Summary
Es wird angenommen, dass Bakteriocine eine Schlüsselrolle bei der Definition der mikrobiellen Vielfalt in verschiedenen ökologischen Nischen spielen. Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Beurteilung, wie sich Bakteriocine in einem Tiermodell auf die Mikrobiota-Zusammensetzung auswirken.
Abstract
Sehr faszinierende Fragen entstehen mit unserem fortschreitenden Wissen über die Mikrobiota-Komposition und die Beziehung zur Gesundheit, insbesondere in Bezug auf die Faktoren, die zur Erhaltung der Populationsbilanz beitragen. Allerdings gibt es begrenzte verfügbare Methoden, um diese Faktoren zu bewerten. Bakteriocine sind antimikrobielle Peptide, die von vielen Bakterien produziert werden, die einen Wettbewerbsvorteil für die Nahrungsmittelerfassung und / oder Nischenherstellung verleihen können. Viele probiotische Milchsäurebakterien (LAB) -Stämme haben ein großes Potenzial, die Gesundheit von Mensch und Tier zu fördern, indem sie das Wachstum von Krankheitserregern verhindern. Sie können auch für die Immunmodulation verwendet werden, da sie Bakteriocine produzieren. Allerdings wird die antagonistische Aktivität von Bakteriocinen normalerweise durch Labor-Bioassays unter wohldefinierten, aber über-vereinfachten Bedingungen im Vergleich zu der komplexen Darm-Umgebung bei Menschen und Tieren bestimmt, wo Bakterien mit multifaktoriellen Einflüssen aus dem Wirt und Hunderten von mikrobiellen Spezies s konfrontiert sindDie gleiche Nische Diese Arbeit beschreibt ein vollständiges und effizientes Verfahren zur Bewertung der Wirkung Einer Vielzahl von Bakteriocinen mit unterschiedlichen Zielspezifitäten in einem murinen System. Änderungen der Mikrobiota-Zusammensetzung während der Bakteriocin-Behandlung werden unter Verwendung einer kompositorischen 16S-rDNA-Sequenzierung überwacht. Unser Ansatz nutzt sowohl die Bakteriocin-Produzenten als auch ihre isogenen Nicht-Bakteriocin-produzierenden Mutanten, wobei letztere die Fähigkeit gibt, Bakteriocin-bezogene von nicht-bakteriocinbezogenen Modifikationen der Mikrobiota zu unterscheiden. Die Fäkal-DNA-Extraktion und die 16S-rDNA-Sequenzierungsmethoden sind konsistent und bilden zusammen mit der Bioinformatik ein mächtiges Verfahren, um schwache Veränderungen in den Bakterienprofilen zu finden und Korrelationen hinsichtlich der Cholesterin- und Triglyceridkonzentration zwischen Bakterienpopulationen und Gesundheitsmarkern herzustellen. Unser Protokoll ist generisch und kann so verwendet werden, um andere Verbindungen oder Nährstoffe mit dem Potential zu untersuchen, das Wirtsmikro zu verändernRobiota Zusammensetzung, entweder beim Studium der Toxizität oder nützliche Auswirkungen.
Introduction
Bakteriocine sind antimikrobielle Peptide, die durch einen breiten Bereich von Bakterienarten 1 , 2 hergestellt werden . Diese Verbindungen und ihre Produzenten, insbesondere LAB, wurden seit Jahrzehnten weltweit für ihre Einsatzmöglichkeiten in der Lebensmittelkonservierung und Medizin erforscht und ausgenutzt 3 . Mehrere Bakteriocine sind bekannt, um wichtige Pathogene, einschließlich Arten von Listeria, Enterococcus, Staphylococcus und Bacillus zu töten. Einige Bakteriocine haben sogar die Fähigkeit, die Immunantwort zu modulieren 4 . Viele Bakteriocine haben relativ schmale Spektren, eine Eigenschaft, die in einigen Anwendungen sehr geschätzt wird. Zum Beispiel können einige schmalbandige Bakteriocine verwendet werden, um spezifische Aktivität gegen ausgewählte Gruppen von problematischen Bakterien zu lenken, ohne viel Störung auf die kommentare oder nützliche Flora, die dieselbe Nische teilt; Dies ist besonders wichtig im DarmumfeldWo zahlreiche nützliche Mikroben in einer interaktiven und dynamischen Weise gedeihen 5 . Bakteriocine sind auch für den prophylaktischen oder probiotischen Gebrauch sehr attraktiv, da sie das (Aus-) Wachstum von Pathogenen, Pathobionten oder opportunistischen Bakterien, die die Darmhomöostase 6 , 7 ausgleichen können, unterdrücken können.
In ihrer Natur und ihren physikochemischen Eigenschaften sind Bakteriocine sehr unterschiedlich, da sie unterschiedliche Strukturen, Zielspezifitäten, Wirkungsweisen usw. aufweisen. Die meisten Bakteriocine wurden in vitro- Einstellungen sehr genau untersucht, aber nur wenige wurden in Lebensmitteln getestet Matrizen 8 , 9 oder in vivo, wie in einem Tierdarm 6 , 10 . Die in vitro Eigenschaften können sich in hohem Maße unterscheiden, wenn sie in vivo aufgrund der Komplexität o bewertet werdenF die Darmumgebung und auch zu mutmaßlichen unbeabsichtigten Wirkungen auf nützliche Bakterien. Die meisten Probiotika sind LAB. Sie produzieren eine Reihe von anderen Metaboliten, einschließlich kurzkettiger Fettsäuren, von denen bekannt ist, dass sie die Physiologie des Wirts beeinflussen, sowie antimikrobielle Eigenschaften gegenüber bestimmten Bakterien zu demonstrieren. Daher ist es im Falle von probiotischen Stämmen, die Bakteriocine produzieren, am besten, um realistische Assays, wie gesunde Tiere mit normaler Mikrobiota, zu etablieren.
In der vorliegenden Studie stellen wir eine Strategie zur Verfügung, die die Beurteilung der Wirkung verschiedener Bakteriocin-produzierender Stämme ermöglicht, deren Bakteriocine bei gesunden Mäusen unterschiedliche Hemmungsspektren aufweisen. Unsere Strategie umfasst die Fütterung von Mäusen mit isogenen Nicht-Bakteriocin-Mutanten, die die Differenzierung von Bakteriocin-vermittelten Effekten aus Nicht-Bakteriocin-vermittelten Effekten ermöglichen. Sequenzierung 16S rDNA erlaubt es, die dynamischen Veränderungen der Bakterienpopulation im Darm zu verfolgen. SubsGleiche statistische Analyse entschlüsselt Korrelationen zwischen Bakterienarten und auch zwischen Bakterienarten und gemessenen physiologischen Parametern ( zB Körpergewicht, serumbiochemische Parameter usw. ). Wir glauben, dass das in dieser Studie vorgestellte Protokoll auch auf andere probiotische oder präbiotische Anwendungen anwendbar ist, die über die Untersuchung von Bakteriocinen in lebenden Tieren hinausgehen.
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Protocol
Die Pflege und Handhabung muss bei einer Tierpflege durchgeführt werden. Die hier beschriebenen Verfahren wurden von dem zuständigen Ethikausschuss der Universität Valencia und den örtlichen Behörden nach den Grundsätzen der betrieblichen Tierpflege, die nach dem Unionsrecht und 2010/63 / EU und der spanischen Regierung RD 53/2013 zum Schutz der Tiere vorgeschrieben sind, genehmigt Für wissenschaftliche Zwecke verwendet, um das 3R-Prinzip in Tierversuchen (Ersatz, Reduktion, Verfeinerung) zu respektieren.
1. Gefrorene Bakterienkulturen, die zum Inokulieren von Mäusen verwendet werden
- Inokulieren Sie einzelne LAB-Stammstämme in 5 ml Hirn-Herz-Infusion (BHI) -Medium und wachsen sie für 20 - 24 h (über Nacht) bei 30 ° C.
- Verdünnen Sie jede über Nacht bakterielle Kultur 100-fach in BHI durch Übertragung von 2 ml Über Nacht Kultur auf 200 ml BHI. Wachsen sie bei 30 ° C für 20 - 24 h.
HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Stämme sind in Tabelle 1 aufgelistet. - Ernte ceLl durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie jedes Zellpellet in 100 ml eiskalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendieren und die Zellen wie in Schritt 1.3 sammeln.
- Nach dem zweiten Waschen wird jedes Zellpellet in 20 ml eiskaltem 15% Glycerin in PBS suspendiert.
- Aliquotieren Sie die Zellsuspension in 1-ml-Volumina in Röhrchen und lagern Sie sie bei -80 ° C bis zur Verwendung.
HINWEIS: Zellen sollten innerhalb von 1-2 Monaten nach diesem Punkt verwendet werden. - Bestimmen Sie die Zellzahl vor der Lagerung und vor der Verabreichung, so dass die Anzahl der lebenden Zellen, die an Mäuse gegeben werden, bekannt ist.
- Für die Zellzählung machen zehnfache serielle Verdünnungen von Zellen in eiskalter 0,9% iger Natriumchloridlösung (NaCl). 100 μl jeder Verdünnung auf eine BHI-Agarplatte auftragen. Inkubieren über Nacht (20 - 24 h) bei 30 ° C für Zellwachstum und Koloniebildung, wobei letztere koloniebildende Einheiten (cfu) / mL bestimmen.
- Um bakterienhaltiges Trinkwasser zu verdünnen, verdünnen die Zellen jeder Bakterien-Stammkultur in 100 ml sterilem, gefiltertem Trinkwasser mit einem endgültigen durchschnittlichen Cfu von 10 9 / ml Wasser. Für die bakterielle Überlebensbewertung zählen die Zellen nach der Verdünnung und nach 24 Stunden einmal wöchentlich während der ersten zwei Wochen der Bakterienbehandlung.
2. Mäuse Assay und Experimentelles Design
Anmerkung: Für dieses Experiment sind spezifische pathogenfreie (SPF) BALB / c junge weibliche Mäuse (6 - 8 Wochen) erforderlich. Hier wurden insgesamt 100 Tiere gekauft.
- Geben Sie den Mäusen freien Zugang zu pelletiertem Essen und Wasser während des gesamten Experiments.
- Entwerfen Sie das Experiment und berechnen Sie die Macht.
- Wenn jede Behandlung ihre eigene Kontrolle hat, wenden Sie eine gepaarte Fall-Kontroll-Design (T-Test). Verwenden Sie einen Vorversuch, um den Mittelwert und den Standardfehler der wichtigsten zu bestimmenden Wirkungen zu berechnen. Optimieren Sie die Leistung des Assays und die Anzahl der benötigten Tiere pro Gruppe mit verschiedenen Methoden und frei verfügbaren Programmen 11 .
- Um die Auswirkungen von Bakteriocin-Produzenten gegen Nicht-Produzenten-Stämme zu testen, verwenden Sie 9 Tiere pro experimentellen Zustand.
HINWEIS: Diese Zahl wurde auf der Grundlage des experimentellen Standardfehlers bestimmt und lieferte eine zufriedenstellende Leistung (0,7 - 1,0) und ein Signifikanzniveau unter 0,05.
HINWEIS: Im angegebenen Beispiel wurden 11 Gruppen von Mäusen gemacht, eine pro Käfig. Zehn Käfige entsprachen den Behandlungen mit 5 Bateriocin-produzierenden Stämmen und den entsprechenden 5 isogenen nicht-produzierenden Stämmen; der 11. Käfig hatte 10 Mäuse und bildete die unbehandelte Kontrolle.
- Nach der Ankunft der Mäuse in die Haltungsanlagen, verteilen sie in Käfigen und Ohr-Label die Tiere, um individuelle Verfolgung zu ermöglichen. Akklimatisiere die Mäuse zu den Haltungsanlagen und Bedingungen für eine Woche vor pRunden
- Bereiten Sie bakterienhaltiges Trinkwasser vor, wie in Schritt 1.8 beschrieben, und stellen Sie Trinkwasserflaschen in die entsprechenden unabhängigen Käfige, die eindeutig identifiziert sind, so dass die Mäuse in jedem Käfig die gleiche Wasserflasche teilen.
HINWEIS: Die Kontrollgruppe muss in einem separaten Käfig aufbewahrt werden, ohne Kontakt mit den getesteten Bakterien. - Bereiten Sie täglich eine neue Flasche mit frischem Trinkwasser (100 ml) vor und fügen Sie frisch aufgetaute Bakteriensuspensionen hinzu. Tun Sie dies für 15 aufeinanderfolgende Tage.
- Folgen Sie der Bakterienbehandlung mit einer Zeitspanne von zwei Wochen, wobei während dieser Zeit Mäuse bakterienfreies Wasser trinken ( Abbildung 1 ).
3. Proben sammeln
- Sammeln Sie Fäkalproben.
- Bereiten Sie autoklavierte Käfige (leer) und sterile Pinzette vor und etikettieren Sie sterile 1,5-ml-Röhrchen für jede Maus.
- Sammeln Sie Proben zur gleichen Tageszeit, um Variationen in der Mikrobiota-Zusammensetzung während der Th. Zu vermeidenE Kurs eines Tages. Für optimale Ergebnisse sammeln Sie frische Proben separat.
ANMERKUNG: Bevorzugt sammeln Sie Kot früh am Morgen, wenn Mäuse dazu neigen, spontan zu stoßen. - Reinigen Sie einen leeren Käfig mit 70% Alkohol und legen Sie eine Maus nach innen. Erlauben Sie es zu stören, und sammeln Sie 2 - 4 Fäkalpellets mit steriler Pinzette und legen Sie sie in 1,5 ml Röhrchen.
HINWEIS: Manchmal genügt es, den Mausschwanz nach oben zu halten. Der Stuhl kann dann direkt vom Anus in eine Tube gesammelt werden. - Sammle fälschliche Proben von jeder Maus einmal pro Woche während des vierwöchigen Experiments ( Abbildung 1 ). Sammle die ersten Proben am ersten Tag (T0, Zeit Null), kurz vor der Exposition der Mäuse an Bakterien. Sammeln Sie die folgenden Fäkalproben an den Tagen 7, 14, 21 und 28.
- Die Proben bei 4 ° C bis zum Transport zum Labor kühlen, wo sie bei -80 ° C eingefroren werden. Planen Sie im Voraus und bieten Sie ausreichend Aufbewahrungsboxen, wie eine große Anzahl von FeCal-Proben werden während des Experiments gesammelt.
- Wiegen alle Mäuse jede Woche am Fäkalsammeltag.
- Sammeln von Blutproben aus der Vena facialis von allen Mäusen am 15. Tag, dem letzten Tag der Bakterien Verwaltung und bestimmen die Höhe der Triglyceride, Gesamtcholesterin, High-Density - Lipoprotein (HDL) und Low-Density - Lipoprotein (LDL) in der Blutserum
HINWEIS: Erfahrenes Personal sollte das Blut sammeln, um Stress bei den Tieren zu reduzieren.
4. LAB-Zähl- und Bakteriocin-Aktivität
- Wiegen Sie ein Fäkalpellet jeder Probe in einem 1,5 ml-Röhrchen und fügen Sie ein ausreichendes Volumen an eiskaltem 0,9% NaCl hinzu, um eine 10% ige (w / v) Lösung zu erhalten. Verwenden Sie sterile Mikropfeiler für 1,5 mL Röhrchen, um die Fäkaliensuspension zu homogenisieren und zehnfache serielle Verdünnungen in eiskaltem 0,9% NaCl vorzubereiten.
- Zähle die Gesamtzahl der LAB-Zellen.
- Übertragen Sie verdünnte Zellen (100 μl) auf 4 ml vorgewärmtes MaN Rogosa Sharpe (MRS) weicher Agar (50 ° C, 0,8% Agar). Mischen durch Vortexen vor dem Gießen der Zellen auf eine feste MRS-Agarplatte (1,5% Agar).
- Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel für 5 - 10 min in der sterilen Kapuze vor der Inkubation der Zellen für 20 - 24 h bei 30 ° C für Zellwachstum und Koloniebildung.
- Zählen Sie Bakteriocin-produzierende Zellen.
- Übertragen Sie verdünnte Zellen (100 μl) des Bakteriocin-Herstellers auf 4 ml vorgewärmten MRS-Soft-Agar (50 ° C, 0,8% Agar), mischen durch Vortexen und gießen die Zellen auf eine MRS-Agarplatte (1,5% Agar); Diese Schicht wird als erste Schicht bezeichnet.
- Übertragen Sie weitere 4 ml zellfreien MRS-Soft-Agar (0,8% Agar) auf die erste Schicht, um alle Zellen in den weichen Agar einzubetten.
HINWEIS: Diese Schicht soll verhindern, dass Zellen als Kolonien auf der Oberfläche der Agarplatten wachsen. Zellen, die auf der Oberfläche wachsen, werden beim Verschieben von Indikatorzellen auf der Oberseite leicht verschoben (Schritt 4.3.4) undWird daher die Interpretation der Ergebnisse komplizieren. Diese Schicht wird als die zweite Schicht bezeichnet. - Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel für 5 - 10 min in der sterilen Kapuze vor der Inkubation für 20 - 24 h bei 30 ° C für Zellwachstum und Koloniebildung.
- Um Bakteriocin-produzierende Kolonien zu identifizieren, mischen Sie 40 μl einer Übernachtkultur eines geeigneten Indikatorstamms, wie in Tabelle 1 gezeigt , mit 4 ml vorgewärmtem Weichagar. Gießen Sie die Mischung auf die Platte; Diese Schicht wird als dritte Schicht bezeichnet.
- Trocknen Sie die Platte, indem Sie den Deckel für 5 - 10 min in der sterilen Kapuze vor der Inkubation für 20 - 24 h bei 30 ° C für Zellwachstum und Koloniebildung.
ANMERKUNG: Bakteriocin-produzierende Kolonien haben klare (Hemmungs-) Zonen um die Kolonien ( Abbildung 2 ).
5. DNA-Extraktion, 16S-rDNA-Amplifikation und Sequenzierung
HINWEIS: Schritte fOder DNA-Extraktion sind für die Verwendung eines kommerziellen Kits ( zB Realpure "SSS" Kit) beschrieben.
- 1 - 2 fäkale Mäusepellets (~ 200 mg) in 300 μl Lyse-Lösung suspendieren.
- Übertragen Sie die Probe auf ein 2 mL Mikroröhrchen, in dem bisher etwa 0,5 g Glasperlen (Durchmesser: 0,1 mm) platziert wurden.
- Füge 1 μl Mutanolysin bei 10 U / μl und 2 μl Lysozym bei 20 mg / ml zu jeder Probe hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 40 - 60 min. Gehen Sie mit einem der Standardprotokolle für die DNA-Extraktion aus Stuhlproben vor 12 .
- Tragen Sie zwei Zyklen der Perlenschläger Schritte, jeweils 1 min.
- 2 μl Proteinase K zugeben und gut durchmischen.
- 20 min inkubieren und alle 5 min vortexen.
- Die Proben auf 37 ° C abkühlen und 1 μl 5 μg / mL RNase A zur Probe geben. Gründlich mischen.
- Inkubieren bei 37 ° C für 30 - 60 min.
- Die Proben auf Raumtemperatur abkühlen und 180 μl zugebenDer Protein-Präzipitationslösung. Vortex kräftig mit maximaler Geschwindigkeit für 20 - 30 s.
- Zentrifuge bei 16.000 xg für 5 min. Wenn es irgendwelche Partikel gibt, die im Überstand schwimmen, inkubieren die Proben in Eis für 5 min und dann erneut zentrifugieren.
- Übertragen Sie den Überstand, der die DNA enthält, in ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen, das 300 μl Isopropanol enthält.
- Mischen, indem man die Röhrchen 20-30 mal umkehrt und für 1 h bei -20 ° C inkubiert. Alternativ die Röhrchen für längere Zeit ( zB über Nacht) inkubieren.
- Zentrifuge bei 16.000 xg für 2 min.
- Den Überstand entfernen und das Röhrchen auf saugfähigem Papier trocknen. Füge 300 μl 70% iges Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen.
- Bei 16000 xg für 1 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet ca. 15 min trocknen lassen.
- Sobald das Pellet trocken ist, werden 100 μl steriles Wasser oder Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) Puffer zugegeben und das Pellet resuspendiert.
- Um mögliche Hemmungen zu beseitigenVerbindungen während der nachfolgenden Schritte, die DNA zu reinigen. Mischen Sie extrahierte DNA mit 2 Volumina (200 μl) Puffer NTI, um die Bindungsbedingungen für Schritt 5.15 einzustellen.
- Legen Sie eine Siliciumdioxid-Membran mit PCR-Säuberungssäule in ein Sammelröhrchen (2 ml) und laden Sie die Probe.
- Zentrifuge für 30 s bei 11.000 x g. Verwerfe den Durchfluss.
- Die Siliciumdioxidmembran mit 700 μl Puffer NT3 waschen und Schritt 5.16 wiederholen.
- Die Siliciumdioxidmembran wird durch Zentrifugation für 1 min bei 11.000 xg getrocknet, um jeglichen restlichen Ethanol enthaltenden Waschpuffer NT3 zu entfernen.
- Übertragen Sie die Säule auf ein neues 1,5-ml-Mikroröhrchen und inkubieren Sie für 2 - 5 min bei 70 ° C für die vollständige Entfernung des Ethanols.
- Füge 30 μl PCR-Wasser hinzu und inkubiere für 5 min bei 70 ° C. Eluieren durch Zentrifugation für 1 min bei 11.000 x g.
- Quantifizierung der DNA unter Verwendung eines UV / Vis-Spektrophotometers oder einer fluorometrischen Methode.
- Normalisieren und bleichen die DNA-Proben von Mäusen, die denselben Käfig teilen, bei ea Ch Zeitpunkt.
- Um einzelne Variationen während der Zeit zu beobachten, sequenzieren DNA-Proben von drei zufällig ausgewählten Mäusen aus der Kontrolle und zwei anderen zufälligen Käfigen an den Tagen 0, 14 und 28.
6. 16S rRNA Genamplifikation und Sequenzierung
- Bereiten Sie eine Bibliothek von amplifizierten 16S-rRNA-Genen vor. Amplifizieren der V3-V4-Region des bakteriellen 16S-rRNA-Gens 5 mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern mit entsprechenden Überhangadaptern:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Überprüfen Sie die amplifizierten Banden mit Elektrophorese mit 1% Agarosegel.
- Säubern Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produkte mit magnetischen Perlen für die Ampullenreinigung.
- Gehen Sie mit den folgenden Schritten vor, wie vom Hersteller nach der verwendeten massiven Sequenzplattform angegeben> 6
7. Datenanalyse und Statistik
- Qualitätsfilterung (in der Regel bei Sequenzieranlagen durchgeführt).
- Filtern Sie die Rohdaten und de-multiplex mit der mitgelieferten Software.
- Verarbeiten Sie die gepaarten Endlesungen mit der UPARSE-Pipeline 13, die in USEARCH 14 implementiert ist (Version 7.0.1090). Fügen Sie die gepaarten Enden zusammen und wenden Sie die Qualitätsfilterung mit einem maximalen erwarteten Fehler (maxee) Wert von 1,0 an. Verweigern Sie Sequenzen weniger als 150 nt. Dereplicate Sequenzen, um Singletons zu verwerfen.
- Cluster der Sequenzen in operative taxonomische Einheiten (OTUs) auf einer 97% Sequenzidentität und verwenden UCHIME 15 , um chimäre Sequenzen zu filtern.
- OTU-Kommissionierung, taxonomische Zuordnung und phylogenetischer Rekonstruktion sowie Diversity-Analysen und Visualisierungen.
- Verarbeiten Sie die OTUs mit Quantitative Insights IntO Mikrobielle Ökologie (QIIME) 16 .
- Auswahl und Ausrichtung der repräsentativen OTUs gegen die Greengenes Core Set Datenbank 17 mit PyNAST 18 mit einer minimalen Identität von 75% (Standard).
- Zuordnen der Taxonomie zu den ausgerichteten Sequenzen mit dem Ribosomal Database Project (RDP) Klassifikator Programm 19 mit einem Vertrauen von 0,8.
- Normalisieren Sie die OTU-Tabelle auf die Sequenzzählung des Samples mit der niedrigsten Sequenztiefe.
- Bauen Sie einen phylogenen Baum aus ausgerichteten Sequenzen mit Fast Tree 20 nach dem Filtrationsschritt, um hochvariable Regionen und Positionen, die alle Lücken sind, zu entfernen. Verwenden Sie diesen Baum, um Alpha- und Beta-Diversitäten zu berechnen und um Verdünnungskurven und Shannon-Indizes zu berechnen.
- Um ungewichtete UniFrac-Distanzmetriken 21 zu generieren und zu visualisieren, verwenden Sie die Prinzipkoordinatenanalyse (PCoA).
HINWEIS: Für sTatistische Analysen können verschiedene Softwarepakete verwendet werden, wie zB R 22 oder die in QIIME 16 implementierten statistischen Werkzeuge. - Für den Vergleich von Shannon Indizes der Vielfalt zwischen den verschiedenen Behandlungen, verwenden Sie eine ANCOVA, unter Berücksichtigung der Zeit als eine kontinuierliche abhängige Variable in R.
- Vergleichen Sie die Abstände zwischen Behandlungen in PCoA in QIIME mit einem zweiseitigen Student's t-Test und berechnen Sie die nichtparametrischen p-Werte mit 1.000 Monte Carlo Permutationen mit der Bonferroni Korrektur.
- Analysieren Sie für Korrelationen zwischen der relativen Häufigkeit von spezifischen OTUs und anderen gemessenen Parametern, wie Serumspiegel von Cholesterin, HDL, LDL, etc. , mit Pearson-Korrelationsanalyse. Verwenden Sie dazu CoNet 23 mit der anschließenden Visualisierung von Korrelationsnetzen mit Cytoscape 3.1.1 24 .
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Representative Results
Die Produktion von Bakteriocinen wurde als ein positives probiotisches Merkmal in LAB betrachtet, da es angenommen wurde, das Wachstum von opportunistischen Bakterien und Pathogenen zu verhindern. Ziel dieser Arbeit war es, die Fähigkeit von Bakteriocinen zu zeigen, die Mikrobiota-Populationen in einem Mausmodell zu modulieren. Zu diesem Zweck wurde ein Verfahren entwickelt, um die Wirkung der Aufnahme von Bakteriocin-produzierenden Stämmen und deren isogenen nicht-produzierenden Stämmen zu vergleichen. Die Vorgehensweise für die Inokulation und die Zeitverlängerung des Assays sind in Abbildung 1 dargestellt . Die Mäuse wurden in elf Käfige gruppiert: eine Kontrolle ohne Behandlung, fünf Käfige, die mit Bakteriocin-Produzenten-Stämmen behandelt wurden, und fünf Käfige, die mit den entsprechenden isogenen Mutanten behandelt wurden, die eine reduzierte oder keine Bakteriocin-Produktion hatten. Das getestete Bakteriocin-produzierende LAB, sowie die jeweiligen Zählungen (cfu / mL) im Trinkwasser und zählt im Kot, sind zusammengefasst
Abbildung 1: Schema zeigt den Zeitverlauf Design des ExpeRichten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Nachweis der Bacteriocin-Produktion in LAB, die aus Fäkalien durch ein Dreischicht-Protokoll gewonnen wurde (wie in der Prozedur beschrieben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich der Zusammensetzung von Bakterienbehandlungen. Ein PCoA-Plot wurde basierend auf den berechneten Abständen in einer ungewichteten UniFrac-Matrix erzeugt. Verschiedene Zeitpunkte aus derselben Stichprobe ( et al. , 2016 12 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Veränderungen der relativen Häufigkeit von LAB- und Bacteriocin-zielgerichteten Bakteriengruppen auf der Gattungsebene während der Behandlung und Nachbehandlungsperioden. VeränderungS in den relativen Häufigkeiten von Gattungen in Behandlungen, die in Bezug auf die Zeit 0 erhalten wurden, wurden mit denen in der Kontrollgruppe (CON) verglichen. Zur Klarheit der Darstellung werden nur vier Stämme gezeigt: Garvicin- und Sakacin-Produzent und Nicht-Produzenten-Stämme (siehe Legende in der Figur, um Farbe und Behandlung zu verknüpfen). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Der Signifikanzgrad wird wie folgt dargestellt: P <0,1 mit Punkt (.); P <0,05 mit einem Stern (*); P <0,01 mit zwei Sternen (**). Angepasst von Umu et al. , 2016 12 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Korrelationsnetzwerk der relativen Häufigkeit von OTUs am Tag 14 und Serumstufen. Die Korrelationen waren caLokuliert mit Pearsons Korrelation in CoNet. Nur die signifikanten (P <0,05) werden im Netzwerk angezeigt. Die im Serum ermittelten Parameter, Cholesterin ( Chol ), hochdichtes Lipoprotein ( HDL ), LDL ( LDL ) mit niedriger Dichte und Triglyceride ( Trig - werden durch eine Farbe (grau) dargestellt, während OTUs, die zu verschiedenen Familien gehören, dargestellt werden Verschiedene Farben (siehe Legende) Positive Korrelationen werden mit grünen Kanten und negativen Korrelationen mit roten Kanten angezeigt OTUs auf den Knoten werden mit OTU-Nummern oder der Gattung dargestellt, denen sie angehören. Angepasst von Umu et al. , 2016 12 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Inokuliert im Trinkwasser | Milchsäurebakterien zählt im Kot | Indikatorstämme | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (mittleres log10) | |||
| STEUERN | ---- | 10 Mäuse | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 Mäuse | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) | 2,0 | 9 Mäuse | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 Mäuse | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 Mäuse | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 Mäuse | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 gehärtet -) | 10 | 9 Mäuse | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (Pflanze +) | 26 | 9 Mäuse | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (Pflanze -) | 23 | 9 Mäuse | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 Mäuse | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 Mäuse | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) für SakA und PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) für Enterocine, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) für Plantaricine und Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) für GarML. | ||||
Tabelle 1: Inokulierte Stämme und die Zählungen in Fecal-Proben.
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Discussion
Das hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um festzustellen, ob Veränderungen in der Mikrobiota an Gesundheit oder Alter gebunden sind. Verschiedene Teile des Protokolls sind wichtig, aber unter ihnen werden die Fäkalien entnommen, das DNA-Fragment sequenziert und analysiert, und die Durchführung der DNA-Extraktion und der bioinformatischen Analyse könnten sicherlich die kritischsten Punkte sein. Das Sampling ist entscheidend, weil aus ethischen Gründen Mäuse nicht gestresst werden sollten und weil es bekannt ist, den Anteil der Bakterien im Darm zu verändern. Proben müssen so schnell wie möglich verarbeitet werden oder sollten bis zur Verwendung eingefroren werden, da einige Bakterien sehr empfindlich gegenüber Dehydratation und / oder Sauerstoff sind. Die Auswahl des aus den amplifizierten 16S-rRNA-Genen zu sequenzierenden DNA-Fragments ist ein entscheidender Punkt. In dieser Arbeit wurden die variablen Regionen V3 - V4 ausgewählt 25 . Die Bedeutung der DNA-Extraktionsmethode darf nicht unterschätzt werden, da die in den Proben vorhandenen Bakterienzellen nicht alle gleich sindDie für verschiedene Lyseprotokolle empfindlich sind, und Vorurteile bei der Schätzung der Bakterienpopulationen können aus einer unvollständigen Lyse resultieren. Daher ist die Einführung eines Wulstschlägers erforderlich. Isogene Stämme können durch genetisches Knockdown oder durch Plasmidkuration konstruiert werden, obwohl im Falle von Stämmen, die gegenüber Transformation chronosomenkodierten Bakteriocinen refraktär sind, ein Problem darstellen können. Dieses Verfahren kann unter Verwendung von verschiedenen spezifischen Kultivierungstechniken, wie anaerobe Verfahren 26 angepasst werden.
Das Verfahren kann in den meisten Schritten modifiziert werden, abhängig von der Art der zu untersuchenden Faktoränderungen. Das Inokulationsverfahren könnte verkürzt werden, aber Änderungen an Serumparametern können etwas Zeit entwickeln, um sich zu entwickeln. Eine mögliche Einschränkung des Verfahrens könnte die Untersuchung von Bakterienstämmen (Nährstoffen oder Verbindungen) sein, die nicht mehrere Stunden im Wasser überleben können oder die sich verteilen können (oder für Verbindungen ausfallen). Das ist also ein Faktor, So in Betracht gezogen werden
Bisher wurde die Bakteriocin-Aktivität in vitro 27 , 28 , 29 oder in gemischten Kulturen 30 bestimmt . Diese Methode hat die in vivo Überwachung der Aktivitäten von fünf Bakteriocinen aus der Ganz-Darm-Mikrobiota von Standard-Labor-Mäusen ermöglicht. Es könnten kleine Variationen in Populationen sowie deren Einfluss auf andere Bakteriengruppen oder physiologische Faktoren wie Serumparameter 12 ermittelt werden . Bakteriocine haben ein relativ schmales Aktivitätsspektrum, das das Wachstum von taxonomisch verwandten Bakterien hemmt. Diejenigen, die in diesem Assay verwendet werden, gehören jedoch zu den wirksamsten, da einige von ihnen gegen Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 und sogar einige Stämme von Escherichia coli , wie im Fall von Sakacin A, aktiv sindAss = "xref"> 32. Bei der Inokulation von Mäusen führte die LAB, die Bakteriocine produzierte, nicht zu bemerkenswerten Veränderungen in der globalen Mikrobiota-Zusammensetzung, sondern zu einer reduzierten Anzahl von Bakterien-Taxa. Dennoch zeigte die globale Korrelationsnetzwerkanalyse interessante ökologische Kompatibilitäten und Antagonismus zwischen verschiedenen Bakterien. Diese Methode könnte angepasst werden, um die Wirkung von Lebensmittelbestandteilen, Arzneimitteln oder anderen Verbindungen zu analysieren, obwohl das erwartete Ergebnis bewusst beschränkt werden kann, um gesunde Bedingungen zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken der EEA Grant NILS Wissenschaft und Nachhaltigkeit Coordinated Mobility of Researchers (Referenz 017-ABEL-CM-2013). CB und GP-M. Wurden von der AGL2015-70487-P Stipendium des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit unterstützt. OCOU und DBD wurden von einem strategischen Stipendienprogramm für die Lebensmittelwissenschaftliche Forschung von der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) (Projekt 1205051025) unterstützt. Wir danken auch Inmaculada Noguera für ihre Unterstützung bei Tierpflege und Probenahme und Jesus Dehesa für seine Hilfe bei der Gewährleistung der Verfügbarkeit von Labormaterialien in der Tierfazilität. Wir schätzen auch Professor Lars-Gustav Snipen für seinen Rat über die Statistik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
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