L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.
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Article de méthode
Électrophorèse de gel horizontal pour une détection améliorée des complexes protéine-ARN
Dans cet article
Résumé
Résumé
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l'analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l'horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d'ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l'électrophorèse progresse. Cela fournit l'occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l'expérience. De plus, l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.
Introduction
Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l'affinité de liaison des protéines à l'ARN ou à l'ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison....
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Protocole
1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal 4 .
- Préparation des matériaux nécessaires.
- Pour l'appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément.
- Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED et 10% APS (persulfate d'ammonium).
- Génération d'un gel d'acrylamide natif à 10%.
- Dans un bal....
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Résultats
Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l'électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l'ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux 9,
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Discussion
Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , 7
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d'opportunités avancées SciMed GRS par l'intermédiaire de l'École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Boîte de gel horizontale | OWL N | /A | Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophorèse peignes | OWL | N/A | Produit qui n’est plus fabriqué. Des boîtes de gel similaires peuvent être trouvées chez Thermo Scientific, peignes de boîtes de gel de la série A. Numéro de catalogue : A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Cellule d’électrophorèse | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40 % 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| ARNt de levure | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescéine étiquetée ARN | IDT | N/A | La commande peut être faite sur mesure à la longueur et à la séquence souhaitée |
| EDTA sel tétrasodique hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES Sigma-Aldrich | H4034-500G | ||
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Acide borique | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
Références
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacteri....
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Réimpressions et autorisations
