008349)의 국립 종합 의학 연구소를 통해 SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship의 지원을받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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