Summary
Doğal poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için temel bir araçtır. Geleneksel olarak çoğu deney dikey jel kullanmıştır. Bununla birlikte, yatay jeller elektroforez sırasında kompleksleri izleme fırsatı gibi birçok avantaj sağlar. Yatay doğal jel elektroforezinin üretilmesi ve kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.
Abstract
Yerli poliakrilamid jel elektroforezi, RNA-protein etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için kapsamlı bir şekilde kullanılan moleküler biyolojinin temel bir araçtır. Bu etkileşimler geleneksel olarak iki cam levha arasında üretilen poliakrilamid jelleri ve numuneler dikey olarak elektroforez ile analiz edilmiştir. Bununla birlikte, tepsilerde dökülen ve yatay olarak elektroforez edilen poliakrilamid jeller çeşitli avantajlar sunmaktadır. Örneğin, flüoresans RNA substratları ve spesifik proteinler arasındaki kompleksleri analiz etmek için kullanılan yatay jeller, elektroforez ilerledikçe birçok kez görüntülene edilebilir. Bu, deney sırasında RNA-protein komplekslerini çeşitli noktalarda izlemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Buna ek olarak, yatay jel elektroforezi birçok numuneyi paralel olarak analiz etmeyi mümkün kılar. Bu, farklı bileşenleri ve koşulları karşılaştırmak için zamanlama deneylerini büyük ölçüde kolaylaştırabilir ve aynı anda birden fazla reaksiyonu analiz edebilir. İşte biz prRNA-Protein etkileşimlerini analiz etmek için yatay doğal jel elektroforezi üretmek ve kullanmak için ayrıntılı bir protokolü inceleyin.
Introduction
Elektroforetik mobilite kayma testleri (EMSA'lar), spesifik protein-nükleik asit etkileşimleri 1 , 2 , 3'ü analiz etmek için paha biçilemez bir biyokimyasal araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahliller, proteinlerin RNA veya DNA 3'e bağlanma afinitesi hakkında önemli bilgi sağlayabilir ve nükleik asit-protein komplekslerinin 1 bileşen stokiyometrisi 1 ve substrat rekabet deneyleri 1 yoluyla RNA bağlama proteinlerinin bağlanma spesifitesi hakkında önemli yeni bilgiler sağlar 1 .
Bu deneyler için geleneksel deney düzeneği, saflaştırılmış proteinin radyo-etiketli bir RNA substratı ile karıştırılmasından oluşur. Ortaya çıkan kompleksler daha sonra iki cam levha arasına dökülen denatüre edici olmayan (doğal) poliakrilamid jeller ile, ardından dikey bir cihazda 3 numune elektroforeziyle analiz edilir. Bu yaklaşım, proteinlerin nükleik asitlere bağlanmasının temelini oluşturan biyokimyasal mekanizmalarda önemli bilgiler sağlamak için kapsamlı bir şekilde kullanılmış olmakla birlikte, çeşitli sınırlamaları da vardır. Örneğin, bu temel strateji nispeten düşük işlem hacmine sahiptir ve birçok bağlama reaksiyonunu paralel olarak analiz etmeyi gerektiren uygulamalar için kolayca uyarlanamaz. Buna ek olarak, geleneksel dikey aparat ile elektroforez 3 , 4 sırasında kompleksleri birden çok kez potansiyel olarak izlemek zor.
Burada, düz yataklı bir aparatta, yatay elektroforezde ve floresanla etiketlenmiş RNA substratları 4 , 5 , 6 , 7'de yerli poliakrilamid jelleri kullanan EMSA tahlilinin uyarlamasını sunuyoruz. Bu nispeten basit değişikliklerin temel samana dahil edilmesiTegy bazı güçlü avantajlar sağlar. Özellikle yatay masaüstü biçimi, düzinelerce numuneyi eşzamanlı olarak analiz etmeye yardımcı olur 4 . Ayrıca, Bicaudal-C proteini ile RNA substratı arasında oluşan RNA-protein kompleksleri için, yatay bir jelde elektroforez farklı RNA-protein komplekslerini çözmek ve bağlanmamış RNA substrattan ayırmak için artan bir yeteneğe sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yatay Native Poliakrilamid Jelin Hazırlanması 4 .
- Gerekli malzemelerin hazırlanması.
- Yatay jel aparatı için 27 cm x 21 cm'lik bir tepsi ve iki adet 24 kuyucuklu tarak için bir jel kutusu (37 cm x 24 cm) kullanın. Bu kurulum, aynı anda analiz edilebilecek toplam 48 örnek sağlar.
- Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın:% 40 Acrylamide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borat-EDTA pH 8.0), TEMED ve% 10 APS (amonyum persülfat).
- % 10 yerli akrilamid jelinin üretilmesi.
- 500 mL'lik bir şişe içerisinde 80 mL 5x TBE, 100 mL% 40 akrilamid ve su 400 mL'lik bir son hacme ilave edin.
- 4 mL% 10 APS ve 400 μL TEMED ekleyin. İyice karıştırın.
- Karışımı yatay döküm tepsisine dökün ve jelin 30 dakika boyunca polimerleşmesine izin verin. Jel yaklaşık 2 cm kalınlığında olacaktır.
NOT: Jel hızlandırmak için bir duman kabına dökebilirUp polimerizasyon. Polimerizasyondan sonra, ince bir tabaka sıvı jelin üzerinde kalacaktır. - Sıvıyı boşaltın ve akan tamponla durulayın. Tarakları dikkatlice çıkarın ve bir şırınga kullanarak oyuklu tamponla oyukları durulayın.
- Çalışan tamponun hazırlanması.
- Jel kutusu için 2 L 1x TBE akış tamponu hazırlayın. 400 mL 5XTBE'yi 1600 mL ile inceltin ve karıştırın. Soğuk olması için 1x TBE tamponu soğuk odaya yerleştirin.
- Jeli önceden çalıştırma
- Jel kutusuna 2 L soğuk çalıştıran tampon ekleyin ve jeli takın.
- Jeli, soğuk bir odada 4 ° C'de 1 saat 120 V'de önceden çalıştırın. Bu süre zarfında, bağlanma reaksiyonunu hazırlayın.
2. Bağlama Tepkisi 8
- 2.1.Aşağıdaki reaksiyon bileşenlerini hazırlayın.
20 mM DTT
10 mM BSA
10 mM maya tRNA'ları
5X bağlama tamponu (50 mM HEPES pH 8.0, 5 mM EDTA, 250 mM KCI,% 0.2 Tween-20)
Ticari olarak satın alınan 100 nM floresan etiketli RNA
Konsantre Bikioz-C proteini
DEPC ile muamele edilmiş, H2O içinde% 50 gliserol
DEPC ile muamele edilmiş H2O - Bağlanma reaksiyon bileşenlerini bir RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüpünde bir araya getirin.
- Tüp için, 10 mM BSA 5 mcL, 20 mM DTT 5 mcL, 10 mM maya tRNA'lar 5 mcL, 5 x Cilt Tamponu 10 mcL ekleyin.
- 50 uL'de 250 nM son konsantrasyona protein ekleyin. 45 μL'lik nihai bir hacme su ilave edin.
- 5 μL floresanla işaretlenmiş RNA substratı ekleyin. Ticari olarak satın alınan bir 3 'fluorescein etiketli 32-nukleotid substrat kullanın.
- Karıştırın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
3. Yerli Yatay Poliakrilamid Jelinde Numunelerin Analizi
- Her tepkime için, 15 μL% 50 gliserol ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- dikkatli bir şekildJellere her reaksiyondan 30 μL ekleyin. Tek bir oyuğa yüklenebilecek numune miktarı, jelin kalınlığına ve oyukların boyutuna bağlı olarak değişir. 24-kuyucuklu bir tarakla yaratılan ve 2 cm'lik bir kalınlığa dökülen tek bir jel jeline 15 μL kadar ve 45 μL kadar hacim yükledik.
- Gç kaynağını jel aparatına bağladıktan sonra güç kaynağını açın ve voltajı ayarlayın. Jel 4 ° C'de 120 V'de çalıştırın.
NOT: Yatay jel aparatı için yaklaşık 5 V / cm kalır. Dikey jel aparatı için, bu 16 V / cm'dir.- Floresanla işaretlenmiş RNA'nın hasar görmesini veya ağartılmasını önlemek için karanlıkta elektroforez yapın.
- Analiz edilen RNA-protein kompleksinin özelliklerine bağlı olarak değişen elektroforez zamanı.
NOT: Yatay EMSA analizinin önemli bir avantajı, elektroforezin durdurulabileceği, jelin görüntülendiği ve daha sonra daCihaza tekrar yerleştirilebilir ve elektroforez daha uzun süre devam edebilir.
4. Jel Görüntüleme
- Floresan yüzeyler algılama ve görüntüleme için tasarlanmış herhangi bir enstrüman ile analiz yapın.
- Jeli görüntüleyiciye yerleştirin.
- Görüntüleyici ayarlarını yapın. Floresein etiketli RNA ligandları için aşağıdaki ayarları kullanın: FAM (dalga boyu 473 nm), 750 Fotomultiplier voltaj (PMT), 100 μm piksel boyutu.
- Görüntü yakalamak için jel tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yatay doğal jel elektroforezinin gücü ve çok yönlülüğünü göstermek için Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) proteininin bir Bicc1 bağlanma yeri içeren floresanla işaretlenmiş bir RNA'ya bağlandığını analiz ettik. Bicc1 proteinleri, hayvanlarda gelişme 9 , 10 , 11 , 12'nin maternal evreleri boyunca hücre akıbeti kararlarını kontrol etmek için mRNA'ya spesifik translasyonel baskılayıcıların yanı sıra yetişkinlerde spesifik organların işlevleri 13 , 14'te işlev görürler. Xenopus Çalışmalarımız, bir Bicc1 proteini 8 birinci bağlanma sitesi belirlenmiştir: 32 nükleotid bölgesini mRNA nın, 8, 12 Cripto-1 3'UTR'sinden. Bu bağlanma yeri, tekniklerin bir kombinasyonu kullanılarak tanımlandı: RNase korumasıIyon ve ayak izi deneyleri, in vivo bağlanma deneyleri ve in vitro EMSA tahlilleri 8 .
Saflaştırılmış Xenopus Biccl proteini floresanla etiketlenmiş bir 32 nükleotid RNA ile karıştırılmıştır; Cripto-1 mRNA'sından Bicc1 bağlanma bölgesi 8 . Ayrı bir reaksiyonda, Biccl proteini siklin B1 mRNA'sının 3'UTR'sinden türetilen floresanla etiketlenmiş bir 32 nükleotit RNA ile karıştırıldı. Bicc1, cyclin B1 mRNA 8 , 12'ye bağlanmaz ve bu RNA, negatif bir kontrol olarak görev yapar. Her bir reaksiyonun yarısı dikey doğal poliakrilamid jelinde ( Şekil 1A ) analiz edilirken diğer kısım yatay doğal jel kullanılarak paralel analiz edilmiştir ( Şekil 1B ). Biccl'in RNA Cripto-1 RNA'sına bağlandığı ve spesifik bir kompleks oluşturduğu ya da∙ Bu, siklin B1 negatif kontrol RNA'sını bağlamaz. Bununla birlikte, yatay jel ile analiz edildiğinde Bicc1-Cripto-1 kompleksleri belirgin olarak daha belirgindir ve hem tespitlerini kolaylaştırır hem de bağlanmamış RNA'dan protein-RNA komplekslerinin ayrımına izin verir. Görüntülemeden sonra jel, jel aparatına geri yerleştirildi ve bir buçuk saat daha elektroforezlendi. Jel yeniden görüntülemeden sonra kompleksler daha da göç ettiler ve halen kolayca saptanabildiler ve stabilitesini gösterdiler ( Şekil 1C ). İlk görüntülemeden sonra elektroforez ve analiz devam etme olanağı, imkansız olmasa bile, dikey jel formatıyla zor olacaktır.
Şekil 1: Biccl'in Cripto1 RNA'ya bağlanmasını analiz etmek için dikey ve yatay doğal jellerin karşılaştırması. BiCc1 bağlanma deneyleri, 32-nükleotidli bir floresan SyclinB1 RNA negatif kontrol veya flüoresan 32-nükleotid Cripto1 RNA pozitif kontrolü ile gerçekleştirildi. Her reaksiyon, ya 0 nM ya da 250 nM SUMO-Biccl N-terminali içeriyordu ya ya 4 ° C'de 120 V'de 30 dakika süreyle ( A ) dikey bir poliakrilamid yerli jeli üzerinde ya da yatay poliakrilamid doğal jelinde yinelenen numuneler olarak ( B ) 120 ° C'de 4 ° C'de 2 saat veya ( C ) 5.5 ° C'de 120 ° C'de 4 ° C'de. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yerli poliakrilamid jelleri, protein-RNA etkileşimlerini araştırmak için paha biçilemez bir araçtır ve geleneksel olarak bu jeller dikey olarak 2 , 3 elektroforez edilir. Doğal poliakrilamid jelleri oluşturan ve yatay olarak elektroforez edilen 1 , 4 , 6 , 7 , 15'in yerini alan bir protokol değişikliği yaptık. Floresan etiketli RNA substratlarıyla birlikte kullanılan bu değişiklikler, protein-RNA bağlama etkileşimlerinin biyokimyasal analizi için sayısız avantaj sağlar. Bu avantajlar aşağıdakileri içerir: tamponların karıştırılması, tamponu alt hücreden üste aktarmak için bir pompa gerektiren dikey bir cihaza kıyasla basitleştirilmiştir, yatay jeller, daha büyük kuyulardan üretilebilir ve bunlar,Ger örnekleri, yatay jellerde elektroforez, dikey jellere kıyasla RNA-protein komplekslerinin daha iyi çözünürlüğünü sağlar ve yatay jel elektroforezi, analiz sırasında çoklu zaman noktalarında deney deney imkanı sağlar.
Bir başka önemli avantaj, yatay biçimde paralel 1'de birden fazla numune analiz için kapasite sağlar kuyu çok sayıda jeller oluşturmak için oldukça rahat olmasıdır. Bu özellik, RNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için biyokimyasal bir araç olarak kullanımı önemli ölçüde artırır. Örneğin, özelliği, rekabet deneyleri 15 kullanımı ile, protein-RNA kompleks oluşumunun kantitatif parametrelerin kontrolü kolaylaştırmaktadır çoklu örnekleri analiz analizi 15 hem de bağlayıcı kompleks bileşenler 15 stokiyometri tanımlamak üzere tasarlanmış deneylerin koff için. Buna ek olarak, birFloresan RNA substratlar mümkün hem nicel hem de nitel bağlanma verileri 5, 15, tek bir reaksiyondan bağlanma deneyleri, örneğin floresan polarizasyon gibi, çeşitli analizler gerçekleştirmek ve elde edilmesini mümkün kılar.
Yatay jel ayarından optimum sonuçlar almak için, görüntüleme için komplekslerin kalitesini artırmak için ayarlanabilen çeşitli parametreler bulunur. Bunlar, ele alınmayı kolaylaştırmak ve protein-RNA komplekslerinin serbest RNA'dan daha fazla ayrılmasını arttırmak için jelin akrilamid yüzdesinin değiştirilmesini içerir. Bununla birlikte, boyutundan ötürü düşük yüzde akrilamid jelleri işlemek zor olabilir. Akrilamid konsantrasyonu% 7.5 veya daha fazla olan jelleri kullanmak en kolay buluyoruz. Ayrıca, gerekirse protein-RNA komplekslerinin stabilitesini artırmak için elektroforez koşulları değiştirilebilir; Elektroforez voltajını ayarlama, jel oda sıcaklığında çalıştırmaReklamı 4 ° C'de ısıtın ve ön çalışma koşullarını ayarlayın.
Birçok avantaja rağmen yatay doğal jel elektroforezi deneylerinde bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, bir flüoresan RNA substratları kullanılarak faydası en üst düzeye çıkarılır. Seçilen fluorofora ve RNA boyutuna bağlı olarak, bu gibi substratların elde edilmesi pahalı olabilir. Ayrıca yatay jeller genellikle dikey jellerden çok daha büyüktür ve bu nedenle poliakrilamid ve DEPC ile işlenmiş çözeltiler gibi daha fazla miktarda malzeme gerektirir.
Yatay doğal jel elektroforezi klinik olarak ilgili RNA-protein etkileşimlerini 16 hedef bileşiklerin tespit etmeye moleküler ekranlar için bir doğrulama aracı olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir. Bu tür perdeler tipik olarak daha ileri çalışmalar için ilgili bileşikleri tanımlamak için çözelti biyokimyasal analizleri kullanmaktadır. Yatay formatın dikey formattaki provizyona kıyasla daha yüksek verim potansiyeliPotansiyel adayların sekonder geçerliliği için bir araç olarak yerli jel elektroforezini uygulama fırsatı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Rakamlar hazırladığımız için Laura Vanderploeg'e teşekkür ediyoruz. E-Tablolar laboratuarı çalışması, NSF hibe 1050395 ve NIH hibe (R21HD076828) tarafından desteklenmektedir. Ryder laboratuarı NIH hibe R01GM117237 ve R01GM117008 tarafından desteklenmektedir. Megan Dowdle, National Institutes of Health'in Ulusal Tıbbı Bilimler Ulusal Enstitüsü (T32GM008349) aracılığıyla Wisconsin-Madison Enstitüsü ve Biyoteknoloji Eğitim Programı aracılığıyla SciMed GRS İleri Fırsat Fellowitesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horizontal Gel Box | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel boxes. Catalog Number: A2-BP |
| 24-well large large horizontal gel electrophoresis combs | OWL | N/A | Product no longer made. Similar gel boxes can be found at Thermo Scientific, A-series gel box combs. Catalog Number: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Mini-Protean II Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrylamide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| Yeast tRNAs | Ambion | AM7119 | |
| Fluorescein labeled RNA | IDT | N/A | Order can be made custom to length and desired sequence |
| EDTA tetrasodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Ultrapure | US Biological | T8600 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
References
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
- Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
- Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
- Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
- Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
- Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
- Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386 (2012).
- Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
- Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
- Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
- Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
- Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
- Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).
