Summary
Bakteriociner menes at spille en central rolle i at definere mikrobiell mangfoldighed i forskellige økologiske nicher. Her beskriver vi en effektiv procedure til vurdering af, hvordan bakteriociner påvirker tarmmikrobiotasammensætningen i en dyremodel.
Abstract
Meget spændende spørgsmål opstår med vores fremadgående viden om gutmikrobiotasammensætning og forholdet til sundhed, især med hensyn til de faktorer, der bidrager til at opretholde befolkningsbalancen. Der er dog begrænsede tilgængelige metoder til evaluering af disse faktorer. Bakteriociner er antimikrobielle peptider produceret af mange bakterier, der kan give en konkurrencemæssig fordel for fødevareopkøb og / eller niche-etablering. Mange probiotiske mælkesyrebakterier (LAB) -stammer har stort potentiale til at fremme menneskers og dyrs sundhed ved at forhindre vækst af patogener. De kan også bruges til immunomodulation, da de producerer bakteriociner. Imidlertid bestemmes den antagonistiske aktivitet af bakteriociner normalt ved laboratorie bioassays under veldefinerede, men overforenklede betingelser sammenlignet med det komplekse tarmmiljø hos mennesker og dyr, hvor bakterier står over for multifaktoriale påvirkninger fra værten og hundredvis af mikrobielle arter sHaring den samme niche. Dette værk beskriver en komplet og effektiv procedure til vurdering af effekten Af en række bakteriociner med forskellige målspecificiteter i et murinsystem. Ændringer i mikrobiotasammensætningen under bakteriocinbehandlingen overvåges under anvendelse af 16S rDNA-sekvensbestemmelse. Vores tilgang benytter både bakteriocinproducenterne og deres isogene ikke-bakteriocinproducerende mutanter, idet sidstnævnte giver mulighed for at skelne bakteriocinrelateret fra ikke-bakteriocinrelaterede modifikationer af mikrobiota. Fekal DNA-ekstraktionen og 16S rDNA-sekventeringsmetoderne er konsistente og udgør sammen med bioinformatikken en stærk fremgangsmåde til at finde svage ændringer i bakterieprofilerne og etablere korrelationer, hvad angår kolesterol og triglyceridkoncentration mellem bakteriepopulationer og sundhedsmarkører. Vores protokol er generisk og kan således bruges til at studere andre forbindelser eller næringsstoffer med potentialet til at ændre værtsmikrofonenRobiota-sammensætning, enten ved undersøgelse af toksicitet eller gavnlige virkninger.
Introduction
Bakteriociner er antimikrobielle peptider fremstillet af en bred vifte af bakteriearter 1 , 2 . Disse forbindelser og deres producenter, især LAB, er blevet udforsket og udnyttet verden over i årtier for deres potentielle anvendelser i fødevarebevarelse og medicin 3 . Flere bakteriociner er kendt for at dræbe vigtige patogener, herunder arter af Listeria, Enterococcus, Staphylococcus og Bacillus . Nogle bakteriociner har endda evnen til at modulere immunresponset 4 . Mange bakteriociner har relativt snævre spektra, en egenskab, der er meget værdsat i nogle applikationer. For eksempel kan nogle smalspektrede bakteriociner anvendes til at lede specifik aktivitet mod udvalgte grupper af problematiske bakterier uden stor forstyrrelse på kommensal eller gavnlig flora, der deler samme niche; Dette er især vigtigt i tarmenOnment, hvor mange gavnlige mikrober trives på en interaktiv og dynamisk måde 5 . Bakteriociner er også meget attraktive til profylaktisk eller probiotisk anvendelse, da de kan undertrykke (ud) vækst af patogener, patobioner eller opportunistiske bakterier, der kan ubalancere tarmhomeostasen 6 , 7 .
Med hensyn til deres natur og fysisk-kemiske egenskaber er bakteriociner meget forskellige, da de har forskellige strukturer, målspecifikiteter, virkningsmåder mv. De fleste bakteriociner er blevet undersøgt meget detaljeret i in vitro- indstillinger, men meget få er blevet testet i fødevarer Matricer 8 , 9 eller in vivo, såsom i en dyrecut 6 , 10 . In vitro- egenskaberne kan i høj grad afvige, når de vurderes in vivo på grund af kompleksiteten oF tarmmiljøet og også til formodede utilsigtede virkninger på gavnlige bakterier. De fleste probiotika er LAB. De producerer en række andre metabolitter, herunder kortkædede fedtsyrer, som er kendt for at påvirke værtsens fysiologi, samt at demonstrere antimikrobielle egenskaber mod bestemte bakterier. Derfor er det i tilfælde af probiotiske stammer, der producerer bakteriociner, bedst at etablere realistiske analyser, såsom sunde dyr med normal mikrobiota.
I den foreliggende undersøgelse giver vi en strategi, der muliggør vurdering af virkningen af forskellige bakteriocinproducerende stammer, hvis bakteriociner har forskellige hæmmende spektre på raske mus. Vores strategi omfatter fodring af mus med isogene ikke-bakteriocinmutanter, som muliggør differentiering af bakteriocin-medierede effekter fra ikke-bakteriocin-medierede effekter. Sekventering 16S rDNA giver mulighed for at følge de dynamiske ændringer af bakteriepopulationen i tarmen. SubsÆkvivalent statistisk analyse bestemmer korrelationer mellem bakteriearter og også mellem bakteriearter og målte fysiologiske parametre ( fx kropsvægt, serumbiokemiske parametre osv. ). Vi mener, at protokollen, der præsenteres i denne undersøgelse, også kan anvendes på andre probiotiske eller præbiotiske anvendelser ud over undersøgelsen af bakteriociner hos levende dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje og håndtering skal udføres på en specialiseret dyreplejeproduktion. De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af den tilsvarende etiske komité for universitetet i Valencia og de lokale myndigheder efter principperne om laboratoriedyrpleje obligatorisk i henhold til EU-lovgivningen og 2010/63 / EU og den spanske regering RD 53/2013 om beskyttelse af dyr Anvendt til videnskabelige formål for at respektere 3R-princippet i dyreforsøg (erstatning, reduktion, forfining).
1. Frosne bakteriekulturer bruges til at inokulere mus
- Inokulere individuelle stammer af LAB i 5 ml hjerne-hjerte infusion (BHI) medium og dyrk dem i 20-24 timer (natten over) ved 30 ° C.
- Fortyn hver bakteriekultur over natten 100 gange i BHI ved at overføre 2 ml overnight kultur til 200 ml BHI. Voks dem ved 30 ° C i 20-24 timer.
BEMÆRK: Stammer anvendt i denne undersøgelse er angivet i tabel 1. - Harvest ceLls ved centrifugering ved 5.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og vask cellerne to gange ved at suspendere hver cellepille i 100 ml iskold fosfatbufferet saltvand (PBS) og opsamle cellerne som i trin 1.3.
- Efter den anden vask suspenderes hver cellepille i 20 ml iskold 15% glycerol i PBS.
- Aliquot cellesuspensionen i 1 ml volumener i rør og opbevar dem derefter ved -80 ° C indtil brug.
BEMÆRK: Celler bør anvendes inden for 1-2 måneder efter dette punkt. - Bestem celle nummeret før opbevaring og forud for administration, så antallet af levende celler givet til mus er kendt.
- Til celletælling fremstilles ti gange serielle fortyndinger af celler i iskold 0,9% natriumchlorid (NaCl) opløsning. Spred 100 μl af hver fortynding på en BHI agarplade. Inkubér natten over (20-24 timer) ved 30 ° C til cellevækst og kolonidannelse, sidstnævnte til bestemmelse af kolonidannende enheder (cfu) / ml.
- For at gøre bakterierholdigt drikkevand, fortyndes celler fra hver bakteriel bestandskultur i 100 ml sterilt filtreret drikkevand med en endelig gennemsnitlig cfu på 10 9 / ml vand. Ved bakteriel overlevelsesvurdering tæller levende celler lige efter fortynding og efter 24 timer en gang om ugen i de første to uger af bakteriebehandling.
2. Mus Assay og eksperimentelle Design
Bemærk: Specifikke patogenfrie (SPF) BALB / c unge hunmus (6 - 8 uger) er nødvendige for dette forsøg; Her blev i alt 100 dyr købt.
- Giv musene fri adgang til pelleteret mad og vand gennem hele eksperimentet.
- Design eksperimentet og beregne effekten.
- Hvis hver behandling har sin egen kontrol, skal du anvende et parret case-control design (t-test). Brug en foreløbig analyse til at beregne middel- og standardfejlen for den vigtigste effekt (er), der skal bestemmes. Optimer effekten af analysen og antallet af dyr, der kræves pr. Gruppe ved hjælp af forskellige metoder og frit tilgængelige programmer 11 .
- For at teste for virkningerne af bakteriocinproducenten versus ikke-producentstammer, brug 9 dyr pr. Eksperimentel tilstand.
BEMÆRK: Dette tal blev bestemt ud fra den eksperimentelle standardfejl og gav en tilfredsstillende effekt (0,7-1,0) og et signifikansniveau under 0,05.
BEMÆRK: I det givne eksempel blev 11 grupper af mus lavet, en pr. Bur. Ti bure svarede til behandlingerne med 5 bateriocinproducerende stammer og de tilsvarende 5 isogene ikke-producerende stammer; den 11. bur havde 10 mus og udgjorde den ubehandlede kontrol.
- Efter ankomsten af musene til husdyrholdet fordeler dem i bur og øremærkning dyrene for at muliggøre individuel sporing. Akklimatisere musene til husdyrhold og betingelser for en uge før proceeding.
- Forbered bakterieholdigt drikkevand, som beskrevet i trin 1.8, og læg drikkeflasker i de tilsvarende uafhængige bur, der er tydeligt identificeret, så musene i hvert bur deler den samme vandflaske.
BEMÆRK: Kontrolgruppen skal opbevares i et separat bur, uden kontakt med de testede bakterier. - Klargør en ny flaske med frisk drikkevand (100 ml) hver dag og tilsæt nyopfrostede bakteriesuspensioner. Gør dette i 15 sammenhængende dage.
- Følg bakteriebehandlingen med en periode på to uger, i hvilken periode musene drikker bakteriefrit vand ( Figur 1 ).
3. Indsamling af prøver
- Indsamle fækale prøver.
- Forbered autoklaverede bur (tom) og sterile tang og mærke sterile 1,5 ml rør til hver mus.
- Saml prøver på samme tid på dagen for at undgå variationer i mikrobiotasammensætning i løbet af dagenI løbet af en dag. For optimale resultater opsamles friske prøver separat.
BEMÆRK: Indsamle afføring fortrinsvis tidligt om morgenen, når mus er tilbøjelige til at defekte sig spontant. - Rens et tomt bur med 70% alkohol og læg en mus inde. Tillad det at afværge, og saml 2-4 fækalpellets ved hjælp af sterile pincett, og placér dem i 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Nogle gange er det nok at holde musens hale opad; Afføringen kan derefter indsamles direkte fra anus til et rør. - Saml fækalprøver fra hver mus en gang om ugen i løbet af fire uger eksperimentet ( Figur 1 ). Saml de første prøver på dag ét (T0, tid nul), lige før musens eksponering for bakterier. Saml følgende fækale prøver på dag 7, 14, 21 og 28.
- Køle prøverne ved 4 ° C indtil deres transport til laboratoriet, hvor de fryses ved -80 ° C. Planlæg på forhånd og sørg for tilstrækkelige opbevaringsbokse, som et stort antal feCal prøver vil blive samlet under eksperimentet.
- Vejer alle mus hver uge på fecal indsamlingsdag.
- Indsamle blodprøver fra ansigtets vene fra alle mus på 15. dag, den sidste dag af bakterier administration, og bestemme niveauet af triglycerider, total cholesterol, high-density lipoprotein (HDL), og lavdensitetslipoprotein (LDL) i Blodserum.
BEMÆRK: Erfarne medarbejdere skal samle blodet for at reducere stress i dyrene.
4. LAB Counting og Bacteriocin Activity
- Væg en fækal pellet af hver prøve i et 1,5 ml rør og tilsæt et tilstrækkeligt volumen iskold 0,9% NaCl for at opnå en 10% (w / v) opløsning. Brug sterile mikropestler til 1,5 ml rør for at homogenisere fækal suspensionen og forberede ti gange serielle fortyndinger i iskold 0,9% NaCl.
- Tæl det samlede antal LAB celler.
- Overfør fortyndede celler (100 μl) til 4 ml forvarmet maN Rogosa Sharpe (MRS) blød agar (50 ° C, 0,8% agar). Bland ved vortexing, inden der hældes cellerne på en solid MRS agarplade (1,5% agar).
- Tør pladen ved at tage låget af i 5-10 minutter i den sterile hætte før inkubering af cellerne i 20-24 h ved 30 ° C til cellevækst og kolonidannelse.
- Tæl bakteriocinproducerende celler.
- Overfør fortyndede celler (100 μl) af bakteriocinproducenten til 4 ml forvarmet MRS blød agar (50 ° C, 0,8% agar), bland ved vortexing og hæld cellerne på en MRS agarplade (1,5% agar); Dette lag benævnes det første lag.
- Overfør endnu 4 ml cellefri MRS blød agar (0,8% agar) på det første lag for at indlejre alle celler i den bløde agar.
BEMÆRK: Dette lag er beregnet til at forhindre, at celler vokser som kolonier på overfladen af agarpladerne. Celler, der vokser på overfladen, kan let forskydes, når de hælder indikatorceller på toppen (trin 4.3.4) ogVil derfor komplicere fortolkningen af resultaterne. Dette lag benævnes det andet lag. - Tør pladen ved at tage låget af i 5-10 minutter i den sterile hætte før inkubering i 20-24 h ved 30 ° C til cellevækst og kolonidannelse.
- For at identificere bakteriocinproducerende kolonier blandes 40 μl af en overnightkultur af en passende indikatorstamme som vist i tabel 1 med 4 ml forvarmet blød agar. Hæld blandingen på pladen; Dette lag benævnes det tredje lag.
- Tør pladen ved at tage låget af i 5-10 minutter i den sterile hætte før inkubering i 20-24 h ved 30 ° C til cellevækst og kolonidannelse.
BEMÆRK: Bakteriocinproducerende kolonier har klare (hæmmende) zoner omkring kolonierne ( figur 2 ).
5. DNA-ekstraktion, 16S-rDNA-amplifikation og sekventering
BEMÆRK: Trin fEller DNA-ekstraktion er beskrevet for brug af et kommercielt kit ( f.eks. Realpure "SSS" Kit).
- Suspension 1 - 2 fækale muspellets (~ 200 mg) i 300 μl lysisopløsning.
- Overfør prøven til en 2 ml mikrotube, hvor ca. 0,5 g glasperler (diameter: 0,1 mm) tidligere er blevet anbragt.
- Tilsæt 1 μl mutanolysin ved 10 U / μl og 2 μl lysozym ved 20 mg / ml til hver prøve og inkuber ved 37 ° C i 40-60 min. Fortsæt med en af standardprotokollerne for DNA-ekstraktion fra fækale prøver 12 .
- Påfør to cykler af perle-beater trin, 1 min hver.
- Tilsæt 2 μl proteinase K og bland grundigt.
- Inkubér i 20 minutter og hvirvel hver 5 min.
- Afkølet prøverne til 37 ° C og tilsæt 1 μL 5 μg / ml RNase A til prøven. Bland grundigt.
- Inkuber ved 37 ° C i 30 - 60 minutter.
- Afkølet prøverne til stuetemperatur og tilsæt 180 μLAf proteinudfældningsopløsning. Vortex kraftigt ved maksimal hastighed i 20 - 30 s.
- Centrifuge ved 16.000 xg i 5 minutter. Hvis der er nogen partikler, der flyder i supernatanten, inkuberes prøverne i is i 5 minutter og derefter centrifugeres igen.
- Overfør supernatanten indeholdende DNA'et til en ny 1,5 ml mikrotube indeholdende 300 μl isopropanol.
- Bland ved at invertere rørene 20-30 gange og inkuber i 1 time ved -20 ° C. Alternativt inkuberer rørene længere tid ( f.eks. Natten over).
- Centrifuge ved 16.000 xg i 2 min.
- Fjern supernatanten og tør røret på absorberende papir. Tilsæt 300 μl 70% ethanol for at vaske DNA-pellet.
- Centrifuger ved 16.000 xg i 1 min, fjern supernatanten og lad pelleten tørre i ca. 15 minutter.
- Når pellet er tør, tilsættes 100 μl sterilt vand eller Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) buffer og resuspender pelleten.
- For at eliminere eventuelle hæmmendeForbindelser under efterfølgende trin, rengør DNA'et. Bland ekstraheret DNA med 2 volumener (200 μl) buffer NTI for at justere bindingsbetingelserne for trin 5.15.
- Anbring en silicamembranholdig PCR-oprydningskolonne i et opsamlingsrør (2 ml) og lad prøven oplade.
- Centrifuge i 30 s ved 11.000 x g. Kassér gennemstrømningen.
- Vask silicamembranen med 700 μl buffer NT3 og gentag trin 5.16.
- Tør siliciummembranen ved centrifugering i 1 minut ved 11.000 xg for at fjerne eventuel resterende ethanolholdig vaskebuffer NT3.
- Overfør søjlen til en ny 1,5 ml mikrotube og inkuber i 2-5 minutter ved 70 ° C til total fjernelse af ethanol.
- Tilsæt 30 μl PCR-vand og inkuber i 5 minutter ved 70 ° C. Eluer ved centrifugering i 1 min ved 11.000 x g.
- Kvantificere DNA'et ved anvendelse af et UV / Vis spektrofotometer eller en fluorometrisk metode.
- Normaliser og pool DNA-prøver fra mus, der deler samme bur på ea Ch tidspunkt.
- For at observere individuelle variationer i løbet af tiden, sekvens DNA prøver fra tre tilfældigt udvalgte mus fra kontrollen og to andre tilfældige bur på dag 0, 14 og 28.
6. 16S rRNA-genforstærkning og sekventering
- Forbered et bibliotek med amplificerede 16S rRNA gener. Forstærk V3-V4-regionen i det bakterielle 16S rRNA-gen 5 ved hjælp af fremad- og reverse-primere med passende overhængskort:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Tjek de amplificerede bånd ved hjælp af elektroforese med 1% agarosegel.
- Rengør polymerasekædereaktionsprodukterne (PCR) ved hjælp af magnetiske perler til amplikonrensning.
- Fortsæt med de følgende trin som angivet af producenten i henhold til den anvendte massive sekventeringsplatform> 6.
7. Data analyse og statistik
- Kvalitet filtrering (normalt udført ved sekventeringsfaciliteter).
- Filtrer den rå læser data og de-multiplex ved hjælp af den software, der følger med udstyret.
- Behandle den parrede ende læser ved hjælp af UPARSE-rørledningen 13 implementeret i USEARCH 14 (version 7.0.1090). Flet de parrede ender og anvend kvalitetsfiltrering ved hjælp af en maksimal forventet fejl (maxee) værdi på 1,0. Kassere sekvenser mindre end 150 nt. Dereplicate sekvenser for at kassere singletoner.
- Klyng sekvenserne i operationelle taxonomiske enheder (OTU'er) på en 97% sekvensidentitet og brug UCHIME 15 til at filtrere kimære sekvenser.
- OTU plukning, taksonomisk opgave og fylogenetisk rekonstruktion og mangfoldighedsanalyser og visualiseringer.
- Behandle OTU'erne ved hjælp af Quantitative Insights IntO Mikrobiel økologi (QIIME) 16 .
- Vælg og juster de repræsentative OTU'er mod Greensens kerneindstillingsdatabase 17 ved hjælp af PyNAST 18 med en mindste identitet på 75% (standard).
- Tildel taksonomi til de justerede sekvenser ved hjælp af Ribosomal Database Project (RDP) klassificeringsprogrammet 19 med en tillid på 0,8.
- Normaliser OTU-tabellen til sekvensantalet af prøven med den laveste sekvensdybde.
- Opbyg et filogen træ fra justerede sekvenser ved hjælp af Fast Tree 20 efter filtreringstrinnet for at fjerne meget variable regioner og stillinger, der er alle huller. Brug dette træ til at beregne alfa- og beta-diversiteter og beregne sjældne kurver og Shannon-indekser.
- For at generere og visualisere uvægtede UniFrac-afstandsmetre 21 , skal du bruge princippet koordinatanalyse (PCoA).
BEMÆRK: For sTATISTISKE analyse, forskellige software-pakker kan anvendes, såsom R22 eller de statistiske værktøjer implementeret inden QIIME 16. - Til sammenligning af Shannon indekser af mangfoldighed mellem de forskellige behandlinger, brug en ANCOVA, idet tiden betragtes som en kontinuert afhængig variabel i R.
- Sammenlign afstanden mellem behandlinger i PCoA i QIIME ved hjælp af en tosidet Students t-test og beregne de ikke-parametriske p-værdier med 1.000 Monte Carlo-permutationer ved hjælp af Bonferroni-korrektionen.
- Analyser for korrelationer mellem den relative overflod af specifikke OTU'er og andre målte parametre, såsom serumniveauer af kolesterol, HDL, LDL, etc. ved anvendelse af Pearson korrelationsanalyse. Brug derfor CoNet 23 med den efterfølgende visualisering af korrelationsnetværk ved hjælp af Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen af bakteriociner er blevet betragtet som en positiv probiotisk funktion i LAB, da det antages at forhindre væksten af opportunistiske bakterier og patogener. Formålet med dette arbejde var at vise bakteriocins evne til at modulere tarmmikrobiotapopulationer i en musemodel. Til dette formål blev der udviklet en procedure til sammenligning af effekten af indtaget af bakteriocinproducerende stammer og deres isogene ikke-producerende stammer. Fremgangsmåden til inokuleringen og tidsforlængelsen af analysen er vist i figur 1 . Mus blev grupperet i elleve bure: en kontrol uden behandling, fem bur behandlet med bakteriocinproducentstammer og fem bure behandlet med de tilsvarende isogene mutanter, der har reduceret eller ingen bakteriocinproduktion. Det testede bakteriocinproducerende LAB, såvel som de respektive tællinger (cfu / ml) i drikkevand og tæller i afføring er opsummeret i
Figur 1: Skema Viser Time Course Design af Experiment. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Påvisning af bakteriecinproduktion i LAB Gendannet fra fæces ved en trelagsprotokol (som beskrevet i proceduren). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af sammensætningen af bakteriebehandlinger. Et PCoA-plot blev genereret ud fra de beregnede afstande i en uvægtet UniFrac-matrix. Forskellige tidspunkter fra samme prøve ( et al. , 2016 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ændringer i den relative mængde af LAB og bakterierocin-målrettede bakteriegrupper på slægtsniveauet under behandlings- og efterbehandlingstiderne. Lave omS i de relative mængder af slægter i behandlinger opnået med hensyn til tid 0, blev sammenlignet med dem i kontrolgruppen (CON). For tydeliggørelse af illustrationen vises kun fire stammer: garvicin- og sakacinproducent og ikke-producentstammer (se legenden i figuren for at forholde farve og behandling). Fejlstænger repræsenterer standardafvigelsen. Betydningsgrad er repræsenteret som følger: P <0,1 med prik (.); P <0,05 med en stjerne (*); P <0,01 med to stjerner (**). Tilpasset fra Umu et al. , 2016 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Korrelationsnetværk af relative overlevelser af OTU'er på dag 14 og serumniveauer. Korrelationerne var ca.Beregnet ved hjælp af Pearsons korrelation i CoNet. Kun de signifikante (P <0,05) vises på netværket. Parametre bestemt i serum - total cholesterol ( Chol ), højdensitetslipoprotein ( HDL ), lavdensitetslipoprotein ( LDL ) og triglycerider ( Trig - er vist med en farve (grå), mens OTU'er tilhørende forskellige familier er repræsenteret af Forskellige farver (se legenden) Positive korrelationer vises med grønne kanter og negative korrelationer med røde kanter. OTU'er på noderne er repræsenteret med OTU-numre eller slægten de tilhører. Tilpasset fra Umu et al. , 2016 12 . Klik her for at se en større version af denne figur.
| Inokuleret i drikkevand | Mælkesyrebakterier tæller i afføring | Indikatorstammer | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (gennemsnitlig log10) | |||
| KONTROLLERE | ---- | 10 mus | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 mus | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA-) | 2,0 | 9 mus | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 mus | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 mus | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 mus | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 cured -) | 10 | 9 mus | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 mus | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 mus | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 mus | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 mus | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) til SakA og PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) for enterociner, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) for plantariciner og Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) til GarML. | ||||
Tabel 1: Inokulerede stammer og tællerne i fækale prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den her beskrevne procedure er blevet brugt til at bestemme, om ændringer i mikrobiota er bundet til helbred eller alder. Forskellige dele af protokollen er vigtige, men blandt dem kan prøveudtagning af fæces, valg af DNA-fragmentet, der sekventeres og analyseres, og udførelse af DNA-ekstraktion og bioinformatisk analyse sikkert være de mest kritiske punkter. Prøveudtagning er afgørende, fordi mus af etiske årsager ikke bør stresses, og fordi det vides at ændre mængden af bakterier i tarmen. Prøver skal behandles hurtigst muligt eller skal fryses indtil brug, da nogle bakterier er meget følsomme overfor dehydrering og / eller ilt. Valget af DNA-fragmentet, der skal sekventeres fra de amplificerede 16S rRNA-gener, er et afgørende punkt. I dette arbejde blev de variable regioner V3 - V4 valgt 25 . Betydningen af DNA-ekstraktionsmetoden må ikke undervurderes, da bakterieceller, der er til stede i prøverne, ikke er alle eqUalt følsomme for forskellige lysisprotokoller, og biaser ved estimeringen af bakteriepopulationerne kan skyldes ufuldstændig lysis. Derfor er indførelsen af et beadblade-trin påkrævet. Isogene stammer kan konstrueres ved genetisk knockdown eller ved plasmidkurering, selv om der i tilfælde af stammer kan ildfaste til transformationskromosomkodede bakteriociner være et problem. Denne fremgangsmåde kan tilpasses under anvendelse af forskellige specifikke dyrkningsteknikker, såsom anaerobe metoder 26 .
Fremgangsmåden kan ændres i de fleste trin afhængigt af typen af faktorændringer, der skal undersøges. Inokuleringsproceduren kan forkortes, men ændringer i serumparametre kan have brug for noget tid til udvikling. En mulig begrænsning af metoden kunne være undersøgelsen af bakteriestammer (næringsstoffer eller forbindelser), som ikke kan overleve flere timer i vand, eller som kan klumpe (eller bundfælde til forbindelser). Derfor er dette en faktor, der må al Så overvejes.
Indtil nu er bakteriocinaktivitet generelt bestemt in vitro 27 , 28 , 29 eller i blandede kulturer 30 . Denne metode har muliggjort in vivo overvågning af aktiviteterne af fem bakteriociner fra hel-gut-mikrobioten af standard laboratoriemus. Små variationer i populationer kunne bestemmes, såvel som deres indflydelse på andre bakteriegrupper eller fysiologiske faktorer, ligesom serumparametre 12 . Bakteriociner har et relativt snævert aktivitetsspektrum, der hæmmer væksten af taksonomisk beslægtede bakterier. Imidlertid er de der anvendes i dette assay blandt de mest effektive, da nogle af dem er aktive mod Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 , og endda nogle stammer af Escherichia coli , som i tilfældet med sakacin AAss = "xref"> 32. Når de blev inokuleret i mus, gav LAB-producerende bakteriociner ikke anledning til bemærkelsesværdige ændringer i den globale mikrobiotasammensætning, men snarere til et reduceret antal bakterielle taxa. Ikke desto mindre afslørede den globale korrelationsnetværksanalyse interessante økologiske kompatibiliteter og modsætning mellem forskellige bakterier. Denne metode kan tilpasses til at analysere virkningen af fødevarebestanddele, lægemidler eller andre forbindelser, selv om det forventede resultat må bevidst begrænses til at bevare sunde forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke EEA Grant NILS Videnskab og Bæredygtighed Koordineret Mobilitet for Forskere (referencen 017-ABEL-CM-2013). CB og GP-M. Blev støttet af AGL2015-70487-P tilskud fra det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne. OCOU og DBD blev støttet af et strategisk stipendiumsprogram for fødevareforskning fra det norske universitets biovidenskab (NMBU) (projekt 1205051025). Vi vil også gerne takke Inmaculada Noguera for hendes hjælp med dyrepleje og prøveudtagning og Jesus Dehesa for hans hjælp med at sikre tilgængeligheden af laboratoriematerialer i dyreanlægget. Vi værdsætter også professor Lars-Gustav Snipen for hans råd om statistik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C.
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J.
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
