Summary
Bacteriocins הם האמינו לשחק תפקיד מפתח בהגדרת מגוון חיידקים נישות אקולוגיות שונות. כאן, אנו מתארים הליך יעיל כדי להעריך כיצד bacteriocins להשפיע על ההרכב microbiota המעיים במודל חיה.
Abstract
שאלות מעניינות מאוד מתעוררות עם הידע המתקדם שלנו על הרכב מיקרוביוטה במעיים ועל הקשר עם הבריאות, במיוחד ביחס לגורמים התורמים לשמירה על מאזן האוכלוסייה. עם זאת, יש מתודולוגיות זמין מוגבל להעריך גורמים אלה. Bacteriocins הם פפטידים מיקרוביאלית המיוצרים על ידי חיידקים רבים אשר עשויים להעניק יתרון תחרותי לרכישת מזון ו / או נישה הקמת. הרבה חיידקי חומצה לקטית פרוביוטיים (LAB) יש פוטנציאל גדול לקדם בריאות האדם ובעלי חיים על ידי מניעת צמיחה של פתוגנים. הם יכולים לשמש גם עבור אפנון immuno, כפי שהם מייצרים bacteriocins. עם זאת, פעילות אנטגוניסטית של בקטריוצינים נקבע בדרך כלל על ידי bioassays במעבדה בתנאים מוגדרים אך מופשטים יתר על המידה לעומת הסביבה המעיים מורכבת בבני אדם ובעלי חיים, שבו חיידקים הפנים השפעות multifactorial מן המארח ומאות מיני מינים של מיקרוביאליתניר באותה נישה. עבודה זו מתארת הליך שלם ויעיל להערכת ההשפעה של מגוון של bacteriocins עם ספציפיות מטרה שונים במערכת Murine. שינויים בהרכב microbiota במהלך הטיפול bacteriocin מנוטרים באמצעות רצף 16S rDNA ההלחנה. הגישה שלנו משתמשת הן את המפיקים bacteriocin ואת האיסוגני שלהם שאינם bacteriocin בייצור מוטציות, האחרון נותן את היכולת להבחין בין bacteriocin הקשורות מ שאינם bacteriocin הקשורים שינויים של המיקרוביוטה. מיצוי דנ"א צואה ושיטות רצף 16S rDNA הם עקביים, יחד עם הביואינפורמטיקה, מהווים הליך חזק למצוא שינויים חלשים בפרופילים חיידקים כדי לקבוע מתאמים, במונחים של כולסטרול וריכוז טריגליצרידים, בין אוכלוסיות חיידקים וסמנים בריאותיים. הפרוטוקול שלנו הוא גנרי ולכן יכול לשמש כדי ללמוד תרכובות אחרות או חומרים מזינים עם פוטנציאל לשנות את המיקרופון המארחהרכב robiota, גם כאשר לומדים רעילות או השפעות מועילות.
Introduction
Bacteriocins הם פפטידים אנטי מיקרוביאליים המיוצרים על ידי מגוון רחב של מינים חיידקים 1 , 2 . תרכובות אלו ומפיקים שלהם, במיוחד LAB, נחקרו ומנוצלים ברחבי העולם במשך עשרות שנים עבור יישומים פוטנציאליים שלהם לשימור מזון ותרופות 3. כמה בקטריוצינים ידועים להרוג פתוגנים חשובים, כולל מינים של ליסטריה, אנטרוקוקוס, סטפילוקוקוס, ו Bacillus . חלק bacteriocins אפילו יש את היכולת לווסת את התגובה החיסונית 4 . בקטריוצינים רבים יש ספקטרה צרה יחסית, רכוש זה מוערך הרבה ביישומים מסוימים. לדוגמה, כמה בקטריוצינים צרים-ספקטרום יכולים לשמש כדי לכוון פעילות ספציפית נגד קבוצות נבחרות של חיידקים בעייתיים, ללא הפרעה רבה בצמחייה או בצמחים המועילים החולקים את אותה גומחה; זה חיוני במיוחד באזור המעיים, שבו חיידקים מועילים רבים לשגשג באופן אינטראקטיבי ודינמי 5 . Bacteriocins הם גם מאוד אטרקטיבי לשימוש מניעתי או פרוביוטיקה, כפי שהם יכולים לדכא את (out) הצמיחה של פתוגנים, pathobionts, או חיידקים אופורטוניסטי שעשויים לא מאוזן את המעיים הומאוסטזיס 6 , 7 .
במונחים של טבעם ותכונותיהם הפיזיקוכימיות, הבקטריוצינים מגוונים מאוד, שכן יש להם מבנים שונים, תכונות ספציפיות, דרכי פעולה וכו '. רוב הבקטריוצינים נחקרו בפירוט רב במבחנה , אך מעטים מאוד נבדקו במזון מטריצות 8 , 9 או in vivo, כגון בבטן בעלי חיים 6 , 10 . המאפיינים חוץ גופית יכול להיות שונה במידה רבה כאשר מוערך in vivo בשל המורכבות oF הסביבה המעיים וגם השפעות בלתי רצויות משוערות על חיידקים מועילים. רוב פרוביוטיקה הם LAB. הם מייצרים מערך של מטבוליטים אחרים, כולל חומצות שומן קצרות שרשרת, אשר ידועים להשפיע על הפיזיולוגיה של המארח, כמו גם להפגין תכונות מיקרוביאלית כלפי חיידקים מסוימים. לכן, במקרה של זנים פרוביוטיים המייצרים בקטריוצינים, מומלץ לבסס מבחנים מציאותיים, כגון בעלי חיים בריאים עם מיקרוביוטה רגילה.
במחקר הנוכחי, אנו מספקים אסטרטגיה המאפשרת להעריך את ההשפעה של זנים שונים לייצור בקטריוצין, שבקטריוצינים בעלי ספקטרה מעכבת שונה, על עכברים בריאים. האסטרטגיה שלנו כוללת עכברים להאכיל עם מוטציות isogenic שאינם bacteriocin, אשר מאפשר את ההבחנה של ההשפעות מתווך bacteriocin מן ההשפעות non-bacteriocin בתיווך. רצף 16S rDNA מאפשר לעקוב אחר השינויים הדינמיים של האוכלוסייה חיידקים במעיים. Subsהניתוח הסטטיסטי השווה מפרק את המתאמים בין המינים החיידקיים וגם בין המינים החיידקיים לבין הפרמטרים הפיזיולוגיים הנמדדים ( למשל, משקל הגוף, פרמטרים ביוכימיים בסרום וכד ' ). אנו מאמינים כי הפרוטוקול המוצג במחקר זה הוא גם ישים ליישומים פרוביוטיות או פרביוטיות אחרות מעבר המחקר של bacteriocins בבעלי חיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול והטיפול חייבים להתבצע ביחידה מיוחדת לטיפול בבעלי חיים. הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקביל של אוניברסיטת ולנסיה והרשויות המקומיות, בעקבות העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה חובה על ידי האיחוד האירופי חוק 2010/63 / האיחוד האירופי ואת ממשלת ספרד RD 53/2013 על הגנה על בעלי חיים המשמש למטרות מדעיות, על מנת לכבד את העיקרון 3R בניסויים בבעלי חיים (החלפת, צמצום, שיפור).
1. תרבויות בקטריאלי קפוא המשמש לחיסון עכברים
- לחסן זנים בודדים של LAB ב 5 מ"ל של הלב המוח אינפוזיה (BHI) בינוני לגדל אותם 20 - 24 שעות (לילה) ב 30 מעלות צלזיוס.
- לדלל כל לילה תרבות חיידקים פי 100 ב BHI ידי העברת 2 מ"ל של תרבות לילה ל 200 מ"ל של BHI. לגדל אותם על 30 מעלות צלזיוס למשך 20 - 24 שעות.
הערה: זנים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 1. - קציר יLls ידי צנטריפוגה ב XG 5000 במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר את supernatant לשטוף את התאים פעמיים על ידי השעיית כל גלולה התא 100 מ"ל של קר כקרח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) ולאסוף את התאים כמו בשלב 1.3.
- לאחר לשטוף השני, להשעות כל גלולה תא 20 מ"ל של גליקרול קר 15% קר ב PBS.
- Aliquot ההשעיה התא לתוך 1-כרכים מ"ל בצינורות ולאחר מכן לאחסן אותם -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
הערה: תאים יש להשתמש תוך 1-2 חודשים לאחר נקודה זו. - לקבוע את מספר התא לפני האחסון לפני הממשל כך מספר תאים חיים שניתן לעכברים ידוע.
- עבור ספירת תאים, לעשות פי עשרה דילולים סדרתיים של תאים קר כקרח 0.9% נתרן כלוריד (NaCl) פתרון. מורחים 100 μL של דילול כל על צלחת אגר BHI. דגירה לילה (20 - 24 שעות) ב 30 מעלות צלזיוס עבור גידול התאים היווצרות המושבה, האחרון כדי לקבוע מושבות להרכיב יחידות (cfu) / מ"ל.
- כדי להפוך את מי השתייה המכילים חיידקים, לדלל תאים של כל תרבות מלאי חיידקים ב 100 מ"ל של מי שתייה מסוננים, עם ממוצע cfu ממוצע של 10 9 / מ"ל של מים. עבור הערכת הישרדות חיידקים, לספור תאים חיים רק לאחר דילול ואחרי 24 שעות פעם בשבוע במהלך השבועיים הראשונים של טיפול חיידקים.
2. עכברים Assay ועיצוב ניסיוני
הערה: ספציפית ללא מחלה (SPF) BALB / c עכברים נקבה צעירה (6 - 8 שבועות) נדרשים עבור הניסוי הזה; כאן, נרכשו 100 בעלי חיים.
- לספק את העכברים עם גישה חופשית מזון pelleted ומים לאורך הניסוי.
- לעצב את הניסוי ולחשב את הכוח.
- אם לכל טיפול יש שליטה משלו, יש ליישם עיצוב משולב של בקרת מקרה (t-test). השתמש assay ראשוני לחשב את הממוצע ואת שגיאת תקן של האפקט החשוב ביותר (ים) כדי להיקבע. לייעל את העוצמה של assay ואת מספר בעלי החיים הדרושים לכל קבוצה באמצעות שיטות שונות ותוכניות זמין באופן חופשי 11 .
- כדי לבדוק את ההשפעות של המפיק bacteriocin לעומת זנים שאינם מפיקים, להשתמש 9 בעלי חיים לכל תנאי הניסוי.
הערה: מספר זה נקבע על סמך שגיאת התקן הניסויית והספק כוח מספק (0.7-0.0) ורמת מובהקות מתחת ל -0.05.
הערה: בדוגמה נתונה, 11 קבוצות של עכברים נעשו, אחת לכלוב. עשרה כלובים התאימו לטיפולים עם 5 זנים מייצרים bateriocin ו -5 זנים איזוגניים שאינם מייצרים; לכלוב ה -11 היו 10 עכברים והיוו את השליטה הלא מטופלת.
- לאחר הגעתם של העכברים למתקנים, להפיץ אותם בכלובים האוזן תווית החיות כדי לאפשר מעקב אישי. התאקלמות העכברים למתקנים ותנאי החיזוק במשך שבוע לפני עמ 'מתגלגל.
- הכינו מים המכילים חיידקים, כמתואר בשלב 1.8, ומניחים בקבוקי מי שתייה בכלובים עצמאיים המתאימים, כי הם מזוהים בבירור כך העכברים בכל כלוב לחלוק את אותו בקבוק מים.
הערה: יש לשמור על קבוצת הביקורת בכלוב נפרד, ללא מגע עם החיידקים הנבדקים. - הכן בקבוק חדש עם מי שתייה טריים (100 מ"ל) בכל יום ולהוסיף המתלים חיידקים טריים להפשיר. האם זה במשך 15 ימים רצופים.
- בצע את הטיפול חיידקים עם תקופה של שבועיים, במהלכן עכברים זמן לשתות מים ללא חיידקים ( איור 1 ).
3. איסוף דוגמאות
- איסוף דגימות צואה.
- הכן כלובים autoclaved (ריק) ו מלקחיים סטרילית תווית סטרילי 1.5 מ"ל צינורות עבור כל עכבר.
- איסוף דגימות באותו זמן של היום, כדי למנוע וריאציות הרכב מיקרוביוטה במהלך הכמובן של יום. לקבלת תוצאות אופטימליות, לאסוף דגימות טריות בנפרד.
הערה: רצוי לאסוף צואה מוקדם בבוקר, כאשר עכברים נוטים להפריע באופן ספונטני. - נקי כלוב ריק עם אלכוהול 70% במקום עכבר בפנים. אפשר לו להספיק, ולאסוף 2 - 4 כדורי צואה באמצעות מלקחיים סטרילית, הצבת אותם צינורות 1.5 מ"ל.
הערה: לפעמים זה מספיק כדי להחזיק את זנב העכבר כלפי מעלה; את הצואה ניתן לאסוף ישירות מן פי הטבעת לתוך צינור. - איסוף דגימות צואה מכל עכבר פעם בשבוע במהלך הניסוי ארבעה שבועות ( איור 1 ). איסוף דגימות הראשון ביום הראשון (T0, זמן אפס), ממש לפני החשיפה של העכברים לחיידקים. לאסוף את דגימות צואה הבא על ימים 7, 14, 21, ו 28.
- לקרר את דגימות ב 4 ° C עד ההעברה שלהם למעבדה, שם הם קפואים ב -80 ° C. לתכנן מראש ולספק מספיק תיבות אחסון, כמו מספר גדול של feדגימות קאליות ייאספו במהלך הניסוי.
- לשקול את כל העכברים בכל שבוע ביום איסוף צואה.
- לאסוף דגימות דם מעורק הפנים מכל העכברים ביום 15 th, היום האחרון של ממשל חיידקים, וכן לקבוע את הרמות הטריגליצרידים, כולסטרול כללי, ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) ב סרום דם.
הערה: צוות מנוסה צריך לאסוף את הדם כדי להפחית את הלחץ אצל בעלי החיים.
4. LAB לספור פעילות Bacteriocin
- לשקול גלולה צואה אחת של כל דגימה בצינור 1.5 מ"ל ולהוסיף נפח נאותה של קר כקרח 0.9% NaCl להשיג פתרון 10% (w / v). השתמש micropestles סטרילית עבור צינורות 1.5 מ"ל כדי homogenize ההשעיה צואה ולהכין פי עשרה דילולים סדרתיים קר כקרח 0.9% NaCl.
- לספור את המספר הכולל של תאים LAB.
- העברת תאים מדולל (100 μL) ל 4 מ"ל של MA prewarmedN Rogosa שארפ (MRS) אגר רך (50 מעלות צלזיוס, אגר 0.8%). מערבבים על ידי vortexing לפני לשפוך את התאים על צלחת אגר מוצק MRS (אגר 1.5%).
- יבש את הצלחת על ידי לקיחת המכסה כבוי 5 - 10 דקות במכסה המנוע סטרילי לפני הדגירה התאים 20 - 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עבור גידול תאים הקמת המושבה.
- לספור תאים bacteriocin לייצר.
- העברת תאים מדולל (100 μL) של המפיק bacteriocin ל 4 מ"ל של אגר אקסטרה MRS prewarmed (50 מעלות צלזיוס, אגר 0.8%), לערבב ידי vortexing, ושופכים את התאים על גבי צלחת אגר MRS (אגר 1.5%); שכבה זו מכונה השכבה הראשונה.
- מעבירים עוד 4 מ"ל של אגר MRS ללא אגר רך (אגר 0.8%) על השכבה הראשונה להטביע את כל התאים בתוך אגר רך.
הערה: שכבה זו נועדה למנוע תאים מ גדל כמו מושבות על פני השטח של צלחות אגר. תאים הגדלים על פני השטח הם נעקרו בקלות כאשר שופכים תאים מחוון על העליונה (שלב 4.3.4) וולכן יסבך את פרשנות התוצאות. שכבה זו מכונה השכבה השנייה. - יבש את הצלחת על ידי לקיחת המכסה כבוי 5 - 10 דקות במכסה סטרילי לפני הדגירה של 20 - 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עבור גידול תאים הקמת המושבה.
- כדי לזהות מושבות לייצר bacteriocin, לערבב 40 μL של תרבות לילה של זן מחוון מתאים, כפי שמוצג בטבלה 1 , עם 4 מ"ל של אגר רך prewarmed. יוצקים את התערובת על הצלחת; שכבה זו מכונה השכבה השלישית.
- יבש את הצלחת על ידי לקיחת המכסה כבוי 5 - 10 דקות במכסה סטרילי לפני הדגירה של 20 - 24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עבור גידול תאים הקמת המושבה.
הערה: מושבות Bacteriocin לייצר יש אזורים (עיכוב) ברור סביב המושבות ( איור 2 ).
5. DNA הפקה, הגברה 16S rDNA, ואת רצף
הערה: שלבים ואו מיצוי דנ"א מתוארים לשימוש בערכה מסחרית ( למשל, RealPure "SSS" Kit).
- להשעות 1 - 2 כדורי עכברים צואה (~ 200 מ"ג) ב μL 300 של תמיסת תמוגה.
- מעבירים את המדגם microtube 2 מ"ל שבו כ 0.5 גרם של חרוזי זכוכית (קוטר: 0.1 מ"מ) בעבר הוצבו.
- הוסף 1 μL של mutanolysin ב 10 U / μL ו 2 μL של ליזוזים ב 20 מ"ג / מ"ל לכל מדגם ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות. המשך עם אחד הפרוטוקולים סטנדרטי עבור מיצוי דנ"א מדגימות צואה 12 .
- החל שני מחזורים של צעדים beat-beater, 1 דקות כל אחד.
- הוסף 2 μL של proteinase K ומערבבים היטב.
- לדגור על 20 דקות ו מערבולת כל 5 דקות.
- מגניב את הדגימות ל 37 מעלות צלזיוס ולהוסיף 1 μL של 5 מיקרוגרם / מ"ל RNase A למדגם. מערבבים היטב.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
- מגניב את דגימות לטמפרטורת החדר ולהוסיף 180 μLשל פתרון משקעים חלבונים. וורטקס במרץ במהירות מרבית עבור 20 - 30 שניות.
- צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 5 דקות. אם יש חלקיקים צפים supernatant, דגירה דגימות בקרח במשך 5 דקות ואז צנטריפוגות שוב.
- מעבירים את supernatant המכיל את ה- DNA ל microtube 1.5 מ"ל חדש המכיל 300 μL של איזופרונול.
- מערבבים על ידי הפיכת צינורות 20-30 פעמים ו דגירה עבור 1 שעה ב -20 מעלות צלזיוס. לחלופין, דגירה של צינורות במשך תקופה ארוכה יותר ( למשל, לילה).
- צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 2 דקות.
- הסר את supernatant ויבש את הצינור על נייר סופג. הוסף 300 μL של אתנול 70% לשטוף את גלולה דנ"א.
- צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 1 דקות, להסיר את supernatant, ולהשאיר את גלולה להתייבש במשך כ 15 דקות.
- לאחר גלולה יבש, להוסיף 100 μL של מים סטריליים או טריס (10 מ"מ) / EDTA (1 מ"מ) חיץ resuspend גלולה.
- כדי למנוע כל מעכב אפשריתרכובות במהלך השלבים הבאים, לנקות את ה- DNA. מערבבים DNA מופק עם 2 כרכים (200 μL) של NTI חיץ כדי להתאים את תנאי מחייב עבור שלב 5.15.
- מניחים קרום סיליקה המכיל PCR לנקות את הטור לתוך צינור אוסף (2 מ"ל) לטעון את המדגם.
- צנטריפוגה עבור 30 s ב 11,000 x גרם. מחק את הזרימה דרך.
- לשטוף את הממברנה סיליקה עם 700 μL של NT3 חיץ לחזור על צעד 5.16.
- יבש את הממברנה סיליקה על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב XG 11,000 להסיר כל שאריות אתנול המכיל לשטוף NT3.
- מעבירים את הטור ל microtube 1.5 מ"ל חדש דגירה דקות 2 - 5 ב 70 מעלות צלזיוס עבור הסרת סך של אתנול.
- הוסף 30 μL של מים כיתה PCR ו דגירה 5 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. Elute ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 11,000 x גרם.
- לכמת את ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV / Vis או שיטה fluorometric.
- לנרמל את הבריכה דגימות דנ"א של עכברים חולקים אותו כלוב ב EA נקודת זמן.
- כדי לבחון וריאציות בודדות במהלך הזמן, רצף דגימות DNA מ שלושה עכברים שנבחרו באופן אקראי מן השליטה ושני כלובים אקראיים אחרים על ימים 0, 14, ו - 28.
6. 16S rRNA הגברה גנטית רצף
- הכן ספריה של גנים 16S מוגבר rRNA. להגביר את אזור V3-V4 של הגן 16S rRNA חיידקי 5 באמצעות פריימרים קדימה ופוכה עם מתאמי הצפת מתאים:
5-TCG TCG GCA GCG TCA גאט גטג טאט אאג AGA CAG CCG ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5-GTC TCG TGG GTC CGG AGA TGT GTA TAA GAG GAA ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - בדוק את להקות מוגבר באמצעות אלקטרופורזה עם 1% agarose ג'ל.
- לנקות את התגובה שרשרת פולימראז (PCR) מוצרים באמצעות חרוזים מגנטיים עבור טיהור amplicon.
- בצע את השלבים הבאים כפי שצוין על-ידי היצרן בהתאם לפלטפורמה הרציפה המסיבית המשמשת> 6.
7. ניתוח נתונים וסטטיסטיקות
- סינון איכות (מבוצע בדרך כלל במתקני רצף).
- סנן את נתוני הקריאה הגולמיים ו- de-multiplex באמצעות התוכנה המסופקת עם הציוד.
- לעבד את זוג סוף סוף קורא באמצעות צינור UPARSE 13 מיושם USEARCH 14 (גרסה 7.0.1090). מזג את הקצוות המשויכים וליישם סינון איכות באמצעות ערך מקסימלי של שגיאה (maxee) של 1.0. מחק sequences פחות מ 150 nt. רצף Derelicate כדי להשליך בודדים.
- אשכול רצפים ליחידות טקסונומית מבצעית (OTUs) על רצף 97% רצף ולהשתמש UCHIME 15 כדי לסנן רצפי chimeric.
- OTU לקטוף, המשימה טקסונומי שחזור פילוגנטי, וניתוח גיוון חזותיים.
- תהליך OTUs באמצעות תובנות כמותיות IntO אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) 16 .
- בחר וליישר את OTUs נציג נגד מסד הנתונים Greengenes הליבה להגדיר 17 באמצעות PyNAST 18 עם זהות מינימלית של 75% (ברירת המחדל).
- להקצות טקסונומיה רצפים מיושר באמצעות פרויקט מסד נתונים ריבוזומלי (RDP) מסווג תוכנית 19 עם ביטחון של 0.8.
- לנרמל את הטבלה OTU לספירת רצף המדגם עם עומק רצף הנמוך ביותר.
- בניית עץ פילוגני מ רצפים מיושר באמצעות עץ מהיר 20 לאחר צעד סינון על מנת להסיר אזורים מאוד משתנה עמדות כי הם כל הפערים. השתמש בעץ זה כדי לחשב הבדלים אלפא ובטא ולחשב עקומות נטייה ומדדי שאנון.
- כדי ליצור ולחזות UniFrac מדדי מרחק לא משוקלל 21 , השתמש ניתוח עקוב אחר (PCoA).
הערה: עבור sניתוח טטיסטי, ניתן להשתמש בחבילות תוכנה שונות, כגון R 22 או הכלים הסטטיסטיים שיושמו בתוך QIIME 16 . - לשם השוואה בין המדדים השונים של שאנון בין הטיפולים השונים, השתמשו ב- ANCOVA, בהתחשב בזמן כמשתנה תלוי מתמשך ב- R.
- השווה את המרחקים בין טיפולים ב- PCoA ב- QIIME באמצעות מבחן דו-צדדי של סטודנט, וחשב את ערכי p-nonparametric עם 1,000 תמורות מונטה קרלו באמצעות תיקון Bonferroni.
- לנתח עבור מתאמים בין השפע היחסי של OTUs ספציפיים ופרמטרים נמדדים אחרים, כגון רמות של כולסטרול בדם, HDL, LDL, וכו ' , תוך ניתוח Pearson קורלציה. לשם כך, להשתמש CoNet 23 עם הדמיה הבאים של רשתות המתאם באמצעות Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הייצור של בקטריוצינים נחשב לתכונה פרוביוטית חיובית LAB, כפי שהוא הניח למנוע את הצמיחה של חיידקים פתוגנים פתוגנים. מטרת עבודה זו היתה להראות את היכולת של bacteriocins כדי לווסת אוכלוסיות microbiota מעי במודל עכבר. לשם כך, נוהל פותח כדי להשוות את ההשפעה של צריכת זנים לייצור bacteriocin ואת הזנים שלהם שאינם מייצרים איזוגניים. הליך החיסון ואת הארכת הזמן של assay מוצגים באיור 1 . עכברים היו מקובצים לאחד עשר כלובים: שליטה ללא כל טיפול, חמישה כלובים שטופלו עם זנים של המפיק בקטריוצין, וחמישה כלובים שטופלו במוטציות איזוגניות מקבילות שהפחיתו או לא של ייצור בקטריוצין. הנבדק נבדק חיידקים LAB, כמו גם את הספירות בהתאמה (cfu / mL) במי שתייה וספירות צואה, מסוכמים ב
איור 1: Scheme מציג את זמן קורס עיצוב של Expe. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: איתור של Bacteriocin ייצור ב LAB משוחזר מצואה על ידי פרוטוקול שלוש שכבות (כפי שתואר בנוהל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
תרשים 3: השוואה בין הרכב הטיפולים בקטריה. העלילה PCoA נוצר על סמך מרחקים מחושב מטריקס UniFrac unweighted. נקודות זמן שונות מאותו מדגם ( et al. , 2016 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: שינויים בשכיחות היחסית של LAB וקבוצות חיידקיות ממוקדות בקטריוצין ברמת הסוג במהלך תקופת הטיפול והטיפול. שינויS בשכיחות היחסית של גנרה בטיפולים, שהושגו ביחס לזמן 0, הושוו לאלה בקבוצת הביקורת (CON). להבהרה של האיור, מוצגים רק ארבעה זנים: מפיק גרוויצין וסקאצין וזנים שאינם מפיקים (ראה את האגדה בדמות המפרטת צבע וטיפול). ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן. דרגת המשמעות מיוצגת כדלקמן: P <0.1 עם נקודה (.); P <0.05 עם כוכב אחד (*); P <0.01 עם שני כוכבים (**). הסתגלות מ Umu et al. , 2016 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: רשת המתאם של השפע היחסי של OTUs ביום 14 רמות בסרום. המתאמים היוLculated באמצעות המתאם של Pearson ב CoNet. רק אלה המשמעותיים (P <0.05) מוצגים ברשת. פרמטרים שנקבעו בסרום - כולסטרול כללי ( Chol ), ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה ( HDL ), ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה ( LDL ) וטריגליצרידים ( Trig) - מוצגים בצבע אחד (אפור) ואילו OTUs השייכים למשפחות שונות מיוצגים על ידי צבעים שונים (ראה אגדה). מתאמים חיוביים מוצגים עם קצוות ירוקים, ומתאמים שליליים עם קצוות אדומים. OTUs על צומת מיוצגים עם מספרי OTU או הסוג שאליו הם משתייכים. מעובד מתוך UMU et al., 2016 12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| מחוסן במי שתייה | חיידקי חומצה לקטית סופרת בצואה | זני אינדיקטור | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (ממוצע log10) | |||
| לִשְׁלוֹט | ---- | 10 עכברים | ND | |
| Lactobacillus סאקי B1500 (סקה +) | 1.6 | 9 עכברים | 8.53 ± 0.18 | אנטוקוקוס פאסיום P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus סאקי B1501 (סאקה -) | 2.0 | 9 עכברים | 8.22 ± 0.05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (פד +) | 26 | 9 עכברים | 8.73 ± 0.12 | אנטוקוקוס פאסיום P21 (LMG 2783) |
| פדיוקוS acidilactici B1503 (פד -) | 25 | 9 עכברים | 8.75 ± 0.09 | |
| B1504 פאציום אנטרוקוקוס (+ WT L50) | 6 | 9 עכברים | 8.83 ± 0.14 | פדיוקוקוס דמנוסוס (LMG 3397) |
| B1505 אנטרוקוקוס פאציום (נרפא L50 -) | 10 | 9 עכברים | 8.72 ± 0.14 | |
| Lactobacillus Plantarum B1507 (צמח +) | 26 | 9 עכברים | 9.14 ± 0.14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus Plantarum B1508 (צמח -) | 23 | 9 עכברים | 8.60 ± 0.18 | |
| Lactococcus Garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 עכברים | 8.41 ± 0.08 | לקטוקוקוס לקטיס IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 עכברים | 8.05 ± 0.18 | |
| P21 פאציום אנטרוקוקוס (LMG 2783) עבור סקא ו PedPA-1, damnosus Pediococcus (LMG 3397) עבור enterocins, spp לקטובצילוס. 965 (LMG 2003) עבור Plantaricins, ו Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) עבור GarML. | ||||
טבלה 1: זנים מחוסנים והספירה בדגימות צואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך המתואר כאן שימש כדי לקבוע אם השינויים המיקרוביטים קשורים לבריאות או לגיל. חלקים שונים של הפרוטוקול הם חשובים, אבל ביניהם, דגימה של הצואה, בחירת קטע ה- DNA להיות רצף וניתח, וביצוע מיצוי ה- DNA וניתוח ביואינפורמאטי בהחלט יכול להיות נקודות קריטיות ביותר. הדגימה היא קריטית, כי מסיבות אתיות, עכברים לא צריך להיות הדגיש כי זה ידוע לשנות את חלקם של חיידקים במעיים. דוגמאות יש לעבד בהקדם האפשרי או צריך להיות קפוא עד השימוש, כמו כמה חיידקים רגישים מאוד להתייבשות ו / או חמצן. הבחירה של קטע ה- DNA להיות רצף מן הגנום 16S rRNA הגנים היא נקודה מכריעה. בעבודה זו נבחרו אזורי המשתנים V3 - V4 25 . את החשיבות של שיטת החילוץ דנ"א לא צריך לזלזל, כמו תאים חיידקיים הנוכחי הדגימות הם לא כל eqרגיש לרוחב פרוטוקולי תמוגה שונים, ועל הטיות בהערכת אוכלוסיות חיידקים יכול לנבוע תמוגה חלקית. לכן, ההקדמה של צעד beater beater נדרש. זנים איזוגניים ניתן לבנות על ידי מציצה גנטית או על ידי אוצר פלסמיד, אם כי במקרה של זנים, עקשן לשינוי כרומוזום מקודד בקטריוצינים עשוי לייצג בעיה. הליך זה יכול להיות מותאם באמצעות טכניקות שונות culturing ספציפיים, כגון שיטות אנאירוביות 26 .
ניתן לשנות את הפרוצדורה ברוב השלבים, בהתאם לסוג השינוי בגורמים שיש ללמוד. ניתן לצמצם את תהליך החיסון, אך שינויים בפרמטרים בסרום עשויים להזדקק לזמן מה. הגבלה אפשרית של השיטה יכולה להיות מחקר של זנים חיידקיים (חומרים מזינים או תרכובות), כי לא יכול לשרוד כמה שעות במים או שעלול לגבש (או לזרז עבור תרכובות). לפיכך, זה גורם שחייב אל אז יש לשקול.
עד כה, פעילות הבקטריוצין נקבעה בדרך כלל במבחנה 27 , 28 , 29 או בתרבויות מעורבות 30 . שיטה זו אפשרה את ניטור vivo של פעילויות של חמישה bacteriocins מן המיקרוביוטה של כל המעיים של עכברים סטנדרטיים במעבדה. שינויים קטנים אוכלוסיות ניתן לקבוע, כמו גם השפעתם על קבוצות חיידקים אחרים או גורמים פיזיולוגיים, כמו פרמטרים סרום 12. לבקטריוצינים יש ספקטרום פעילות צר יחסית, המעכב את הצמיחה של חיידקים הקשורים לטקסונומיה. עם זאת, אלה המשמשים assay הם בין היעילים ביותר, כמו כמה מהם פעילים נגד סטאפילוקוקוס aureus , ליסטריה מונוציטוגנים 31 , ואפילו כמה זנים של Escherichia coli , כמו במקרה של sakacinהתחת = "xref"> 32. כאשר מחוסן בעכברים, LAB לייצר bacteriocins לא עורר שינויים מרשימים בהרכב מיקרוביוטה העולמי, אלא למספר מופחת של המינונים חיידקים. עם זאת, ניתוח רשת מתאם עולמי חשף התאמה אקולוגית מעניינת ואנטגוניזם בין חיידקים שונים. שיטה זו יכולה להיות מותאמת כדי לנתח את ההשפעה של מרכיבי מזון, תרופות, או תרכובות אחרות, אם כי התוצאה הצפויה עשוי להיות מוגבל בכוונה כדי לשמור על תנאים בריאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ל- EEA Grant NILS Science and Sustainability ניידות מתואמת של חוקרים (הפניה 017-ABEL-CM-2013). CB ו- GP-M. נתמכו על ידי מענק AGL2015-70487-P ממשרד הכלכלה והתחרות הספרדי. OCOU ו DBD נתמכו על ידי תוכנית מלגה אסטרטגית למחקר מדעי המזון מן האוניברסיטה הנורבגית של מדעי החיים (NMBU) (פרויקט 1205051025). ברצוננו להודות Inmaculada Noguera על עזרתה עם טיפול בבעלי חיים ודגימה ישו Dehesa על עזרתו עם הבטחת הזמינות של חומרי מעבדה במתקן החיות. אנו מעריכים גם את פרופ 'לארס-גוסטב סניפן על עצתו על הסטטיסטיקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C.
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J.
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
