Summary
Bacteriocinen zijn van mening dat ze een sleutelrol spelen bij het definiëren van microbiële diversiteit in verschillende ecologische niches. Hier beschrijven we een efficiënte procedure om te beoordelen hoe bacteriocinen invloed hebben op de darmmicrobiota samenstelling in een diermodel.
Abstract
Zeer intrigerende vragen ontstaan door onze vooruitgangskennis over de microbiota samenstelling van de darm en de relatie met de gezondheid, met name met betrekking tot de factoren die bijdragen tot het behoud van het bevolkingsbalans. Er zijn echter beperkte beschikbare methodologieën om deze factoren te evalueren. Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door vele bacteriën die een concurrentievoordeel voor voedselverwerving en / of niche-vestiging kunnen veroorzaken. Veel probiotische melkzuurbacteriën (LAB) stammen hebben een groot potentieel om de gezondheid van mens en dier te bevorderen door de groei van pathogenen te voorkomen. Ze kunnen ook gebruikt worden voor immunomodulatie, omdat ze bacteriocinen produceren. Echter, de antagonistische activiteit van bacteriocinen wordt normaal gesproken bepaald door laboratorium bioassays onder goed gedefinieerde maar over vereenvoudigde condities in vergelijking met de complexe darmomgeving bij mensen en dieren, waar bacteriën multifactoriale invloeden uit de gastheer en honderden microbiële soorten s hebbenDezelfde niche hebben. Dit werk beschrijft een volledige en efficiënte procedure om het effect te beoordelen Van een verscheidenheid aan bacteriocinen met verschillende doelspecificiteiten in een muizenstelsel. Veranderingen in de microbiota samenstelling tijdens de bacteriocine behandeling worden gecontroleerd met behulp van composities 16S rDNA sequencing. Onze aanpak maakt gebruik van zowel de bacteriocinproducenten als hun isogene, niet-bacteriocine-producerende mutanten, waarbij de laatstgenoemde het vermogen geeft om bacteriocine-gerelateerd te maken van niet-bacteriocinverwante modificaties van de microbiota. De fecale DNA-extractie en 16S rDNA sequencing methoden zijn consistent en vormen samen met de bioinformatica een krachtige procedure om zwakke veranderingen in de bacteriële profielen te vinden en om correlaties te bepalen in termen van cholesterol en triglyceride concentratie tussen bacteriepopulaties en gezondheidsmarkers. Ons protocol is generisch en kan dus gebruikt worden om andere verbindingen of voedingsstoffen te bestuderen met de mogelijkheid om de gastheermicro te veranderenRobiota samenstelling, hetzij bij het bestuderen van toxiciteit of gunstige effecten.
Introduction
Bacteriocinen zijn antimicrobiële peptiden geproduceerd door een breed scala van bacteriële species 1 , 2 . Deze verbindingen en hun producenten, met name LAB, zijn al decennia wereldwijd verkend en geëxploiteerd voor hun mogelijke toepassingen in voedselbehoud en medicijnen 3 . Verschillende bacteriocinen zijn bekend om belangrijke pathogenen te doden, waaronder soorten Listeria, Enterococcus, Staphylococcus en Bacillus . Sommige bacteriocinen hebben zelfs de mogelijkheid om de immuunrespons 4 te moduleren. Veel bacteriocinen hebben relatief smalle spectra, een eigenschap die in sommige toepassingen zeer gewaardeerd wordt. Bijvoorbeeld, sommige smal spectrum bacteriocinen kunnen worden gebruikt om specifieke activiteit te richten tegen geselecteerde groepen van problematische bacteriën, zonder veel storing op de commensale of voordelige flora die dezelfde niche delen; Dit is vooral essentieel in de gut envirOnment, waar talrijke gunstige microben op interactieve en dynamische wijze gedijen 5 . Bacteriocinen zijn ook zeer aantrekkelijk voor profylactisch of probiotisch gebruik, omdat ze de (uit) groei van pathogenen, pathobionten of opportunistische bacteriën kunnen onderdrukken die de darmhomeostase 6 , 7 kunnen onevenwichtigen.
In termen van hun aard en fysisch-chemische eigenschappen zijn bacteriocinen zeer divers, omdat ze verschillende structuren, doelspecificiteiten, werkingsmethoden, enz. Hebben . De meeste bacteriocinen zijn in detail in de in vitro- instellingen bestudeerd, maar zeer weinig zijn in voedsel getest Matrices 8 , 9 of in vivo, zoals in een darmdarm 6 , 10 . De in vitro eigenschappen kunnen in grote mate verschillen wanneer ze in vivo worden beoordeeld door de complexiteit oF de darmomgeving en ook aan vermoedelijke onbedoelde effecten op gunstige bacteriën. De meeste probiotica zijn LAB. Ze produceren een scala aan andere metabolieten, waaronder korte keten vetzuren, die bekend zijn om de fysiologie van de gastheer te beïnvloeden, evenals antimicrobiële eigenschappen aan te tonen tegen bepaalde bacteriën. Daarom, in het geval van probiotische stammen die bacteriocinen produceren, is het het beste om realistische analyses vast te leggen, zoals gezonde dieren met normale microbiota.
In de huidige studie bieden we een strategie die het mogelijk maakt om het effect van verschillende bacteriocine-producerende stammen te beoordelen, waarvan bacteriocinen verschillende remmende spectra hebben op gezonde muizen. Onze strategie omvat het voeden van muizen met isogene niet-bacteriocin mutanten, die de differentiatie van bacteriocine-gemedieerde effecten mogelijk maken van niet-bacteriocine gemedieerde effecten. Sequencing 16S rDNA maakt het mogelijk om de dynamische veranderingen van de bacteriële populatie in de darm te volgen. SubsEquivalent statistische analyse deciphers correlaties tussen bacteriële soorten en ook tussen bacteriële soorten en gemeten fysiologische parameters ( bijvoorbeeld lichaamsgewicht, serum biochemische parameters, enz. ). Wij geloven dat het protocol dat in deze studie wordt gepresenteerd, ook van toepassing is op andere probiotische of prebiotische toepassingen buiten de studie van bacteriocinen bij levende dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zorg en behandeling moeten worden uitgevoerd bij een gespecialiseerde dierenverzorgingseenheid. De hier beschreven procedures werden goedgekeurd door de bijbehorende ethische commissie van de Universiteit van Valencia en de lokale overheden, in overeenstemming met de beginselen van laboratoriumdierzorg die verplicht zijn bij de Europese Unie en 2010/63 / EU en de Spaanse regering RD 53/2013 over de bescherming van dieren Gebruikt voor wetenschappelijke doeleinden, om het 3R-principe in dierproeven te respecteren (Vervanging, Reductie, Verfijning).
1. Bevroren Bacteriële Culturen gebruikt om muizen inoculeren
- Inademen individuele stammen van LAB in 5 ml hart-hart infusie (BHI) medium en groei ze gedurende 20 - 24 uur (overnacht) bij 30 ° C.
- Verdun elke nacht bacteriële cultuur 100-voudig in BHI door overdracht van 2 ml nachtcultuur tot 200 ml BHI. Kweek ze bij 30 ° C gedurende 20 - 24 uur.
OPMERKING: Stammen die in deze studie worden gebruikt, staan vermeld in tabel 1. - Harvest ceLls door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verwijder de supernatant en doe de cellen twee keer door elke celpellet in 100 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op te suspenderen en de cellen te verzamelen zoals in stap 1.3.
- Na de tweede was, schakel elke celpelletje op in 20 ml ijskoude 15% glycerol in PBS.
- Aliquot de cel suspensie in 1 ml volumes in buizen en sla ze vervolgens op -80 ° C tot gebruik.
OPMERKING: Cellen dienen binnen 1-2 maanden na dit punt te worden gebruikt. - Bepaal het celnummer vóór de opslag en voorafgaand aan toediening, zodat het aantal levende cellen die aan muizen wordt gegeven, bekend is.
- Voor celtelling, maak tienvoudige seriële verdunningen van cellen in ijskoude 0,9% natriumchloride (NaCl) oplossing. Spreid 100 μl van elke verdunning op een BHI agarplaat. Incubeer overnacht (20 - 24 uur) bij 30 ° C voor celgroei en kolonievorming, de laatste om kolonievormende eenheden (cfu) / ml te bepalen.
- Om bacteriën bevattend drinkwater te maken, verdun cellen van elke bacteriële veercultuur in 100 ml steriel, gefilterd drinkwater, met een uiteindelijke gemiddelde cfu van 10 9 / ml water. Tabel levende cellen, na de verdunning en na 24 uur eenmaal per week gedurende de eerste twee weken van de bacteriebehandeling, voor bacteriële overlevingsbeoordeling.
2. Muizenassay en Experimenteel Ontwerp
Opmerking: Specifieke pathogeenvrije (SPF) BALB / c jonge vrouwelijke muizen (6 - 8 weken) zijn nodig voor dit experiment; Hier werden in totaal 100 dieren gekocht.
- Geef de muizen het vrije toegang tot gepelleteerde voedsel en water gedurende het experiment.
- Ontwerp het experiment en bereken de kracht.
- Als elke behandeling zijn eigen controle heeft, gebruik dan een gepaarde case-control design (t-test). Gebruik een voorlopige test om de gemiddelde en standaardfout van de belangrijkste effect (en) te bepalen die worden bepaald. Optimaliseer de kracht van de test en het aantal dieren die per groep nodig zijn, met behulp van verschillende methoden en vrij beschikbare programma's 11 .
- Om te testen voor de effecten van bacteriocine producent versus niet-producenten stammen, gebruik 9 dieren per experimentele toestand.
OPMERKING: Dit nummer werd bepaald op basis van de experimentele standaardfout en leverde een bevredigende kracht (0,7-1,0) en een significantieniveau lager dan 0,05.
OPMERKING: In het gegeven voorbeeld werden 11 groepen muizen gemaakt, een per kooi. Tien koeren stemden overeen met de behandelingen met 5 bateriocine-producerende stammen en de overeenkomstige 5 isogene niet-producerende stammen; de 11e kooi had 10 muizen en vormden de onbehandelde controle.
- Na de aankomst van de muizen naar de veeteelt, verspreid ze de dieren in kooien en oorlabels om de individuele tracking mogelijk te maken. Acclimatiseer de muizen naar de veeteelt en voorwaarden voor een week voor proceeding.
- Bereid het drinkwater voor bacteriën op, zoals beschreven in stap 1.8, en plaats drinkwaterflessen in de bijbehorende onafhankelijke kooien die duidelijk geïdentificeerd zijn, zodat de muizen in elke kooi dezelfde waterfles delen.
OPMERKING: De controlegroep moet in een aparte kooi worden gehouden, zonder contact met de geteste bacteriën. - Bereid elke dag een nieuwe fles met vers drinkwater (100 ml) op en voeg vers ontdooide bacteriële suspensies toe. Doe dit gedurende 15 opeenvolgende dagen.
- Volg de bacteriënbehandeling met een periode van twee weken, gedurende welke periode muizen bacteriënvrij water drinken ( Figuur 1 ).
3. Verzamelen van monsters
- Verzamel fecale monsters.
- Bereid geautoclaveerde kooien (leeg) en steriele tang en label steriele 1,5 ml buizen voor elke muis.
- Verzamel monsters op hetzelfde moment van de dag om variaties in de microbiota samenstelling te vermijden tijdens de thIn de loop van een dag. Voor optimale resultaten verzamelt u verse monsters apart.
OPMERKING: Vroeg in de ochtend verzamelen feces bij voorkeur muizen die spontaan ontlopen. - Maak een lege kooi met 70% alcohol schoon en plaats een muis binnen. Laat het ontlasten en verzamel 2 - 4 fecale pellets met behulp van steriele tang en plaats ze in 1,5 ml buizen.
OPMERKING: soms is het voldoende om de muisstaart naar boven te houden; De ontlasting kan dan direct van de anus in een buis worden verzameld. - Ontvang fecale monsters van elke muis eenmaal per week tijdens het vier weken experiment ( Figuur 1 ). Verzamel de eerste monsters op dag een (T0, tijd nul), net voor de blootstelling van de muizen aan bacteriën. Verzamel de volgende fecale monsters op dagen 7, 14, 21 en 28.
- Koel de monsters bij 4 ° C tot hun transport naar het laboratorium, waar ze bij -80 ° C bevroren zijn. Plan alvast en geef voldoende opslagdozen, als een groot aantal feCal samples worden verzameld tijdens het experiment.
- Weeg alle muizen elke week op de dag van de fecale verzameling.
- Het verzamelen van bloed monsters van het gezicht ader uit alle muizen op de 15e dag, de laatste dag van bacteriën toediening en bepalen de niveaus van triglyceriden, totaal cholesterol, high-density lipoproteïne (HDL) en lage dichtheid lipoproteïne (LDL) in het bloed serum.
OPMERKING: Ervaren personeel moet het bloed verzamelen om de stress in de dieren te verminderen.
4. LAB Counting en Bacteriocin Activity
- Weeg één fecale pellet van elk monster in een 1,5 ml buis en voeg een voldoende volume ijskoude 0,9% NaCl toe om een 10% (w / v) oplossing te verkrijgen. Gebruik steriele micropestles voor 1,5 ml buizen om de fecale suspensie te homogeniseren en tienvoudige seriële verdunningen te bereiden in ijskoude 0,9% NaCl.
- Tel het totale aantal LAB cellen.
- Vervolg verdunde cellen (100 μl) naar 4 ml voorverwarmde MaN Rogosa Sharpe (MRS) zachte agar (50 ° C, 0,8% agar). Meng door vortexing voordat de cellen op een solide MRS agarplaat gieten (1,5% agar).
- Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten in de steriele afzuigkap uit te zetten voordat de cellen gedurende 20-24 uur bij 30 ° C worden geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
- Tel bacteriocine producerende cellen.
- Vervolg verdunde cellen (100 μl) van de bacteriocine-producent naar 4 ml voorverwarmde MRS zachte agar (50 ° C, 0,8% agar), meng door vortexen en giet de cellen op een MRS agarplaat (1,5% agar); Deze laag heet de eerste laag.
- Breng nog eens 4 ml celvrije MRS zachte agar (0,8% agar) over op de eerste laag om alle cellen in de zachte agar te embedden.
OPMERKING: Deze laag is bedoeld om te voorkomen dat cellen als kolonies op het oppervlak van de agarplaten groeien. Cellen die op het oppervlak groeien, worden gemakkelijk verplaatst bij het gieten van indicatorcellen op de top (stap 4.3.4) enZal daarom de uitlegging van de resultaten compliceren. Deze laag wordt de tweede laag genoemd. - Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten af te zetten in de steriele kap voordat u 20 tot 24 uur bij 30 ° C wordt geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
- Om bacteriocine-producerende kolonies te identificeren, meng 40 μL van een overnachtingskweek van een geschikte indicatorstam, zoals getoond in Tabel 1 , met 4 ml voorverwarmde zachte agar. Giet het mengsel op de plaat; Deze laag wordt aangeduid als de derde laag.
- Droog de plaat door het deksel 5-10 minuten af te zetten in de steriele kap voordat u 20 tot 24 uur bij 30 ° C wordt geïncubeerd voor celgroei en kolonievorming.
OPMERKING: Bacteriocine-producerende kolonies hebben duidelijke (remmende) zones rond de kolonies ( Figuur 2 ).
5. DNA-extractie, 16S rDNA amplificatie en sequentiebepaling
OPMERKING: stappen fOf DNA-extractie worden beschreven voor het gebruik van een commerciele kit ( bijvoorbeeld Realpure "SSS" Kit).
- Suspenseer 1 - 2 fecale muizenpellets (~ 200 mg) in 300 μl lysisoplossing.
- Breng het monster over naar een 2 ml microtube waarin ongeveer 0,5 g glazen kralen (diameter: 0,1 mm) eerder zijn geplaatst.
- Voeg 1 μl mutanolysine bij 10 U / μL en 2 μl lysozym bij 20 mg / ml aan elk monster toe en incubeer gedurende 40 tot 60 minuten bij 37 ° C. Ga door met een van de standaardprotocollen voor DNA-extractie uit fecale monsters 12 .
- Breng twee cycli van de kraalstapjes aan, 1 min elk.
- Voeg 2 μl eiwitase K toe en meng het grondig.
- Incubeer gedurende 20 minuten en vortex elke 5 minuten.
- Koel de monsters op 37 ° C en voeg 1 μL 5 μg / ml RNase A toe aan het monster. Meng grondig.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 - 60 minuten.
- Koel de monsters naar kamertemperatuur en voeg 180 μL toeVan eiwit neerslag oplossing. Vortex krachtig bij maximale snelheid gedurende 20 - 30 s.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 5 minuten. Als er deeltjes in het supernatant drijven, incubeer de monsters 5 minuten in ijs en centrifugeer dan opnieuw.
- Breng de supernatant die het DNA bevat, over op een nieuwe 1,5 ml microtube die 300 μl isopropanol bevat.
- Meng door de buizen 20-30 keer om te keren en incubeer gedurende 1 uur bij -20 ° C. Alternatief, inkubeer de buizen langer gedurende een periode ( bijv. 'S nachts).
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 2 minuten.
- Verwijder de supernatant en droog de buis op absorberend papier. Voeg 300 μl 70% ethanol toe om de DNA-pellet te wassen.
- Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 1 minuut, verwijder de supernatant en laat de pellet drogen gedurende ongeveer 15 minuten.
- Zodra de pellet droog is, voeg 100 μL steriel water of Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) buffer toe en laat de pellet opnieuw suspenderen.
- Om eventuele remmende effecten te eliminerenVerbindingen tijdens de volgende stappen, reinig het DNA. Meng geëxtraheerd DNA met 2 volumes (200 μl) buffer NTI om de bindingsomstandigheden voor stap 5.15 aan te passen.
- Plaats een siliciumdioxide bevattende PCR opruimingskolom in een verzamelbuis (2 ml) en laad het monster.
- Centrifuge gedurende 30 s bij 11.000 x g. Weggooi de doorstroom.
- Was het siliciumdioxide membraan met 700 μl buffer NT3 en herhaal stap 5.16.
- Droog het siliciumdioxide membraan door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 11.000 xg om eventuele resterende ethanolhoudende wasbuffer NT3 te verwijderen.
- Breng de kolom over naar een nieuwe 1,5 ml microtube en incubeer gedurende 2 - 5 minuten bij 70 ° C voor de totale verwijdering van de ethanol.
- Voeg 30 μl water van PCR-gehalte toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 70 ° C. Eluten door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 11.000 x g.
- Kwantificeer het DNA met behulp van een UV / Vis spectrofotometer of een fluorometrische methode.
- Normaliseer en pool de DNA-monsters van muizen die dezelfde kooi delen bij ea Ch tijdspunt.
- Om individuele variaties in de tijd te waarnemen, sequentie DNA-monsters van drie willekeurig geselecteerde muizen uit de controle en twee andere willekeurige kooien op dagen 0, 14 en 28.
6. 16S rRNA-genversterking en sequentiebepaling
- Bereid een bibliotheek van geamplificeerde 16S rRNA genen op. Versterk de V3-V4 regio van het bacteriële 16S rRNA gen 5 met behulp van voorwaartse en omgekeerde primers met geschikte overhang adapters:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Controleer de versterkte banden met behulp van elektroforese met 1% agarosegel.
- Reinig de polymerase kettingreactie (PCR) producten met behulp van magnetische kralen voor ampliconzuivering.
- Ga door met de volgende stappen zoals aangegeven door de fabrikant volgens het gebruikte massieve sequencing platform> 6.
7. Data analyse en statistieken
- Kwaliteit filtering (meestal uitgevoerd bij sequencing faciliteiten).
- Filter de ruwe leest data en de-multiplex met behulp van de bij de apparatuur geleverde software.
- Behandel het gepaarde einde met behulp van de UPARSE-pijpleiding 13 die is geïmplementeerd in USEARCH 14 (versie 7.0.1090). Voeg de gepaarde eindjes samen en voeg een kwaliteitsfiltrering toe met een maximale verwachte fout (maxee) waarde van 1.0. Wis sequenties minder dan 150 nt. Dereplicate sequenties om singletonen te weggooien.
- Cluster de sequenties in operationele taxonomische eenheden (OTU's) op een 97% sequentie identiteit en gebruik UCHIME 15 om chimere sequenties te filteren.
- OTU plukken, taxonomische opdracht en fylogenetische reconstructie, en diversiteitsanalyses en visualisaties.
- Verwerk de OTU's met behulp van Quantitative Insights IntO Microbiële Ecologie (QIIME) 16 .
- Kies en koppel de representatieve OTU's tegen de Greenses core set database 17 met PyNAST 18 met een minimum identiteit van 75% (standaard).
- Taksonomie toewijzen aan de uitgelijnde sequenties met behulp van het programma Ribosomal Database Project (RDP) 19 met een vertrouwen van 0.8.
- Normaliseer de OTU-tabel op de volgorde van het monster met de laagste sequentiediepte.
- Bouw een filogenische boom uit uitgelijnde sequenties met behulp van Fast Tree 20 na de filtratie stap om zeer variabele gebieden en posities te verwijderen die alle gaten bevatten. Gebruik deze boom om alfa- en bèta-diversiteiten te berekenen en om berekeningsgraden en Shannon-indexen te berekenen.
- Om ongewenste UniFrac-afstandswaarden 21 te genereren en te visualiseren, gebruik de principe-coördinaatanalyse (PCoA).
OPMERKING: Voor sTATISTISCHE analyse verschillende softwarepakketten kunnen gebruikt worden, bijvoorbeeld R22 of statistische technieken toegepast binnen QIIME 16. - Voor de vergelijking van Shannon-indexen van diversiteit tussen de verschillende behandelingen, gebruik een ANCOVA, gezien tijd als een doorlopende afhankelijk variabele in R.
- Vergelijk de afstanden tussen behandelingen in PCoA in QIIME met behulp van een tussentijdse student's t-test en bereken de nonparametrische p-waarden met 1.000 Monte Carlo-permutaties met behulp van de Bonferroni-correctie.
- Analyseer voor correlaties tussen de relatieve overvloed aan specifieke OTU's en andere gemeten parameters, zoals serum niveaus van cholesterol, HDL, LDL, enz. , Met behulp van Pearson correlatie analyse. Gebruik hiervoor CoNet 23 met de daarop volgende visualisatie van correlatienetwerken met behulp van Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De productie van bacteriocinen is beschouwd als een positieve probiotische eigenschap in LAB, aangezien men ervan uitgaat dat de groei van opportunistische bacteriën en pathogenen wordt voorkomen. Het doel van dit werk was om de capaciteit van bacteriocinen te laten zien om de darmmicrobiota populaties te moduleren in een muismodel. Hiervoor is een procedure ontwikkeld om het effect van de inname van bacteriocine-producerende stammen en hun isogene niet-producerende stammen te vergelijken. De werkwijze voor de inoculatie en de tijdsuitbreiding van de test worden getoond in Figuur 1 . Muizen werden ingedeeld in elf kooien: een controle zonder behandeling, vijf kooien die behandeld werden met bacteriocin-producer stammen en vijf kooien behandeld met de bijbehorende isogene mutanten die verminderd of geen bacteriocine productie hebben. De geteste bacteriocine-producerende LAB, evenals de respectieve tellingen (cfu / mL) in drinkwater en tellingen in ontlasting, worden samengevat in
Figuur 1: Schema De tijdcursusontwerp van de Expe toontnadele. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Detectie van Bacteriocin Productie in LAB Recovered from Feces door een drielaagprotocol (zoals beschreven in de procedure). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van de samenstelling van bacteriebehandelingen. Een PCoA-grafiek werd gegenereerd op basis van de berekende afstanden in een ongewogen UniFrac-matrix. Verschillende tijdstippen van hetzelfde monster ( et al. , 2016 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Wijzigingen in de relatieve overvloed van LAB en bacteriocine-gerichte bacteriegroepen op het genusniveau tijdens de behandelings- en nabehandelingsperioden. VeranderingS in de relatieve overvloedingen van genera in behandelingen, verkregen met betrekking tot tijd 0, werden vergeleken met die in de controlegroep (CON). Voor de duidelijkheid van de afbeelding worden slechts 4 stammen getoond: garvicin en sakacin producent en niet-producent stammen (zie de legende in de figuur om kleur en behandeling te verdelen). Foutstaven vertegenwoordigen de standaardafwijking. Betekenisgraad is als volgt weergegeven: P <0,1 met punt (.); P <0,05 met een ster (*); P <0,01 met twee sterren (**). Aangepast van Umu et al. , 2016 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Correlatie Netwerk van Relatieve Abundanties van OTU's op Dag 14 en Serum Niveaus. De correlaties waren caBerekend met behulp van Pearson's correlatie in CoNet. Alleen de significante (P <0,05) worden getoond op het netwerk. Parameters bepaald in serum - totaal cholesterol ( Chol ), hoge dichtheidslipoproteïne ( HDL ), LDL en triglyceriden ( Trig - worden weergegeven in één kleur (grijs), terwijl OTU's die behoren tot verschillende families, worden vertegenwoordigd door Verschillende kleuren (zie de legende). Positieve correlaties worden weergegeven met groene randen en negatieve correlaties met rode randen. OTU's op de knooppunten worden weergegeven met OTU-nummers of het genus waaraan ze behoren. Aangepast uit Umu et al. , 2016 12 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Geënt in drinkwater | Melkzuurbacteriën tellen in ontlasting | Indicatorstammen | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (gemiddelde log10) | |||
| CONTROLE | ---- | 10 muizen | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 muizen | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA-) | 2.0 | 9 muizen | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 muizen | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 muizen | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 muizen | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 uitgehard) | 10 | 9 muizen | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 muizen | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 muizen | 8.60 ± 0.18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 muizen | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 muizen | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) voor SakA en PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) voor enterocinen, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) voor plantaricines, en Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) voor GarML. | ||||
Tabel 1: Geënte stammen en de tellingen in fecale monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven procedure is gebruikt om te bepalen of veranderingen in de microbiota gebonden zijn aan gezondheid of leeftijd. Verschillende delen van het protocol zijn belangrijk, maar onder hen kunnen de ontlasting, het selecteren van het DNA-fragment dat wordt gedetecteerd en geanalyseerd, en het uitvoeren van de DNA-extractie en bioinformatische analyse zeker de meest kritische punten zijn. Bemonstering is cruciaal omdat muizen om ethische redenen niet moeten worden gestresseerd en omdat het bekend is dat het aandeel bacteriën in de darm verandert. Monsters moeten zo snel mogelijk worden verwerkt of moeten worden bevroren tot gebruik, aangezien sommige bacteriën zeer gevoelig zijn voor uitdroging en / of zuurstof. De selectie van het DNA fragment dat moet worden gehersequentieerd uit de geamplificeerde 16S rRNA genen is een cruciaal punt. In dit werk werden de variabele gebieden V3 - V4 geselecteerd 25 . Het belang van de DNA-extractiemethode mag niet onderschat worden, aangezien bacteriële cellen die in de monsters aanwezig zijn niet allemaal gelijkwaardig zijnOngewoon gevoelig voor verschillende lysisprotocollen, en voorspellingen bij de schatting van de bacteriepopulaties kunnen het gevolg zijn van onvolledige lysis. Daarom is de introductie van een kraalstap nodig. Isogene stammen kunnen worden geconstrueerd door genetische knockdown of door plasmide curatie, hoewel in het geval van stammen, refractaire transformatie-chromosoom-gecodeerde bacteriocinen een probleem kunnen voorstellen. Deze werkwijze kan worden aangepast aan de hand van verschillende specifieke cultuurtechnieken, zoals anaërobe methoden 26 .
De procedure kan in de meeste stappen worden aangepast, afhankelijk van het type van de te wijzigen veranderingen. De inoculatieprocedure kan verkort worden, maar veranderingen in serumparameters kunnen enige tijd nodig hebben om te ontwikkelen. Een mogelijke beperking van de methode kan de studie zijn van bacteriestammen (voedingsstoffen of verbindingen) die niet enkele uren in water kunnen overleven of die kunnen kloppen (of neerslaan voor verbindingen). Vandaar dit is een factor die moet al Dus overwogen.
Tot nu toe is bacteriocine-activiteit in het algemeen bepaald in vitro 27 , 28 , 29 of in gemengde culturen 30 . Deze methode heeft de in vivo monitoring mogelijk gemaakt van de activiteiten van vijf bacteriocinen uit de gehele darmmicrobiota van standaard laboratoriummuizen. Kleine variaties in populaties kunnen worden bepaald, evenals hun invloed op andere bacteriegroepen of fysiologische factoren, zoals serumparameters 12 . Bacteriocinen hebben een relatief smal activiteitsspectrum, die de groei van taxonomisch gerelateerde bacteriën remmen. Echter, degenen die in deze test worden gebruikt, zijn onder de meest effectieve, zoals sommige van hen actief zijn tegen Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 , en zelfs sommige stammen van Escherichia coli , zoals in het geval van sakacine AAss = "xref"> 32. Wanneer in muizen geïnoculeerd werden, leidden LAB-producerende bacteriocinen niet tot opmerkelijke veranderingen in de globale microbiota-samenstelling, maar in een verminderd aantal bacteriële taxa. Niettemin bleek dat de globale correlatie netwerkanalyse interessante ecologische compatibiliteit en antagonisme tussen verschillende bacteriën heeft aangetoond. Deze methode kan worden aangepast om het effect van voedingsstoffen, geneesmiddelen of andere verbindingen te analyseren, hoewel de verwachte uitkomst opzettelijk beperkt kan worden tot het behoud van gezonde omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de EER Grant NILS Coordinated Mobility of Researchers (Referentie 017-ABEL-CM-2013) bedanken voor wetenschap en duurzaamheid. CB en GP-M. Werden ondersteund door de subsidie AGL2015-70487-P van het Spaanse ministerie van Economie en Concurrentievermogen. OCOU en DBD werden ondersteund door een strategisch beurs programma voor voedselwetenschappelijk onderzoek van de Noorse Université of Life Sciences (NMBU) (project 1205051025). We willen ook Inmaculada Noguera bedanken voor haar hulp bij dierenverzorging en bemonstering en Jezus Dehesa voor zijn hulp om de beschikbaarheid van laboratoriummateriaal in de dierenfaciliteit te waarborgen. We waarderen ook professor Lars-Gustav Snipen voor zijn advies over statistieken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C.
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J.
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
