Summary
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental pour analyser les interactions ARN-protéines. Traditionnellement, la plupart des expériences ont utilisé des gels verticaux. Cependant, les gels horizontaux offrent plusieurs avantages, tels que la possibilité de surveiller les complexes lors de l'électrophorèse. Nous fournissons un protocole détaillé pour la génération et l'utilisation d'électrophorèse sur gel horizontal horizontal.
Abstract
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide natif est un outil fondamental de la biologie moléculaire qui a été largement utilisé pour l'analyse biochimique des interactions ARN-protéines. Ces interactions ont été traditionnellement analysées avec des gels de polyacrylamide générés entre deux plaques de verre et des échantillons électrophorés verticalement. Cependant, les gels de polyacrylamide coulés dans des plateaux et électrophorés à l'horizontale offrent plusieurs avantages. Par exemple, des gels horizontaux utilisés pour analyser des complexes entre des substrats d'ARN fluorescents et des protéines spécifiques peuvent être imagés plusieurs fois à mesure que l'électrophorèse progresse. Cela fournit l'occasion unique de surveiller les complexes ARN-protéine à plusieurs points pendant l'expérience. De plus, l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle. Cela peut grandement faciliter les expériences de cours et analyser simultanément plusieurs réactions pour comparer différents composants et conditions. Ici nous prOvulent un protocole détaillé pour générer et utiliser une électrophorèse sur gel horizontale horizontale pour analyser les interactions ARN-protéines.
Introduction
Les essais de changement de mobilité électrophorétique (EMSA) se sont révélés être un outil biochimique inestimable pour analyser les interactions spécifiques entre les protéines et les acides nucléiques 1 , 2 , 3 . Ces analyses peuvent fournir des informations importantes concernant l'affinité de liaison des protéines à l'ARN ou à l'ADN 3 , la stoechiométrie des composants des complexes nucléiques-protéines 1 et fournissent de nouvelles informations importantes sur la spécificité de liaison des protéines de liaison de l'ARN par des expériences de compétition de substrat 1 .
La configuration expérimentale traditionnelle pour ces essais consiste à mélanger une protéine purifiée avec un substrat d'ARN radiomarqué. Les complexes résultants sont ensuite analysés avec des gels de polyacrylamide non dénaturants (natifs) versés entre deux plaques de verre suivies d'une électrophorèse d'échantillon dans un appareil vertical 3. Bien que cette approche ait été utilisée de manière exhaustive pour fournir des informations importantes sur les mécanismes biochimiques qui sous-tendent la liaison des protéines aux acides nucléiques, elle a également plusieurs limites. Par exemple, cette stratégie de base a un débit relativement faible et n'est pas facilement adaptable pour les applications nécessitant l'analyse de plusieurs réactions de liaison en parallèle. En outre, avec l'appareil vertical traditionnel, il est difficile de surveiller potentiellement les complexes à plusieurs reprises lors de l'électrophorèse 3 , 4 .
Nous présentons ici une adaptation du dosage EMSA qui utilise des gels de polyacrylamide natifs coulés dans un appareil à plat, une électrophorèse horizontale et des substrats d'ARN marqués par fluorescence 4 , 5 , 6 , 7 . L'incorporation de ces modifications relativement simples à la base straTegy offre de nombreux avantages. En particulier, le format à plat horizontal se prête facilement à analyser des dizaines d'échantillons simultanément 4 . En outre, pour certains complexes ARN-protéines, tels que ceux formés entre la protéine Bicaudal-C et son électrophorèse au substrat d'ARN dans un gel horizontal, offre une capacité accrue à résoudre des complexes distincts de protéines d'ARN et à les discriminer à partir de substrat d'ARN non lié.
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Protocol
1. Préparation du gel de polyacrylamide natif horizontal 4 .
- Préparation des matériaux nécessaires.
- Pour l'appareil de gel horizontal, utilisez une boîte en gel (37 cm x 24 cm) avec un plateau de 27 cm x 21 cm et une capacité pour deux peignes de 24 po. Cette configuration fournit un total de 48 échantillons qui peuvent être analysés simultanément.
- Préparez les réactifs suivants: 40% Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED et 10% APS (persulfate d'ammonium).
- Génération d'un gel d'acrylamide natif à 10%.
- Dans un ballon de 500 mL, ajouter 80 mL de 5x TBE, 100 mL d'acrylamide à 40% et de l'eau à un volume final de 400 ml.
- Ajouter 4 mL d'APS à 10% et 400 μL de TEMED. Bien mélanger.
- Verser le mélange dans le bac de coulée horizontale et laisser le gel polymériser pendant 30 min. Le gel aura environ 2 cm d'épaisseur.
REMARQUE: Les gels peuvent couler dans une hotte pour accélérerJusqu'à la polymérisation. Après la polymérisation, une fine couche de liquide restera sur le dessus du gel. - Verser le liquide et rincer avec le tampon courant. Retirez le (s) peigne (s) avec précaution et rincez les puits avec un tampon courant à l'aide d'une seringue.
- Préparation du tampon courant.
- Préparez 2 L de 1x tampon de fonctionnement TBE pour la boîte à gel. Diluer 400 ml de 5XTBE avec 1600 ml et mélanger. Placez le tampon TBE dans la chambre froide pour refroidir.
- Pré-exécuter le gel
- Ajouter 2 L de tampon de fonctionnement à froid dans la boîte à gel et insérer le gel.
- Pré-exécuter le gel à 120 V pendant 1 h à 4 ° C dans une chambre froide. Pendant ce temps, préparez la réaction de liaison.
2. Réaction de liaison 8
- 2.1.Préparez les composants de réaction suivants.
DTT 20 mM
BSA 10 mM
10 mM d'ARNt de levure
5X tampon de liaison (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM de KCl, 0,2% de Tween-20)
L'ARN marqué à la fluorescéine 100 nM a été acheté commercialement
Concentré de protéine Bicaudal-C
50% de glycérol dans H 2 O traité par DEPC
H 2 O traité par DEPC - Assembler les composants de réaction de liaison dans un tube de microcentrifugeuse sans RNase.
- Au tube, ajouter 5 μL de BSA 10 mM, 5 μL de DTT 20 mM, 5 μL d'ARNt de levure 10 mM, 10 μL de 5x Binding Buffer.
- Ajouter une protéine à une concentration finale de 250 nM dans 50 μL. Ajouter de l'eau à un volume final de 45 μL.
- Ajouter 5 μL de substrat d'ARN marqué par fluorescence. Utiliser un substrat de 32 nucleotides marqué par fluorescéine 3 'commercialement acheté.
- Mélanger et incuber dans l'obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.
3. Analyse des échantillons sur le gel de polyacrylamide horizontal natif
- Pour chaque réaction, ajouter 15 μL de 50% de glycerol et mélanger doucement.
- CarefuAjouter 30 μL de chaque réaction au gel. La quantité d'échantillon qui peut être chargée dans un puits unique varie en fonction de l'épaisseur du gel et de la taille des puits. Nous avons chargé des volumes aussi peu que 15 μL et jusqu'à 45 μL dans un seul puits de gels créé avec un peigne de 24 po et versé à une épaisseur de 2 cm.
- Après avoir connecté l'alimentation à l'appareil gel, allumez l'alimentation et réglez la tension. Faire passer le gel à 4 ° C à 120 V.
REMARQUE: pour l'appareil de gel horizontal, cela finit par être d'environ 5 V / cm. Pour l'appareil de gel vertical, il s'agit de 16 V / cm.- Pour éviter d'endommager ou blanchir l'ARN marqué par fluorescence, effectuer une électrophorèse dans l'obscurité.
- Varier les temps d'électrophorèse en fonction des spécificités du complexe ARN-protéine analysé.
REMARQUE: Un avantage majeur de l'analyse EMSA horizontale est que l'électrophorèse peut être arrêtée, le gel imagé et ensuite le géJe peux être replacé dans l'appareil et l'électrophorèse peut être poursuivie pendant plus longtemps.
4. Imagerie du Gel
- Effectuer une analyse avec n'importe quel instrument conçu pour la détection et l'imagerie de substrats fluorescents.
- Placez le gel sur l'imageur.
- Régler les paramètres de l'image. Pour les ligands d'ARN marqués à la fluorescéine, utilisez les paramètres suivants: FAM (longueur d'onde 473 nm), 750 Tension de photomultiplicateur (PMT), taille de pixel de 100 μm.
- Scannez le gel pour capturer l'image.
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Representative Results
Pour démontrer la puissance et la polyvalence de l'électrophorèse en gel native horizontale, nous avons analysé la liaison de la protéine Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) à un ARN marqué par fluorescence contenant un site de liaison Bicc1. Bicc1 protéines fonctionnent comme des répresseurs pour contrôler traductionnelles spécifiques à l'ARNm de décisions du destin cellulaire au cours des étapes maternelles de développement des animaux 9, 10, 11, 12 ainsi que les fonctions des organes spécifiques chez les adultes 13, 14. Notre travail chez Xenopus a identifié le premier site de liaison pour une protéine Bicc1 8 : une région de 32 nucleotides à partir de la 3'UTR de l'ARNm Cripto-1 8 , 12 . Ce site de liaison a été défini en utilisant une combinaison de techniques: RNase ProtectDes analyses d'ions et d'empreintes, des expériences de liaison in vivo et des essais EMSA in vitro 8 .
La protéine Xenopus Bicc1 purifiée a été mélangée avec un ARN de 32 nucleotides marqué par fluorescence; Le site de liaison Bicc1 de l'ARNm Cripto-1 8 . Dans une réaction séparée, la protéine Bicc1 a été mélangée avec un ARN de 32 nucleotides marqué par fluorescence dérivé du 3'UTR de l'ARNm de la cycline B1. Bicc1 ne se lie pas à l'ARNm de cycline B1 8 , 12 et cet ARN sert de témoin négatif. La moitié de chaque réaction a été analysée sur un gel de polyacrylamide natif vertical ( Figure 1A ) tandis que l'autre partie a été analysée en parallèle à l'aide d'un gel natif horizontal ( Figure 1B ). Il est facilement apparent en utilisant l'une ou l'autre méthode que Bicc1 lie à l'ARN Cripto-1 d'ARN et forme un complexe spécifique aEt ne lie pas l'ARN de contrôle négatif de la cycline B1. Cependant, les complexes Bicc1-Cripto-1 sont nettement plus distincts lorsqu'ils sont analysés avec le gel horizontal, facilitant leur détection et permettant la discrimination des complexes protéine-ARN de l'ARN non lié. Après l'imagerie, le gel a été placé de nouveau dans l'appareil de gel et soumis à une électrophorèse pendant trois heures et demie supplémentaires. Après avoir réimaginé le gel, les complexes ont migré plus loin et étaient encore facilement détectables, indiquant leur stabilité ( figure 1C ). Cette capacité à poursuivre l'électrophorèse et l'analyse après l'imagerie initiale serait difficile, sinon impossible, avec le format de gel vertical.
Figure 1: Comparaison des gels naturels verticaux et horizontaux pour analyser la liaison de l'ARN Bicc1 à Cripto1. BiDes expériences de liaison au cc1 ont été réalisées avec un témoin négatif d'ARN de CyclinB1 à 32 nucleotides ou un témoin fluorescent de 32 nucleotides Cripto1 RNA positif. Chaque réaction contenait 0 nM ou 250 nM de N-terminal SUMO-Bicc1 et analysé sur un gel natif de polyacrylamide vertical ( A ) mis en oeuvre pendant 30 min à 120 V à 4 ° C ou en échantillons en double dans le gel natif de polyacrylamide pour ( B ) 2 h à 120 V à 4 ° C ou ( C ) 5,5 h à 120 V à 4 ° C. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les gels de polyacrylamide indigènes sont un outil précieux pour étudier les interactions protéine-ARN et, traditionnellement, ces gels sont électrophorisés verticalement 2 , 3 . Nous avons utilisé une modification du protocole qui substitue les gels de polyacrylamide indigènes créés et soumis à une électrophorèse horizontale 1 , 4 , 6 , 7 , 15 . Ces changements utilisés en combinaison avec des substrats d'ARN marqués par fluorescence offrent de nombreux avantages pour l'analyse biochimique des interactions de liaison protéine-ARN. Ces avantages comprennent ce qui suit: le mélange des tampons est simplifié par rapport à un appareil vertical qui nécessite une pompe pour transférer le tampon de la chambre inférieure vers le haut, des gels horizontaux peuvent être générés avec des puits plus grands qui fournissent une capacité accrue d'analyse de larLes échantillons de ger, l'électrophorèse sur les gels horizontaux fournissent souvent une meilleure résolution des complexes de protéines d'ARN par rapport aux gels verticaux, et l'électrophorèse sur gel horizontale permet d'imaginer des expériences à plusieurs moments lors de l'analyse.
Un autre avantage majeur est que le format horizontal se prête à la création de gels avec un grand nombre de puits qui permet d'analyser plusieurs échantillons en parallèle 1 . Cette fonctionnalité élargit considérablement leur utilisation en tant qu'outil biochimique pour analyser les interactions ARN-protéines. Par exemple, la capacité d'analyse de multiples échantillons facilite l'étude des paramètres quantitatifs de la formation de complexes protéine-ARN par l'utilisation d'expériences de compétition 15 , de l' analyse 15 ainsi que des expériences conçues pour définir la stoechiométrie des composants complexes 15 de liaison. En outre, l'utilisation d'unLes substrats d'ARN fluorescents permettent d'effectuer des analyses multiples, telles que des essais de liaison par polarisation de fluorescence à partir d'une seule réaction et d'obtenir des données de liaison quantitatives et qualitatives 5 , 15 .
Pour obtenir des résultats optimaux à partir de la configuration horizontale du gel, il existe une variété de paramètres qui peuvent être ajustés pour améliorer la qualité des complexes pour l'imagerie. Ceux-ci incluent le changement du pourcentage d'acrylamide du gel afin de faciliter la manipulation et améliorer la séparation des complexes protéine-ARN de l'ARN libre plus. Cependant, il peut être difficile de traiter des gels d'acrylamide à faible pourcentage en raison de la taille. Nous trouvons qu'il est plus facile d'utiliser des gels qui ont une concentration en acrylamide de 7,5% ou plus. En outre, si nécessaire, les conditions d'électrophorèse peuvent être modifiées pour améliorer la stabilité des complexes protéine-ARN; Réglage de la tension d'électrophorèse, fonctionnement du gel à température ambianteAnnonce de 4 ° C et réglage des conditions de pré-course.
Malgré les nombreux avantages, il existe également certaines limites des essais d'électrophorèse sur gel en milieu horizontal. Par exemple, son utilité est optimisée en utilisant des substrats d'ARN fluorescents. Selon le fluorophore choisi et la taille de l'ARN, l'obtention de tels substrats peut être coûteuse. En outre, les gels horizontaux sont généralement beaucoup plus grands que les gels verticaux et nécessitent donc des quantités plus importantes de matériaux tels que le polyacrylamide et les solutions traitées par DEPC.
L'électrophorèse en gel natif horizontale a le potentiel d'être utilisé comme outil de validation pour les écrans moléculaires qui cherchent à identifier des composés qui ciblent des interactions RNA-protéines cliniquement pertinentes 16 . De tels écrans utilisent généralement des analyses biochimiques en solution pour identifier les composés pertinents pour une étude plus approfondie. Le potentiel de débit supérieur du format horizontal par rapport au format vertical proviOffre une opportunité d'appliquer une électrophorèse en gel native comme outil de validation secondaire de candidats potentiels.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Laura Vanderploeg pour la préparation des chiffres. Le travail dans le laboratoire Sheets est soutenu par la subvention NSF 1050395 et la subvention NIH (R21HD076828). Le travail dans le laboratoire Ryder est soutenu par les subventions du NIH R01GM117237 et R01GM117008. Megan Dowdle est soutenu par une bourse d'opportunités avancées SciMed GRS par l'intermédiaire de l'École universitaire de Wisconsin-Madison et du Programme de formation en biotechnologie par le biais de l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de santé (T32GM008349).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
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