Summary
Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.
Abstract
Die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Werkzeug der Molekularbiologie, das ausgiebig für die biochemische Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen verwendet wurde. Diese Wechselwirkungen wurden traditionell mit Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten und Proben hergestellt wurden, die vertikal elektrophoretisch wurden. Allerdings bieten Polyacrylamidgele, die in Tabletts gegossen und horizontal elektrophoresiert werden, mehrere Vorteile. Zum Beispiel können horizontale Gele, die verwendet werden, um Komplexe zwischen fluoreszierenden RNA-Substraten und spezifischen Proteinen zu analysieren, mehrfach abgebildet werden, wenn die Elektrophorese fortschreitet. Dies bietet die einzigartige Möglichkeit, RNA-Protein-Komplexe an mehreren Punkten während des Experiments zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die horizontale Gelelektrophorese, mehrere Proben parallel zu analysieren. Dies erleichtert die zeitlichen Verlaufsexperimente und analysiert gleichzeitig mehrere Reaktionen, um verschiedene Komponenten und Bedingungen miteinander zu vergleichen. Hier sind wir prOvide ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen.
Introduction
Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSAs) haben sich als ein unschätzbares biochemisches Instrument erwiesen, um spezifische Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen 1 , 2 , 3 zu analysieren. Diese Assays können wichtige Informationen in Bezug auf die Bindungsaffinität von Proteinen an RNA oder DNA 3, die Komponente Stöchiometrie von Nukleinsäure-Protein - Komplexe 1 und liefern wichtige neue Erkenntnisse über die Bindungsspezifität der RNA - Bindeproteine via Substrat Kompetitionsexperimente 1.
Der traditionelle experimentelle Aufbau für diese Assays besteht darin, gereinigtes Protein mit einem radioaktiv markierten RNA-Substrat zu mischen. Die resultierenden Komplexe werden dann mit nicht denaturierenden (nativen) Polyacrylamidgelen analysiert, die zwischen zwei Glasplatten gefolgt von einer Probenelektrophorese in einer vertikalen Vorrichtung 3 gegossen werden. Während dieser Ansatz erschöpfend genutzt wurde, um wichtige Einblicke in die biochemischen Mechanismen zu liefern, die der Bindung von Proteinen an Nukleinsäuren zugrunde liegen, hat sie auch mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel hat diese Grundstrategie einen relativ geringen Durchsatz und ist für Anwendungen, die viele analoge Bindungsreaktionen parallel analysieren, nicht leicht anpassbar. Darüber hinaus ist es bei der traditionellen vertikalen Apparatur schwierig, die Komplexe während der Elektrophorese 3 , 4 mehrfach zu überwachen.
Hier stellen wir eine Adaption des EMSA-Assays vor, der native Polyacrylamidgele verwendet, die in eine Flachbettapparatur, horizontale Elektrophorese und fluoreszenzmarkierte RNA-Substrate 4 , 5 , 6 , 7 gegossen werden. Die Einarbeitung dieser relativ einfachen Modifikationen an die Basis-StrTegy bietet einige mächtige Vorteile. Insbesondere das horizontale Flachbettformat eignet sich leicht zur gleichzeitigen Analyse von Dutzenden von Proben 4 . Auch für einige RNA-Proteinkomplexe, wie jene, die zwischen dem Bicaudal-C-Protein und seiner RNA-Substrat-Elektrophorese in einem horizontalen Gel gebildet werden, ergibt sich eine erhöhte Fähigkeit, unterschiedliche RNA-Protein-Komplexe aufzulösen und diese aus dem ungebundenen RNA-Substrat zu unterscheiden.
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Protocol
1. Herstellung des horizontalen nativen Polyacrylamidgels 4 .
- Vorbereitung der benötigten Materialien.
- Für die horizontale Gel-Apparatur verwenden Sie eine Gel-Box (37 cm x 24 cm) mit einem 27 cm x 21 cm Tablett und eine Kapazität für zwei 24-Well-Kämme. Dieses Setup bietet insgesamt 48 Samples, die gleichzeitig analysiert werden können.
- Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor: 40% Acrylamid-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8,0), TEMED und 10% APS (Ammoniumpersulfat).
- Erzeugung eines 10% nativen Acrylamidgels
- In einem 500 ml-Kolben werden 80 ml 5x TBE, 100 ml 40% Acrylamid und Wasser auf ein Endvolumen von 400 ml gegeben.
- Fügen Sie 4 ml 10% APS und 400 μl TEMED hinzu. Gut mischen.
- Gießen Sie die Mischung in die horizontale Gießschale und lassen Sie das Gel für 30 min zu polymerisieren. Das Gel wird etwa 2 cm dick.
HINWEIS: Gele können in eine Dunstabzugshaube werfenUp-Polymerisation. Nach der Polymerisation bleibt eine dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Gel. - Gießen Sie die Flüssigkeit aus und spülen Sie mit Laufpuffer. Entfernen Sie den Kamm (s) sorgfältig und spülen Sie die Brunnen mit Laufpuffer mit einer Spritze.
- Vorbereitung des laufenden Puffers
- Vorbereitung 2 L von 1x TBE Laufpuffer für die Gelbox. 400 ml 5XTBE mit 1600 ml verdünnen und mischen. Legen Sie 1x TBE Puffer in kalten Raum zu kühlen.
- Vorlauf des Gels
- Füge 2 L des kalten Laufpuffers zum Gelkasten hinzu und lege das Gel ein.
- Vorbereiten des Gels bei 120 V für 1 h bei 4 ° C in einem kalten Raum. Während dieser Zeit die Bindungsreaktion vorbereiten.
2. Bindungsreaktion 8
- 2.1.Prepare die folgenden Reaktionskomponenten.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM Hefe-tRNAs
5X Bindungspuffer (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20)
100 nM Fluorescein-markierte RNA, die kommerziell gekauft wurde
Konzentriertes Bicaudal-C-Protein
50% Glycerin in DEPC-behandeltem H 2 O
DEPC-behandeltes H 2 O - Montieren Sie die Bindungsreaktionskomponenten in einem RNase-freien Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zu dem Röhrchen werden 5 & mgr; l 10 mM BSA, 5 & mgr; l 20 mM DTT, 5 & mgr; l 10 mM Hefe-tRNAs, 10 & mgr; l 5x Bindungspuffer gegeben.
- Füge Protein zu einer Endkonzentration von 250 nM in 50 μl hinzu. Füge Wasser zu einem Endvolumen von 45 μl hinzu.
- Füge 5 μl fluoreszenzmarkiertes RNA-Substrat hinzu. Verwenden Sie ein handelsübliches 3'-Fluorescein-markiertes 32-Nukleotidsubstrat.
- Mischen und inkubieren im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur.
3. Analyse der Proben auf dem nativen horizontalen Polyacrylamidgel
- Zu jeder Reaktion werden 15 μl 50% Glycerin gegeben und vorsichtig vermischt.
- PflegeLly addieren 30 & mgr; l jeder Reaktion auf das Gel. Die Menge der Probe, die in eine einzige Vertiefung geladen werden kann, variiert in Abhängigkeit von der Dicke des Gels und der Größe der Vertiefungen. Wir haben Volumina bis zu 15 μl und bis zu 45 μl in eine einzige Bohrung mit einem 24-Well-Kamm geladen und auf eine Dicke von 2 cm gegossen.
- Nach dem Anschließen der Stromversorgung an die Gel-Gerät schalten Sie die Stromversorgung und stellen Sie die Spannung. Führen Sie das Gel in 4 ° C bei 120 V.
HINWEIS: Für die horizontale Gel-Apparatur liegt damit etwa 5 V / cm. Für die vertikale Gelapparatur beträgt das 16 V / cm.- Um eine Beschädigung oder Bleichung der fluoreszenzmarkierten RNA zu verhindern, führen Sie die Elektrophorese im Dunkeln durch.
- Phary-Elektrophorese-Zeiten in Abhängigkeit von den Besonderheiten des zu analysierenden RNA-Protein-Komplexes.
HINWEIS: Ein großer Vorteil der horizontalen EMSA-Analyse ist, dass die Elektrophorese gestoppt werden kann, das Gel abgebildet und dann die geL kann in den Apparat zurückgestellt werden und die Elektrophorese kann für längere Zeit fortgesetzt werden.
4. Imaging der Gel
- Führen Sie die Analyse mit jedem Instrument für die Erkennung und Bildgebung fluoreszierende Substrate.
- Lege das Gel auf den Imager.
- Anpassungseinstellungen einstellen Für Fluorescein-markierte RNA-Liganden verwenden Sie folgende Einstellungen: FAM (Wellenlänge 473 nm), 750 Photovervielfacherspannung (PMT), 100 μm Pixelgröße.
- Scannen Sie das Gel, um das Bild zu erfassen.
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Representative Results
Um die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der horizontalen nativen Gelelektrophorese zu demonstrieren, analysierten wir die Bindung des Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) Proteins an eine fluoreszenzmarkierte RNA, die eine Bicc1-Bindungsstelle enthielt. Bicc1-Proteine fungieren als mRNA-spezifische Translationsrepressoren zur Kontrolle der Zellschicksalentscheidungen während der mütterlichen Stadien der Tierentwicklung 9 , 10 , 11 , 12 sowie der Funktionen spezifischer Organe bei Erwachsenen 13 , 14 . Unsere Arbeit in Xenopus identifizierte die erste Bindungsstelle für ein Bicc1-Protein 8 : eine 32-Nukleotidregion aus dem 3'UTR der Cripto-1-mRNA 8 , 12 . Diese Bindungsstelle wurde mit einer Kombination von Techniken definiert: RNase protectIonen- und Fußabdruck-Assays, in vivo- Bindungsversuche und in vitro- EMSA-Assays 8 .
Das gereinigte Xenopus- Bicc1-Protein wurde mit einer fluoreszenzmarkierten 32-Nucleotid-RNA gemischt; Die Bicc1-Bindungsstelle aus der Cripto-1-mRNA 8 . In einer separaten Reaktion wurde Bicc1-Protein mit einer fluoreszenzmarkierten 32-Nucleotid-RNA, die aus dem 3'-SHR der Cyclin-B1-mRNA stammte, gemischt. Bicc1 bindet nicht an die Cyclin-B1-mRNA 8 , 12 und diese RNA dient als Negativkontrolle. Die Hälfte jeder Reaktion wurde auf einem vertikalen nativen Polyacrylamidgel analysiert ( Fig. 1A ), während der andere Teil parallel unter Verwendung eines horizontalen nativen Gels analysiert wurde ( Fig. 1B ). Es ist leicht ersichtlich, mit beiden Methoden, die Bicc1 an die RNA Cripto-1 RNA bindet und bildet einen spezifischen Komplex aEs bindet nicht die Cyclin B1 Negativkontroll-RNA. Allerdings sind die Bicc1-Cripto-1-Komplexe signifikant deutlicher, wenn sie mit dem horizontalen Gel analysiert werden, wobei beide ihren Nachweis erleichtern und die Diskriminierung von Protein-RNA-Komplexen aus ungebundener RNA ermöglichen. Nach der Abbildung wurde das Gel wieder in die Gelapparatur gegeben und für weitere dreieinhalb Stunden elektrophoresiert. Nach der Re-Imaging des Gels waren die Komplexe weiter abgewandert und waren noch leicht nachweisbar, was auf ihre Stabilität hindeutet ( Abbildung 1C ). Diese Fähigkeit, die Elektrophorese und die Analyse nach der anfänglichen Bildgebung fortzusetzen, wäre mit dem vertikalen Gelformat anspruchsvoll, wenn nicht gar unmöglich.
Abbildung 1: Ein Vergleich der vertikalen und der horizontalen nativen Gele zur Analyse der Bindung von Bicc1 an Cripto1 RNA. BiCc1-Bindungsexperimente wurden mit einer 32-Nukleotid-Fluoreszenz-CyclinB1-RNA-Negativkontrolle oder einer fluoreszierenden 32-Nukleotid-Cripto1-RNA-Positivkontrolle durchgeführt. Jede Reaktion enthielt entweder 0 nM oder 250 nM SUMO-Bicc1 N-terminal und analysierte entweder auf einem ( A ) senkrechten Polyacrylamid-nativen Gel, das für 30 min bei 120 V bei 4 ° C oder als doppelte Proben im horizontalen Polyacrylamid-nativen Gel für ( B ) 2 h bei 120 V bei 4 ° C oder ( C ) 5,5 h bei 120 V bei 4 ° C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Native Polyacrylamidgele sind ein unschätzbares Hilfsmittel zur Untersuchung von Protein-RNA-Wechselwirkungen und traditionell werden diese Gele vertikal 2 , 3 elektrophoresiert. Wir haben eine Modifikation des Protokolls verwendet, das native Polyacrylamidgele ersetzt, die horizontal hergestellt und elektrophoresiert werden 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Diese Veränderungen, die in Kombination mit fluoreszenzmarkierten RNA-Substraten verwendet werden, bieten zahlreiche Vorteile für die biochemische Analyse von Protein-RNA-Bindungs-Wechselwirkungen. Diese Vorteile umfassen die folgenden: das Mischen von Puffern ist vereinfacht im Vergleich zu einer vertikalen Vorrichtung, die eine Pumpe benötigt, um Puffer von der unteren Kammer zu den oberen zu übertragen, können horizontale Gele mit größeren Vertiefungen erzeugt werden, die eine erhöhte Kapazität für die Analyse von lar liefernGer-Proben, Elektrophorese auf horizontalen Gelen bieten oft eine verbesserte Auflösung von RNA-Protein-Komplexen im Vergleich zu vertikalen Gelen, und die horizontale Gelelektrophorese bietet die Möglichkeit, Experimente zu verschiedenen Zeitpunkten während der Analyse zu bauen.
Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, dass das horizontale Format sich für die Schaffung von Gelen mit einer großen Anzahl von Brunnen eignet, die die Möglichkeit bietet, mehrere Proben parallel zu analysieren 1 . Diese Funktion erweitert ihre Verwendung als biochemisches Werkzeug zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Beispielsweise erleichtert die Fähigkeit, mehrere Proben zu analysieren, die Untersuchung der quantitativen Parameter der Protein-RNA-Komplexbildung durch die Verwendung von Konkurrenzversuchen 15 , k off- Analyse 15 sowie Experimente zur Definition der Stöchiometrie der Bindungskomplexkomponenten 15 . Darüber hinaus ist die Verwendung vonFluoreszierende RNA-Substrate ermöglicht es, mehrere Analysen durchzuführen, wie z. B. Fluoreszenzpolarisations-Bindungsassays aus einer einzigen Reaktion und erhalten sowohl quantitative als auch qualitative Bindungsdaten 5 , 15 .
Um optimale Ergebnisse aus dem horizontalen Gel-Setup zu erhalten, gibt es eine Vielzahl von Parametern, die angepasst werden können, um die Qualität der Komplexe für die Bildgebung zu verbessern. Dazu gehört die Veränderung des Acrylamid-Prozentsatzes des Gels, um es einfacher zu handhaben und die Trennung von Protein-RNA-Komplexen von der freien RNA zu verbessern. Allerdings kann es schwierig sein, niedrige prozentuale Acrylamidgele aufgrund der Größe zu behandeln. Wir finden es am einfachsten, Gele zu verwenden, die eine Acrylamidkonzentration von 7,5% oder mehr aufweisen. Auch können die Elektrophoresebedingungen gegebenenfalls geändert werden, um die Stabilität von Protein-RNA-Komplexen zu verbessern; Einstellen der Elektrophorese-Spannung, Laufen des Gels bei Raumtemperatur insteAd bei 4 ° C und Anpassung der Vorlaufbedingungen.
Trotz der vielen Vorteile gibt es auch einige Einschränkungen von horizontalen nativen Gelelektrophorese-Assays. Zum Beispiel wird ihr Nutzen durch die Verwendung eines fluoreszierenden RNA-Substrats maximiert. Abhängig von dem gewählten Fluorophor und der Größe der RNA kann das Erhalten solcher Substrate teuer sein. Zusätzlich sind horizontale Gele im allgemeinen viel grßer als vertikale Gele und erfordern daher größere Mengen an Material wie Polyacrylamid und DEPC-behandelten Lösungen.
Horizontal native Gelelektrophorese hat das Potential für die molekulare Siebe als Validierungswerkzeug verwendet werden , die versuchen, Verbindungen zu identifizieren , die klinisch relevanten RNA-Protein - Wechselwirkungen 16 zielen. Solche Bildschirme verwenden typischerweise Lösungs-biochemische Assays, um relevante Verbindungen für die weitere Untersuchung zu identifizieren. Das höhere Durchsatzpotential des horizontalen Formats im Vergleich zum vertikalen FormatEine Möglichkeit, native Gelelektrophorese als Werkzeug für die sekundäre Validierung von potentiellen Kandidaten anzuwenden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Laura Vanderploeg für die Vorbereitung von Figuren. Die Arbeit im Sheets Labor wird von NSF Grant 1050395 und NIH Grant (R21HD076828) unterstützt. Die Arbeit im Ryder Labor wird von NIH Stipendien R01GM117237 und R01GM117008 unterstützt. Megan Dowdle wird von einem SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowship durch University of Wisconsin-Madison Graduate School und Biotechnology Trainingsprogramm durch das National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (T32GM008349) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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