Summary
Bakteriyosinlerin farklı ekolojik alanlarda mikrobik çeşitliliği tanımlamada önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir. Burada, bir hayvan modelinde bakteriyosinin bağırsak mikrobiyotik kompozisyonunu nasıl etkilediğini değerlendiren etkili bir prosedürü anlatacağız.
Abstract
Bağırsak mikrobiyoteri bileşimi ve sağlıkla olan ilişkisi, özellikle de nüfus dengesinin korunmasına katkıda bulunan faktörlerle ilgili gelişen bilgilerimiz ile ilginç sorular ortaya çıkıyor. Bununla birlikte, bu faktörleri değerlendirmek için sınırlı metodoloji bulunmaktadır. Bakteriyosinler, gıda bakımı ve / veya niş oluşumu için rekabet avantajı sağlayabilecek birçok bakteri tarafından üretilen antimikrobiyal peptitlerdir. Birçok probiyotik laktik asit bakteri (LAB) suşu patojenlerin büyümesini önleyerek insan ve hayvan sağlığını geliştirme potansiyeline sahiptir. Bakteriyosinler ürettikleri için immüno modülasyon için de kullanılabilirler. Bununla birlikte, bakteriyosinlerin antagonistik aktivitesi, normal olarak, tanımlanmış fakat aşırı basitleştirilmiş koşullar altında, bakterilerin konakçıdan ve yüzlerce mikrobik türden çok faktörlü etkilere maruz kaldığı insanlardaki ve hayvanlardaki karmaşık bağırsak ortamıyla karşılaştırıldığında laboratuar biyolojik tahlilleri ile saptanırAynı niş haring. Bu çalışma, etkiyi değerlendirmek için eksiksiz ve etkili bir prosedürü tanımlamaktadır. Bir sıçangil sisteminde farklı hedef spesifıkliklere sahip çeşitli bakteriosinler. Bakteriyosin muamelesi esnasında mikrobiyotik bileşimdeki değişiklikler, bileşimsel 16S rDNA dizilimi kullanılarak izlenir. Yaklaşımımız hem bakteriosin üreticilerini hem de izojenik olmayan bakteriyosin üreten mutantları kullanmaktadır; bu mutantlar, bakteriyosin ile ilişkili mikrobiyota ait olmayan bakteriyosin ile ilgili değişiklikleri ayırt etme yeteneği vermektedir. Dışkı DNA ekstraksiyonu ve 16S rDNA sekanslama yöntemleri tutarlıdır ve biyoinformatik ile birlikte bakteriyel profillerde hafif değişiklikler bulmak ve bakteri popülasyonları ile sağlık markörleri arasındaki kolesterol ve trigliserid konsantrasyonu açısından korelasyonlar oluşturmak için güçlü bir prosedür oluşturmaktadır. Protokolümüz jeneriktir ve bu nedenle, ana mikrofonu değiştirme potansiyeline sahip diğer bileşikleri veya besleyicileri incelemek için kullanılabilirRobiota kompozisyonu, ya toksisite ya da yararlı etkiler çalışılırken.
Introduction
Bakteriyosinler, geniş bir bakteri türü 1 , 2 tarafından üretilen antimikrobiyal peptidlerdir. Bu bileşikler ve üreticileri, özellikle LAB, yıllardır gıda koruma ve tıbbında potansiyel uygulamaları için dünya çapında araştırılmış ve istismar edilmiştir 3 . Birkaç bakteriosin, Listeria, Enterococcus, Staphylococcus ve Bacillus türlerini içeren önemli patojenleri öldürdüğü bilinmektedir. Bazı bakteriyosinler bile bağışıklık tepkisini 4 modüle etme yeteneğine sahiptirler. Pek çok bakteriyosinin nispeten dar spektrumları vardır, bu özellik bazı uygulamalarda çokça takdir edilmektedir. Örneğin, bazı dar spektrumlu bakteriosinler, aynı nişin paylaşımında bulunan komensal veya faydalı bitki üzerinde çok fazla rahatsızlık olmaksızın seçilen sorunlu bakteri gruplarına karşı spesifik aktiviteyi yönlendirmek için kullanılabilir; Bağırsak envirinde bu özellikle önemlidirSayısız faydalı mikropların etkileşimli ve dinamik bir şekilde yetiştiği 5 . Bakteriyosinler, bağırsak homeostazını dengesiz hale getirecek patojenler, patobiyonlar veya fırsatçı bakterilerin büyümesini bastırabildikleri için profilaktik veya probiyotik kullanım için çok caziptirler 6 , 7 .
Bakteriyosinler, doğaları ve fizikokimyasal özellikleri açısından farklı yapılara, hedef spesifitelerine, hareket şekillerine vb sahip oldukları için çok çeşitlidirler . Çoğu bakteriyosin, in vitro ortamlarda çok detaylı olarak incelenmiştir, ancak çok az gıda test edilmiştir Matrisler 8 , 9 ya da bir hayvansal bağırsak 6 , 10 gibi in vivo . In vitro özellikler, in vivo değerlendirildiğinde büyük ölçüde farklılık gösterebilir;Bağırsak ortamı ve yararlı bakteriler üzerinde istenmeyen etkiler. En probiyotikler LAB'dir. Kısa zincirli yağ asitleri de dahil olmak üzere konağın fizyolojisini etkilediği bilinen bazı bakterilere karşı antimikrobiyal özelliklerin sergilendiği diğer metabolitleri üretirler. Bu nedenle, bakteriyosinler üreten probiyotik suşlar söz konusu olduğunda, normal mikrobiyota sahip sağlıklı hayvanlar gibi gerçekçi testler yapmak en iyisidir.
Bu çalışmada, bakteriyosinler farklı inhibisyon spektrumlarına sahip olan farklı bakteriyosin üreten suşların sağlıklı farelerde etkisinin değerlendirilmesini sağlayan bir strateji sunuyoruz. Stratejimiz, bakteriyosin aracılı etkilerin bakteriyosin aracılı etkilerden farklılaşmasını sağlayan izogenik bakteriyosin olmayan mutantları farelere beslemeyi içerir. Dizilim 16S rDNA, bağırsaktaki bakteri popülasyonunun dinamik değişikliklerini izlemeyi sağlar. SubsDengi istatistiksel analiz, bakteriyel türler arasında ve ayrıca bakteri türleri ile ölçülen fizyolojik parametreler ( örn. Vücut ağırlığı, serum biyokimyasal parametreleri, vb. ) Arasındaki korelasyonları deşifre eder. Bu çalışmada sunulan protokolün canlı hayvanlardaki bakteriosinler üzerinde yapılan diğer probiyotik veya prebiyotik uygulamalar için de geçerli olduğuna inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bakım ve taşıma, uzmanlaşmış bir hayvan bakım biriminde yapılmalıdır. Burada açıklanan prosedürler, Avrupa Birliği Kanunu ve 2010/63 / AB ve İspanya Hükümeti RD 53/2013 tarafından korunan hayvanların korunması ile ilgili laboratuar hayvanlarının ilkelerini izleyerek Valencia Üniversitesi ve yerel makamların ilgili Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvan deneylerinde 3R ilkesine (Değiştirme, Azaltma, İnceleme) saygı duymak amacıyla bilimsel amaçlar için kullanılır.
1. Fare İnoküle Etmek İçin Kullanılan Dondurulmuş Bakteri Kültürleri
- LAB'nin bireysel suşlarını, 5 mL beyin-kalp infüzyonu (BHI) ortamında inoküle edin ve 30 ° C'de 20-24 saat boyunca (gece boyunca) büyütün.
- Her bir gece bakteri kültürü, 200 mL BHI'ye 2 mL gece kültür aktararak BHI içinde 100 kat seyreltin. Onları 30 ° C'de 20-24 saat boyunca büyütün.
NOT: Bu çalışmada kullanılan suşlar Tablo 1'de listelenmiştir. - Hasat ce5,000 xg'de 20 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüje tabi tutularak hazırlanır.
- Süpernatantı çıkarın ve 100 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) içinde her bir hücre pelletini askıya alınarak ve adım 1.3'deki gibi hücreleri toplayarak hücreleri iki kez yıkayın.
- İkinci yıkamadan sonra, her hücrenin pelletini 20 mL buz soğukluğundaki PBS içinde% 15 gliserol içinde erteleyin.
- Hücre süspansiyonunu tüplerde 1 mL'lik hacimlere bölün ve kullanana kadar -80 ° C'de saklayın.
NOT: Hücreler, bu noktadan sonra 1-2 ay içinde kullanılmalıdır. - Depolamadan önce ve uygulanmadan önce hücre sayısını belirleyin, böylece farelere verilen canlı hücrelerin sayısı bilinir.
- Hücre sayımı için, buzla soğutulmuş% 0.9 sodyum klorid (NaCl) solüsyonunda on kat seriler seyreltileri yapın. Her seyreltmenin 100 μL'ini bir BHI agar plakasına yayın. Kolonite oluşturan birimlerin (cfu) / mL'yi belirlemek için hücre büyümesi ve koloni oluşumu için 30 ° C'de gece boyunca (20-24 saat) inkübe edin;
- Bakteri içeren içme suyu elde etmek için her bir bakteri stok kültürünün hücrelerini, 10 9 / mL suyun son bir ortalama cfu'su ile steril, filtrelenmiş içme suyunda 100 mL'de inceltin. Bakteri sağkalımı değerlendirmesi için, seyreltmeden hemen sonra ve bakteri tedavisinin ilk iki haftasında haftada bir kez 24 saat sonra canlı hücreleri sayın.
2. Farelerde Deney ve Deneysel Tasarım
Not: Bu deney için spesifik patojen içermeyen (SPF) BALB / c genç dişi fareler (6-8 hafta) gereklidir; Burada toplam 100 hayvan satın alındı.
- Deney boyunca farelere topaklaşmış yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın.
- Deneyi tasarlayın ve gücü hesaplayın.
- Her tedavi kendi kontrolüne sahipse, eşleştirilmiş bir vaka kontrol tasarımı (t-testi) uygulayın. Belirlenecek en önemli etkinin (lerin) ortalama ve standart hatalarını hesaplamak için bir ön deney kullanın. Farklı yöntemleri ve serbestçe temin edilebilen programları kullanarak, tahlil gücünü ve grup başına gerekli hayvan sayısını optimize edin 11 .
- Bakteriyosin üreticisinin üretici olmayan suşlara olan etkilerini test etmek için deneysel durum başına 9 hayvan kullanın.
NOT: Bu sayı, deneysel standart hataya dayalı olarak belirlendi ve tatmin edici bir güç sağladı (0.7 - 1.0) ve anlamlılık düzeyi 0.05'in altına düştü.
NOT: Verilen örnekte, kafes başına bir tane olmak üzere 11 grup fare yapılmıştır. On kafeste, 5 bateriosin üreten suş ve karşılık gelen 5 izojenik üretmeyen suşla yapılan muamelelere karşılık gelmektedir; 11. kafeste 10 fare vardı ve tedavi edilmemiş kontrol oluşturdu.
- Farelerin hayvancılık tesislerine gelmesinden sonra kafeslere dağıtın ve bireysel takip için hayvanları kulak etiketi ile etiketleyin. Fareleri bir hafta önce yetiştirme tesislerine ve koşullarına göre ayarlayınroceeding.
- Adım 1.8'de anlatıldığı gibi, bakteri içeren içme suyunu hazırlayın ve içme suyu şişelerini, her bir kafesteki farelerin aynı su şişesini paylaşacak şekilde açıkça tanımlanan ilgili bağımsız kafeslere yerleştirin.
NOT: Kontrol grubu, test edilen bakterilerle temas ettirilmeden ayrı bir kafeste tutulmalıdır. - Her gün yeni içme suyuyla (100 mL) yeni bir şişe hazırlayın ve taze defrostlanmış bakteri süspansiyonları ekleyin. Bunu ardışık 15 gün boyunca yapın.
- Bakterilerin tedavisi, farelerin bakteri içermeyen su içtiği iki haftalık süreyle izleyin ( Şekil 1 ).
3. Örnek Toplama
- Dışkı örnekleri toplayın.
- Her fare için otoklavlanmış kafesleri (boş) ve steril forseps ve etiket steril 1.5-mL tüpler hazırlayın.
- Mikrobiyota ait bileşimlerde değişiklikleri önlemek için aynı gün içerisinde numuneler toplayın.Günde bir gün. En iyi sonucu elde etmek için, taze örnekleri ayrı ayrı toplayın.
NOT: Tercihen fareler spontan arındırmaya eğilimli olan sabah erken saatlerde dışkıyı topla. - Boş bir kafesin% 70 alkol ile temizlenmesi ve içinde fare yerleştirilmesi. Dışkılamasına izin verin ve steril forseps kullanarak 2 - 4 fekal pellet toplayın, bunları 1.5 mL tüplere yerleştirin.
NOT: Bazen fare kuyruğunu yukarı doğru tutmak yeterlidir; Dışkı anüsden doğrudan bir tüp içine toplanabilir. - Dört haftalık deneyde haftada bir kez fare numunelerini her fareden toplayın ( Şekil 1 ). Farelerin bakterilere maruz kalmasından hemen önce, ilk örnekleri birinci günde toplayın (T0, sıfır zaman). Aşağıdaki fekal numuneleri 7., 14., 21. ve 28. günlerde toplayın.
- Numuneleri, -80 ° C'de dondukları laboratuara nakledilene kadar 4 ° C'de soğutun. Önceden planlayın ve çok sayıda kutu olarak yeterli saklama kutusu sağlayınDeney sırasında numune alınır.
- Tüm fareleri fekal toplama gününde tartın.
- 15. günde tüm farelerden yüz damar, bakteri uygulama son gününde kan örnekleri toplamak, ve trigliserid, toplam kolesterol, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) seviyelerini belirlemek kan serumu.
NOT: Hayvanların stresini azaltmak için deneyimli personel kanı toplamalıdır.
4. LAB Sayımı ve Bakteriyosin Aktivitesi
- Her bir numunenin bir feçes pelletini 1.5 mL'lik bir tüpe koyun ve% 10 (w / v) bir solüsyon elde etmek için yeterli miktarda buz soğukluğunda% 0.9 NaCl ilave edin. 1.5 mL tüpler için fekal süspansiyonu homojenize etmek için steril mikropestleler kullanın ve buz soğukluğunda% 0.9 NaCI içinde on kat seri seyreltme hazırlayın.
- Toplam LAB hücresi sayısını sayın.
- Seyreltilmiş hücreleri (100 uL) 4 mL önceden ısıtılmış Ma'ya aktarınN Rogosa Sharpe (MRS) yumuşak agar (50 ° C,% 0.8 agar). Hücreleri katı MRS agar plakasına (% 1.5 agar) dökmeden önce karıştırın.
- Hücre büyümesi ve koloni oluşumu için hücreleri 20 - 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe etmeden önce kapağı steril kaputun içinde 5-10 dakika kapatıp kurutun.
- Bakteriyosin üreten hücreleri sayın.
- Seyreltilmiş hücreleri (100 uL) bakteriosin üreticisinin 4 mL sıcaklığında MRS yumuşak agara (50 ° C,% 0.8 agar) aktarın, vorteksleyerek karıştırın ve hücreleri bir MRS agar plakasına (% 1.5 agar) dökün; Bu katmana ilk katman denir.
- Tüm hücreleri yumuşak agar içine gömmek için birinci kat üzerine 4 mL'lik hücresiz MRS yumuşak agar (% 0.8 agar) ilave edin.
NOT: Bu katman, hücrelerin agar plakalarının yüzeyinde koloniler halinde büyümesini önlemek içindir. Yüzeyde büyüyen hücreler üstte gösterge hücreleri döküldüğünde kolayca yer değişir (adım 4.3.4) veSonuçların yorumlanmasını daha da zorlaştıracaktır. Bu katmana ikinci katman denir. - Hücre büyümesi ve koloni oluşumu için 20 - 24 saat süreyle 30 ° C'de inkübe etmeden önce kapağı steril kaputta 5-10 dakika kapatıp kurutun.
- Bakteriyosin üreten kolonileri tanımlamak için, Tablo l' de gösterildiği gibi uygun bir indikatör suşunun bir gece kültüründen 40 mL, 4 mL önceden ısıtılmış yumuşak agara karıştırın. Karışımı plakaya dökün; Bu katmana üçüncü katman denir.
- Hücre büyümesi ve koloni oluşumu için 20 - 24 saat süreyle 30 ° C'de inkübe etmeden önce kapağı steril kaputta 5-10 dakika kapatıp kurutun.
NOT: Bacteriocin üreten kolonilerin koloniler çevresinde berrak (inhibisyon) zonları vardır ( Şekil 2 ).
5. DNA Ekstraksiyonu, 16S rDNA Amplifikasyonu ve Sekanslama
NOT: Adımlar fVeya DNA ekstraksiyonu ticari bir kit ( örneğin, Realpure "SSS" Kiti) için açıklanmıştır.
- 1 - 2 fekal farelerin peletlerini (~ 200 mg) 300 μL çözünme solüsyonunda askıya alınız.
- Numuneyi, yaklaşık 0.5 g cam boncukların (çap: 0.1 mm) daha önce yerleştirildiği 2 mL'lik bir mikro tüp içine aktarın.
- Her bir numuneye 10 U / μL'de 1 μL mutanolisin ve 20 mg / mL'de 2 μL lizozim ekleyin ve 40 - 60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Dışkı örneklerinden DNA ekstraksiyonu için standart protokollerden biriyle devam edin 12 .
- Her biri 1 dk'lık iki döngü boncuk adımları uygulayın.
- 2 μL proteinaz K ekleyin ve iyice karıştırın.
- 20 dakika inkübe edin ve 5 dakikada bir girdaplayın.
- Örnekleri 37 ° C'ye soğutun ve numuneye 1 μL 5 μg / mL RNaz A ekleyin. Iyice karıştırın.
- 37 ° C'de 30 - 60 dakika inkübe edin.
- Örnekleri oda sıcaklığına soğutun ve 180 uLProtein çöktürme çözeltisi. 20-30 sn. Boyunca maksimum hızla vorteks uygulayın.
- 5 dakika boyunca 16.000 xg'de santrifüjleyin. Yüzeyde yüzen herhangi bir partikül varsa, numuneleri 5 dakika boyunca buzda inkübe edin ve sonra tekrar santrifüjleyin.
- DNA içeren süpernatantı 300 uL izopropanol içeren yeni bir 1.5 mL mikro tübe aktarın.
- Tüpleri 20-30 defa ters çevirerek karıştırın ve 1 saat boyunca -20 ° C'de inkübe edin. Alternatif olarak, tüpleri bir süre daha ( örneğin gece boyunca) inkübe edin.
- 2,000 dakika boyunca 16,000 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve tüp emici kağıt üzerine kurutun. DNA pelletini yıkamak için 300 μL% 70 etanol ilave edin.
- 1 dakika süreyle 16,000 xg'de santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve topağı yaklaşık 15 dakika kurumaya bırakın.
- Pelet kuruduktan sonra, 100 μL steril su veya Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) tamponu ilave edin ve topağı tekrar süspansiyon haline getirin.
- Olası engelleyici maddeleri ortadan kaldırmak içinSonraki adımlardaki bileşikler, DNA'yı temizleyin. Adım 5.15 için bağlanma koşullarını ayarlamak için ekstrakte edilmiş DNA'yı 2 hacim (200 uL) tampon NTI ile karıştırın.
- PCR temizleme sütunu içeren bir silika membran toplama tüpüne (2 mL) yerleştirin ve numuneyi yükleyin.
- 11,000 x g'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin. Akışı atın.
- Silika membranı 700 μL tampon NT3 ile yıkayın ve adım 5.16'yı tekrarlayın.
- Silika membran, NT3 yıkama tamponu ihtiva eden artık etanolü çıkarmak için 11,000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüje tabi tutarak kurutun.
- Kolonu, yeni bir 1.5 mL mikrotube'ye aktarın ve etanın tamamen çıkarılması için 70 ° C'de 2-5 dakika inkübe edin.
- 30 μL PCR sınıfı su ekleyin ve 5 dakika 70 ° C'de inkübe edin. 1 dakika süreyle 11,000 x g'de santrifüje tabi tutarak elute edin.
- Bir UV / Vis spektrofotometre veya florometrik bir yöntem kullanarak DNA'yı ölçün.
- Aynı kafesleri aynı fide paylaşan farelerdeki DNA örneklerini normalleştirin ve havuzlayın Ch zaman noktası.
- Zaman içindeki bireysel değişimleri gözlemlemek için, 0, 14 ve 28 günlerinde rasgele seçilen üç fareden kontrol ve diğer iki rastgele kafesden DNA örnekleri dizinleri.
6. 16S rRNA Gen Amplifikasyonu ve Dizilimi
- Güçlendirilmiş 16S rRNA genlerinin bir kütüphanesi hazırlayın. Bakteriyel 16S rRNA geni 5'in V3-V4 bölgesini, uygun çıkıntı adaptörleri ile ileri ve geri primerler kullanarak genişletin:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Güçlendirilmiş bantları% 1 agaroz jeli ile elektroforez kullanarak kontrol edin.
- Ammonik temizleme için manyetik boncuklar kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini temizleyin.
- Kullanılan kitlesel sıralama platformuna göre imalatçı tarafından belirtildiği şekilde aşağıdaki adımları uygulayın.> 6.
7. Veri Analizi ve İstatistik
- Kalite filtreleme (genellikle sıralama cihazlarında gerçekleştirilir).
- Ham okuma verilerini filtreleyin ve ekipmanla birlikte verilen yazılımı kullanarak de-multiplex yapın.
- USEARCH 14'te (sürüm 7.0.1090) uygulanan UPARSE boru hattı 13 kullanılarak eşleştirilmiş uçlu işlemleri işleyin. Eşleştirilmiş bitleri birleştirin ve maksimum beklenen hata (maksimum) değerini 1.0 kullanarak kaliteli filtreleme uygulayın. 150 nt'den daha az sekans atın. Singletons atmak için dizileri tekrarlayın.
- Sıraları% 97 dizilim kimliğinde operasyonel taksonomik birimlere (OTU'lar) kümeleyin ve kimerik dizileri filtrelemek için UCHIME 15'i kullanın.
- OTU toplama, taksonomik atama ve filogenetik yeniden yapılandırma, çeşitlilik analizi ve görselleştirme.
- OTU'ları Nicel Insights Int kullanarak işleyinMikrobik Ekoloji (QIIME) 16 .
- Temsil eden OTU'ları, en az% 75 (varsayılan) olan% PyNAST 18 kullanarak Greengenes çekirdek kümesi veritabanı 17'ye göre seçin ve hizalayın.
- Ribosomal Database Project (RDP) sınıflandırıcı programını 19 kullanarak 0,8'lik bir güvenle sıralama sıralarına taksonomi atayın.
- OTU tablosunu, en düşük sıra derinliği olan numunenin sıra sayımına göre normalize edin.
- Oldukça değişken bölgelerin ve tüm boşlukların konumlarının kaldırılması için filtreleme adımından sonra Hızlı Ağaç 20'yi kullanarak hizalı dizilerden bir filogenik ağaç oluşturun. Alfa ve beta çeşitliliklerini hesaplamak ve nemlilik eğrilerini ve Shannon indekslerini hesaplamak için bu ağacı kullanın.
- Ağırlıksız UniFrac mesafe metriklerini oluşturmak ve görselleştirmek için 21 , ilke koordinat analizi (PCoA) kullanın.
NOT: s içinİstatistik analizde, R 22 veya QIIME 16'da uygulanan istatistiksel araçlar gibi farklı yazılım paketleri kullanılabilir. - Farklı tedaviler arasındaki çeşitliliğin Shannon indekslerinin karşılaştırılması için, zamanı R'deki sürekli bağımlı değişken olarak düşünerek bir ANCOVA kullanın.
- İki taraflı Student's t-testi kullanarak QoEEM'deki PCoA'daki muameleler arasındaki mesafeleri karşılaştırın ve Bonferroni düzeltmesini kullanarak 1.000 Monte Carlo permütasyonuyla parametrik olmayan p-değerlerini hesaplayın.
- Pearson korelasyon analizi kullanarak belirli OTU'ların göreceli olarak bolluğu ile kolestrol, HDL, LDL, vs'nin serum düzeyleri gibi ölçülen diğer parametreler arasındaki korelasyonlar için analiz yapın. Bu amaçla, Cytoscape 3.1.1 24 kullanan korelasyon ağlarının sonraki görselleştirilmesinde CoNet 23'ü kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fırsatçı bakterilerin ve patojenlerin büyümesini önlediği varsayıldığı için, bakteriyosinlerin üretimi LAB'de olumlu bir probiyotik özellik olarak kabul edilmiştir. Bu çalışmanın amacı bakteriyosinlerin bir fare modelinde bağırsak mikrobiyotik popülasyonlarını modüle etme kapasitesini göstermektir. Bu amaçla, bakteriyosin üreten suşların ve izogenik üretmeyen suşların alımının etkisini karşılaştırmak için bir prosedür geliştirildi. İnokülasyon ve tahlilin süresi uzatılmasına ilişkin prosedür Şekil 1'de gösterilmektedir. Fareler on bir kafeste ayrıldı: herhangi bir işlem yapılmayan bir kontrol, beş adet bakteriyosin üreten suşu ile tedavi edilen beş kafes ve bakteriosin üretimini azaltan ya da hiç tutmayan karşılık gelen izogenik mutantlarla muamele edilmiş beş kafes. Test edilen bakteriyosin üreten LAB'nin yanı sıra, içme suyundaki ilgili sayımlar (cfu / mL) ve dışkılardaki sayılar aşağıda özetlenmiştir:
Şekil 1: Expe'nin Zaman Tablosu Tasarımını Gösteren Düzenriment. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Dışkılardan Elde Edilen LAB içerisindeki Bakteriyosin Üretiminin Üç Katmanlı Bir Protokolle Tespiti (Prosedürde Açıklanan Şekilde). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Bakteri Tedavilerinin Bileşiminin Karşılaştırılması. Bir ağırlıksız UniFrac matrisinde hesaplanan uzaklıklara dayalı olarak bir PCoA arsa oluşturuldu. Aynı örnekten farklı zaman noktaları ( ve diğerlerinden uyarlanmıştır . , 2016 12 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Tedavi ve Tedavi Sonrası Dönemlerde LAB ve Bakteriyosin-Hedefli Bakteri Gruplarının Cenevre Seviyelerindeki Bağıl Bereketindeki Değişiklikler. Değişiklik0 zamana göre elde edilen tedavilerdeki cinslerin göreceli bolluklarında, kontrol grubu (CON) ile karşılaştırıldı. Resimin netliği için sadece dört suş gösterilmiştir: garvisin ve sakacin üreticisi ve üretmeyen suşlar (şekli renk ve muamele ile ilişkilendirmek için bkz.). Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler. Önem derecesi aşağıdaki gibi temsil edilmektedir: Nokta ile P <0.1 (.); Bir yıldızla P <0.05 (*); İki yıldızlı p <0.01 (**). Umu ve diğerlerinden uyarlanmıştır . , 2016 12 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: OTU'ların Bağıl Bereketlerinin 14. Gün ve Serum Düzeylerinde Korelasyon Ağı. İlişkiler ca idiCoNet'de Pearson korelasyon kullanılarak hesaplandı. Ağda yalnızca önemli olanlar (P <0.05) gösterilmektedir. Serum total kolesterol ( Chol ), yüksek dansiteli lipoprotein ( HDL ), düşük yoğunluklu lipoprotein ( LDL ) ve trigliseridlerde ( Trig - ) belirlenen parametreler tek renk (gri) ile gösterilirken, farklı ailelere ait OTU'lar Farklı renkler (bakınız efsane) Pozitif korelasyonlar yeşil kenarlar ile ve negatif korelasyonlar kırmızı kenarlar ile gösterilir Düğümlerdeki OTU'lar, OTU numaraları veya ait oldukları cins ile temsil edilir Umu ve diğerleri , 2016'dan uyarlanmıştır 12 . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| İçme suyuna aşılanmış | Laktik asit bakterileri dışkıda sayılır | İndikatör suşları | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (ortalama log10) | |||
| KONTROL | ---- | 10 fareler | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 fare | 8.53 ± 0.18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) | 2.0 | 9 fare | 8.22 ± 0.05 | |
| Pediokcus asit öldürücü B1502 (ped +) | 26 | 9 fare | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 fare | 8.75 ± 0.09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 ağırlıkça +) | 6 | 9 fare | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 kürlenmiş) | 10 | 9 fare | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 fare | 9.14 ± 0.14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 fare | 8.60 ± 0.18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 fare | 8.41 ± 0.08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 fare | 8.05 ± 0.18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) SakA ve PedPA-1 için, Enterocins için Pediococcus damnosus (LMG 3397), Lactobacillus spp. Plantarisinler için 965 (LMG 2003) ve GarML için Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705). | ||||
Tablo 1: Aşılanmış Suşlar ve Dışkı Örneklerinde Sayımlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan prosedür, mikrobiyotik değişikliklerin sağlık veya yaşa bağlı olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Protokolün farklı kısımları önemlidir, ancak bunların arasında örnekleme, dizilenip analiz edilecek DNA parçasının seçimi ve DNA özütleme ve biyoinformatik analiz yapılması kesinlikle kritik noktalardır. Örnekleme önemlidir, çünkü etik nedenlerden ötürü farelere vurgu yapılmamalı ve bağırsaktaki bakteri oranını değiştirdiği bilinmektedir. Bazı bakteriler dehidrasyona ve / veya oksijene karşı çok hassastırlar, numuneler mümkün olduğunca çabuk işlenmeli veya kullanıma kadar dondurulmalıdır. Genişletilmiş 16S rRNA genlerinden dizilenecek DNA parçasının seçimi çok önemlidir. Bu çalışmada değişken bölgeler V3 - V4 seçilmiştir 25 . DNA ekstraksiyon yönteminin önemi, örneklerde bulunan bakteri hücrelerinin hepsi eq olmadığından olduğundan fazla tahmin edilmemelidirFarklı liziz protokollerine duyarlıdır ve bakteri popülasyonlarının tahmininde önyargılar, tamamlanmamış lizise bağlı olabilir. Bu nedenle, bir boncuk çırpıcı adımın başlatılması zorunludur. İzogenik suşlar genetik knockdown veya plazmid kürasyonuyla oluşturulabilir, ancak suşlar durumunda transformasyona dirençli olan kromozom kodlu bakteriyosinler bir problem oluşturabilir. Bu prosedür, anaerobik yöntemler 26 gibi farklı spesifik kültür teknikleri kullanılarak uyarlanabilir.
Prosedür, üzerinde çalışılacak faktör değişikliklerinin türüne bağlı olarak çoğu adımda değiştirilebilir. İnokülasyon prosedürü kısaltılabilir, ancak serum parametrelerindeki değişiklikler gelişmek için biraz zaman gerekebilir. Yöntemin olası bir kısıtlaması, su içinde birkaç saat hayatta kalamayan veya birikebilir (veya bileşikler için çökelebilir) bakteri soylarının (besinler veya bileşikler) çalışması olabilir. Dolayısıyla, bu bir zorunluluktur; Bu yüzden düşünülsün.
Şimdiye kadar, bakteriyosin aktivitesi genellikle in vitro 27 , 28 , 29 veya karışık kültürlerde 30 olarak tespit edildi . Bu yöntem, standart laboratuar farelerinin tüm bağırsak mikrobiyotlarından beş bakteriyosin aktivitesinin in vivo olarak izlenmesine izin vermiştir. Popülasyonlarda küçük varyasyonlar ve serum parametreleri 12 gibi diğer bakteri grupları üzerindeki etkileri veya fizyolojik faktörler belirlenebilir. Bakteriyosinler, taksonomik olarak ilgili bakterilerin büyümesini engelleyen nispeten dar bir aktivite spektrumuna sahiptir. Bununla birlikte, bazıları Sakacin A'daki gibi Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 ve hatta bazı Escherichia coli suşları için aktif olduklarından, bu tahlilde kullanılanlar en etkili etkilerdendirEşek = "xref"> 32. Farelerde inoküle edildiğinde, LAB üreten bakteriosinler, küresel mikrobiyot kompozisyonunda belirgin değişiklikler oluşturmazlar, daha ziyade az sayıda bakteri taksonuna neden olurlar. Bununla birlikte, küresel korelasyon ağı analizi, ilginç ekolojik uyumluluk ve farklı bakteriler arasındaki karşıtlığı ortaya koymuştur. Bu yöntem, gıda bileşenlerinin, ilaçların veya diğer bileşiklerin etkisini analiz etmek için uyarlanabilir ancak beklenen sonuç, sağlıklı koşulları korumak için bilinçli olarak kısıtlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, AEA Grant NILS Bilim ve Sürdürülebilirlik Koordinasyonlu Araştırmacılar Hareketliliğine (referans 017-ABEL-CM-2013) teşekkür etmek istiyorlar. CB ve GP-M. İspanya Ekonomi ve Rekabetçilik Bakanlığı'ndan AGL2015-70487-P hibe ile desteklendi. OCOU ve DBD Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi (NMBU) gıda bilim araştırması için stratejik bir burs programı tarafından desteklendi (proje 1205051025). Hayvan bakımında ve örneklemeyle ilgili yardımıyla Inmaculada Noguera'ya ve hayvan tesisindeki laboratuar malzemelerinin bulunabilirliğini sağlamak için yaptığı İsa Dehesa'ya da teşekkür ederiz. Profesör Lars-Gustav Snipen'e istatistik konusundaki tavsiyeleri için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C.
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J.
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
