Summary
박테리오신은 다양한 생태 학적 틈새에서 미생물 다양성을 정의하는 데 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 여기서 우리는 박테리오신이 동물 모델에서 장내 미생물 구성에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다.
Abstract
매우 흥미로운 질문은 소화관 미생물 군의 구성과 건강과의 관계, 특히 인구 균형 유지에 기여하는 요인과 관련된 우리의 발전 지식에 의해 발생한다. 그러나 이러한 요소를 평가할 수있는 방법은 제한되어 있습니다. 박테리오신은 많은 박테리아에 의해 생산되는 항균 펩타이드로서 식품 획득 및 / 또는 틈새 설립에 경쟁 우위를 제공 할 수 있습니다. 많은 프로 바이오 틱 젖산균 (LAB) 균주는 병원균의 번식을 막음으로써 인간 및 동물의 건강을 증진 할 수있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 그들은 박테리오신을 생산하기 때문에 면역 조절에도 사용할 수 있습니다. 그러나 박테리오신의 길항 작용은 일반적으로 박테리아가 숙주와 수백 가지의 미생물 종으로부터 다기능 영향을받는 인간과 동물의 복잡한 내장 환경에 비해 잘 정의되었지만 단순화 된 조건 하에서 실험실 생물학적 검사에 의해 결정됩니다같은 틈새 시장을 노리고있다. 이 연구는 효과를 평가할 수있는 완전하고 효율적인 절차를 설명합니다 뮤린 시스템에서 다양한 표적 특이성을 갖는 다양한 박테리오신의 연구가 진행되고있다. 박테리오신 치료 동안 미생물 구성의 변화는 조성 16S rDNA 시퀀싱을 사용하여 모니터링된다. 우리의 접근법은 박테리오신 생산자와 균체 동성 비 박테리오 신 생성 돌연변이 체 모두를 사용하는데, 후자는 박테리오신 관련이 아닌 박테리오 신 관련 변형과 박테리오 신의 변형을 구분할 수있는 능력을 부여한다. 분변 DNA 추출 및 16S rDNA 시퀀싱 방법은 일관되고 생물 정보학과 함께 박테리아 프로파일의 희미한 변화를 발견하고 콜레스테롤 및 트리글리세리드 농도면에서 세균 집단과 건강 지표 사이의 상관 관계를 확립하는 강력한 절차를 구성합니다. 우리의 프로토콜은 일반적이므로 호스트 마이크를 변경할 가능성이있는 다른 화합물이나 영양소를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.독성 또는 유익한 효과를 연구 할 때 로비오타 조성물.
Introduction
박테리오신은 박테리아 (1, 2) 다양한 제조 항균 펩타이드이다. 이들 화합물과 생산자, 특히 LAB은, 탐구 및 식품 보존 및 의학 3에서의 응용 가능성에 대한 수십 년 동안 전 세계적으로 이용되고있다. Lactia, Enterococcus, Staphylococcus 및 Bacillus의 종을 포함하여 여러 가지 박테리오신이 중요한 병원균을 죽이는 것으로 알려져 있습니다. 일부 박테리오신은 면역 반응을 조절할 능력조차 가지고 있습니다 4 . 많은 박테리오신은 상대적으로 좁은 스펙트럼을 가지고 있는데, 이는 일부 응용 분야에서 크게 인정 받고 있습니다. 예를 들어, 일부 좁은 스펙트럼의 박테리오신은 동일한 틈새를 공유하는 공생 또는 유익한 식물상에 많은 방해없이 문제가되는 박테리아의 선택된 그룹에 대해 특정 활성을 지시하는 데 사용될 수 있습니다. 이것은 특히 내장 환경에서 필수적입니다.많은 유익한 미생물이 상호 작용하는 역동적 인 방식으로 5에서 성공 onment. 박테리오신은 또한 병원균, 병원균, 또는 장의 항상성을 불균형하게하는 기회 성 박테리아의 성장을 억제 할 수 있기 때문에 예방 또는 프로 바이오 틱 용도로 매우 유용합니다 6 , 7 .
그들의 성질과 물리 화학적 성질의 관점에서, 박테리오신은 구조, 표적 특이성, 작용 방식 등 이 매우 다양하기 때문에 매우 다양하다 . 대부분의 박테리오신은 시험 관내 환경에서 매우 상세하게 연구되었지만, 식품에서는 거의 시험되지 않았다 매트릭스 8 , 9 또는 생체 내에서, 예를 들어 동물 내장 6 , 10 . 시험 관내 특성은 생체 내 에서 복잡성 때문에 평가할 때 크게 다를 수 있습니다.장내 환경 및 유익한 박테리아에 대한 의도하지 않은 영향을 추정 할 수있다. 대부분의 probiotics는 LAB입니다. 그들은 호스트의 생리학에 영향을 미치는 것으로 알려진 단쇄 지방산을 비롯하여 특정 박테리아에 대한 항균성을 입증하기 위해 다양한 대사 산물을 생산합니다. 그러므로 박테리오신을 생성하는 프로 바이오 틱 균주의 경우 정상적인 미생물을 가진 건강한 동물과 같은 현실적인 분석법을 수립하는 것이 가장 좋습니다.
현재 연구에서, 우리는 건강한 마우스에 박테리오신이 다른 억제 스펙트럼을 갖는 다른 박테리오신 생산 균주의 효과를 평가할 수있는 전략을 제공한다. 우리의 전략은 비생산성 매개 효과로부터의 박테리오신 매개 효과의 분화를 가능하게하는 동위 원소 비 박테리오 신 돌연변이 체로 마우스를 먹이는 것을 포함한다. Sequencing 16S rDNA는 내장에서 박테리아 개체수의 동적 인 변화를 추적 할 수있게합니다. 하위등가 통계 분석은 박테리아 종과 박테리아 종과 측정 된 생리적 매개 변수 ( 예 : 체중, 혈청 생화학 매개 변수 등 ) 간의 상관 관계를 해독합니다. 우리는이 연구에서 제시된 프로토콜이 살아있는 동물의 박테리오신 연구 이외의 다른 프로 바이오 틱 또는 프리 바이오 틱 적용에도 적용 가능하다고 믿습니다.
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Protocol
관리 및 취급은 특수 동물 보호 장비에서 수행해야합니다. 여기에 설명 된 절차는 유럽 연합법 및 2010 / 63 / EU 및 스페인 정부의 동물 보호법 53/2013에 따라 의무화 된 실험실 동물 관리 원칙에 따라 발렌시아 대학 및 해당 지방 당국의 해당 윤리위원회의 승인을 받았습니다 동물 실험 (대체, 축소, 정제)에서 3R 원칙을 존중하기 위해 과학적 목적으로 사용됩니다.
1. 쥐를 접종하기 위해 사용되는 냉동 세균 배양액
- 30 mL에서 뇌 - 심장 주입 (BHI) 배지 5 mL에 LAB의 개별 변종을 접종하고 20 - 24 시간 동안 성장시킨다.
- BHI 200 ML에 야간 문화 2 ML을 전송하여 BHI에서 각 밤새 박테리아 문화를 100 배 희석. 30 - C에서 20 - 24 시간 동안 성장시킵니다.
참고 :이 연구에서 사용 된 균주는 표 1에 나와 있습니다. - 추수 감사절4 ℃에서 20 분 동안 5,000 xg에서 원심 분리하여 lls.
- 뜨는을 제거하고 얼음 찬 인산 버퍼 식염수 (PBS) 100 ML에 각 세포 펠렛을 일시 중지하고 1.3 단계에서와 같은 세포를 수집하여 세포를 두 번 씻으십시오.
- 두 번째 세척 후, PBS에서 얼음으로 차가운 15 % 글리세롤 20 ML에 각 세포 펠렛을 중단하십시오.
- 튜브에서 1mL 부피로 세포 현탁액을 나누어 준 다음 사용할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오.
참고 :이 시점 이후 1-2 개월 이내에 세포를 사용해야합니다. - 저장 전과 투여 전 세포 수를 결정하여 마우스에 주어진 생존 세포의 수를 알 수 있도록하십시오.
- 세포 계수를 위해 얼음처럼 차가운 0.9 % 염화나트륨 (NaCl) 용액에서 세포를 10 배 연속 희석하십시오. BHI 한천 플레이트에 각 희석액 100 μL를 퍼뜨립니다. 식민지 형성 단위 (cfu) / ML을 결정하는 후자의 세포 성장과 식민지 형성 30 ° C에서 하룻밤 (20-24 시간) 품어.
- 박테리아가 함유 된 음용수를 만들려면 100 mL의 멸균되고 걸러진 식수에 각각의 세균성 스톡 배양 배지의 세포를 희석하고 최종 평균 cfu는 10 9 / mL입니다. 박테리아 생존 평가를 위해 희석 직후와 박테리아 치료의 첫 2 주 동안 24 시간 후 일주일에 한 번씩 생균을 계산합니다.
2. 마우스 분석 및 실험 설계
참고 :이 실험에는 특정 병원체가없는 (SPF) BALB / c 암컷 쥐 (6 ~ 8 주)가 필요합니다. 여기에 총 100 마리의 동물을 구입했습니다.
- 실험을 통해 쥐에게 먹이와 물을 자유롭게 섭취하십시오.
- 실험을 설계하고 힘을 계산하십시오.
- 각 치료가 자체적으로 통제 할 수있는 경우, 쌍으로 된 환자 - 대조 디자인 (t-test)을 적용하십시오. 예비 분석을 사용하여 결정할 가장 중요한 효과의 평균 및 표준 오차를 계산하십시오. 분석의 능력과 다른 방법 자유롭게 사용 가능한 프로그램 (11)를 사용하여 그룹별로 필요한 동물의 수를 최적화 할 수 있습니다.
- 박테리오신 생산자 대 비 생산 균주의 영향을 시험하기 위해서는 실험 조건 당 9 마리의 동물을 사용하십시오.
참고 :이 수치는 실험 표준 오차를 기준으로 결정되었으며 만족할만한 힘 (0.7 - 1.0)과 0.05 이하의 유의 수준을 나타냅니다.
참고 : 주어진 예제에서 11 그룹의 쥐가 케이지 당 하나씩 만들어졌습니다. 10 개의 케이지는 5 개의 바테 이오 신 생산 균주 및 상응하는 5 개의 동종 원성 생산 균주에 의한 처리에 상응 하였다; 11 번째 우리는 10 마리의 마우스를 가지며 치료되지 않은 대조군을 구성 하였다.
- 축산 시설에 쥐가 도착한 후에, 쥐를 가두리에 넣고 귀를 기울여 동물에게 개별 추적을 허용하십시오. p 이전에 일주일 동안 축산 시설 및 조건에 생쥐를 순응시킨다.우회.
- 단계 1.8에서 설명한 바와 같이 박테리아 함유 식수를 준비하고 각 케이지의 마우스가 동일한 물병을 공유하도록 명확하게 식별되는 해당 독립 케이지에 음용수 병을 놓습니다.
참고 : 대조군은 시험 된 박테리아와 접촉하지 않고 별도의 케이지에 보관해야합니다. - 신선한 물 (100 mL)로 매일 새 병을 준비하고 해동 된 세균 현탁액을 새로 첨가하십시오. 이것을 15 일 연속으로하십시오.
- 생쥐가 박테리아가없는 물 ( 그림 1 )을 마시는 시간 동안 2 주간 세균 치료를 따르십시오.
3. 샘플 채취
- 대변 샘플을 수집하십시오.
- 고압 멸균 케이지 (비어 있음)와 멸균 포 셉를 준비하고 각 마우스에 대해 멸균 1.5 ML 튜브를 라벨.
- 일 동안 같은 시간에 샘플을 수집하여 미생물 생산의 변화를 피하십시오.하루의 과정. 최적의 결과를 얻으려면 신선한 샘플을 별도로 수집하십시오.
참고 : 마우스가 자발적으로 배설되는 경향이있는 아침 일찍 대변을 수집하는 것이 좋습니다. - 70 % 알코올로 빈장을 청소하고 안에 마우스를 넣으십시오. 그것을 똥을 허용하고, 1.5 ML 튜브에 배치 멸균 포 셉를 사용하여 2 - 4 배설물 알약을 수집합니다.
참고 : 때로는 마우스 꼬리를 위쪽으로 유지하는 것으로 충분합니다. 그러면 대변을 항문에서 튜브로 직접 수집 할 수 있습니다. - 4 주간의 실험 기간 동안 일주일에 한 번 각 마우스에서 대변 샘플을 수집하십시오 ( 그림 1 ). 박테리아에 마우스가 노출되기 바로 전에 첫 번째 샘플 (T0, 시간 0)을 수집하십시오. 7 일, 14 일, 21 일 및 28 일에 다음과 같은 찌끼 샘플을 수집하십시오.
- 4 ℃에서 시료를 냉장 보관하여 실험실로 옮겨 -80 ° C에서 얼게하십시오. 사전 계획을 세우고 충분한 수납 상자를 제공하십시오.cal 샘플은 실험 중에 수집됩니다.
- 배설물 수집 일에 매주 모든 마우스를 체중 측정하십시오.
- 15 일째에 모든 생쥐 안면 정맥, 박테리아 투여 최종일에서 혈액 샘플을 수집하고, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 고밀도 지질 단백질 (HDL), 저밀도 지단백질 (LDL)의 레벨을 결정할 혈청.
참고 : 숙련 된 인원은 동물의 스트레스를 줄이기 위해 혈액을 수집해야합니다.
4. LAB 계산 및 박테리오신 활동
- 1.5 mL 튜브에 각 시료의 배설 펠렛 1 개를 넣고 10 % (w / v) 용액을 얻기 위해 충분한 양의 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl을 넣는다. 배설물 현탁액을 균질화하고 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl에서 10 배 시리얼 희석액을 준비 1.5 ML 튜브에 멸균 micropestles를 사용하십시오.
- LAB 셀의 총 수를 센다.
- prewarmed 엄마 4 ML에 희석 세포 (100 μL)를 전송n Rogosa Sharpe (MRS) 연질 한천 (50 ° C, 0.8 % 한천). 고체 MRS 한천 플레이트 (1.5 % 한천)에 세포를 부어하기 전에 vortexing하여 섞는다.
- 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 24 시간 동안 세포를 배양 한 후 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 플레이트를 건조시킵니다.
- 세균성 세포를 세어보세요.
- 박테리오신 생산자의 희석 세포 (100 μL)를 미리 데워진 MRS 연질 한천 (50 ° C, 0.8 % 한천) 4 mL에 옮기고 볼 텍싱하여 혼합 한 다음 MRS 한천 플레이트 (1.5 % 한천)에 세포를 부어 넣는다. 이 레이어를 첫 번째 레이어라고합니다.
- 부드러운 한천에 모든 세포를 포함하는 첫 번째 레이어에 무 세포 MRS 부드러운 한천 (0.8 % 한천)의 다른 4 ML을 전송하십시오.
참고 :이 층은 세포가 한천 플레이트 표면에 식민지로 자라는 것을 방지하기위한 것입니다. 지표 세포가 표면에 쏟아 질 때 표면에서 성장하는 세포는 쉽게 옮겨집니다 (단계 4.3.4).따라서 결과의 해석이 복잡해집니다. 이 레이어를 두 번째 레이어라고합니다. - 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 20 시간 동안 배양 한 다음 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 배양하십시오.
- 박테리오신 생성 콜로니를 확인하려면 표 1에 나와있는대로 적절한 지표 균주의 하룻밤 배양액 40 μL를 미리 데운 연질 한천 4 mL와 혼합합니다. 혼합물을 판에 붓는다. 이 레이어를 제 3 레이어라고합니다.
- 멸균 후드에서 뚜껑을 5 ~ 10 분 동안 꺼내어 30 ~ 20 시간 동안 배양 한 다음 세포 성장과 콜로니 형성을 위해 배양하십시오.
참고 : Bacteriocin 생성 콜로니는 콜로니 주위에 명확한 (억제) 영역을 가지고 있습니다 ( 그림 2 ).
5. DNA 추출, 16S rDNA 증폭 및 시퀀싱
참고 : f 단계또는 DNA 추출은 상업용 키트 ( 예 : Realpure "SSS"Kit)의 사용에 대해 설명합니다.
- 1 - 2 배설물 마우스 쥐똥 (~ 200 MG) 300 μL의 용해 솔루션에 일시 중지합니다.
- 샘플을 유리 구슬 (직경 0.1mm) 0.5g을 넣은 2mL 마이크로 튜브에 옮긴다.
- 10 U / μL에서 mutanolysin 1 μL와 40에서 60 분 동안 37 ° C에서 각 시료에 20 mg / mL의 리소자임 2 μL를 첨가한다. 대변 샘플에서 DNA 추출을위한 표준 프로토콜 중 하나를 계속 수행하십시오 12 .
- 두 사이클의 비드 - 비터 스텝을 1 분씩가하십시오.
- proteinase K 2 μL를 첨가하고 완전히 혼합합니다.
- 5 분마다 20 분 및 와동 동안 품어 낸다.
- 샘플을 37 ° C로 식힌 다음 5 μg / mL RNase A 1 μL를 샘플에 첨가하십시오. 철저히 섞는다.
- 37에서 품어 ° C 30-60 분.
- 샘플을 실온으로 냉각시키고 180 μL단백질 침전 용액 20 ~ 30 초 동안 최대 속도로 활발하게 소용돌이 치게하십시오.
- 5 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하십시오. 뜨는에 떠 다니는 입자가있는 경우, 얼음에서 5 분간 배양 한 다음 다시 원심 분리하십시오.
- 이소프로판올 300 μL를 포함하는 새로운 1.5 ML microtube에 DNA를 포함하는 뜨는을 전송하십시오.
- 20-30 번 튜브를 거꾸로하여 혼합하고 -20 ° C에서 1 시간 동안 품어 라. 또는 튜브를 더 오랜 기간 동안 배양하십시오 ( 예 : 밤새).
- 2 분 동안 16,000 xg에서 원심 분리하십시오.
- 뜨는을 제거하고 흡수 종이에 튜브를 말리십시오. DNA 펠렛을 씻어 70 % 에탄올 300 μL를 추가합니다.
- 16,000 XG에서 1 분간 원심 분리하고 상층 액을 제거한 후 약 15 분 동안 펠렛을 건조 상태로 두십시오.
- 펠렛이 건조되면 멸균 물 또는 트리스 (10 MM) / EDTA (1 MM) 버퍼 100 μL를 추가하고 펠렛을 resuspend.
- 가능한 억제를 없애기 위해후속 단계에서 화합물을 제거하고 DNA를 세척하십시오. 추출 된 DNA를 2 배 용량 (200 μL)의 완충액 NTI와 섞어서 단계 5.15의 결합 조건을 조정합니다.
- PCR 클린업 컬럼이 들어있는 실리카 멤브레인을 수집 튜브 (2 mL)에 넣고 샘플을 채 웁니다.
- 11,000 x g에서 30 초 동안 원심 분리하십시오. 플로우 스루를 폐기하십시오.
- 완충액 NT3 700 μL로 실리카 막을 씻고 5.16 단계를 반복하십시오.
- 11,000 xg에서 1 분간 원심 분리하여 실리카 멤브레인을 건조시켜 잔류 에탄올 함유 세척 완충액 NT3를 제거합니다.
- 컬럼을 새로운 1.5-mL microtube로 옮기고 70 ℃에서 2 - 5 분 동안 배양하여 에탄올을 완전히 제거합니다.
- PCR 등급의 물 30 μL를 추가하고 70 ° C에서 5 분 동안 품어 라. 11,000 x g에서 1 분간 원심 분리하여 용출시킨다.
- UV / Vis 분광 광도계 또는 형광 측정법을 사용하여 DNA를 정량하십시오.
- 같은 케이지를 공유하는 마우스의 DNA 샘플을 표준화하고 풀링하십시오. ch 시점.
- 시간 동안의 개별 변이를 관찰하기 위해 0 일, 14 일 및 28 일에 무작위로 선택된 3 마리의 생쥐의 DNA 샘플과 다른 2 마리의 무작위 케이지를 시퀀싱합니다.
6. 16S rRNA 유전자 증폭 및 시퀀싱
- 증폭 된 16S rRNA 유전자의 라이브러리를 준비하십시오. 적절한 오버행 아답터가있는 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 박테리아 16S rRNA 유전자 5 의 V3-V4 영역을 증폭시킵니다.
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 증폭 된 밴드를 확인하십시오.
- amplicon 정화를위한 자기 구슬을 사용하여 폴리 메라 이제 연쇄 반응 (PCR) 제품을 청소하십시오.
- 사용 된 방대한 시퀀싱 플랫폼에 따라 제조업체가 지시 한대로 다음 단계를 진행합니다> 6.
7. 데이터 분석 및 통계
- 품질 필터링 (일반적으로 시퀀싱 시설에서 수행됨).
- 장비와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 원시 읽기 데이터와 역 다중화를 필터링합니다.
- USEARCH 14 (버전 7.0.1090)에서 구현 된 UPARSE 파이프 라인 13을 사용하여 쌍방향 읽기를 처리합니다. 쌍 끝을 병합하고 최대 예상 오류 (최대) 값 1.0을 사용하여 품질 필터링을 적용합니다. 150nt 미만의 서열을 폐기하십시오. 싱글 톤을 삭제하는 시퀀스를 삭제합니다.
- 97 %의 서열 동일성을 갖는 작 동 분류 단위 (operational taxonomic units, OTU)로 서열을 분류하고, UCHIME 15 를 사용하여 키메라 서열을 여과한다.
- OTU 따기, 분류 학적 지정 및 계통 발생 재구성, 다양성 분석 및 시각화.
- 정량적 통찰력을 사용하여 OTU 처리 Into 미생물 생태학 (QIIME) 16 .
- 최소 신원이 75 % (기본값) 인 PyNAST 18 을 사용하여 Greengenes 코어 세트 데이터베이스 17 에 대해 대표적인 OTU를 선택하고 정렬하십시오.
- 0.8의 신뢰도로 Ribosomal Database Project (RDP) 분류 자 프로그램 19 를 사용하여 정렬 된 서열에 택 소노 미를 할당하십시오.
- OTU 테이블을 시퀀스 깊이가 가장 낮은 샘플의 시퀀스 카운트로 정규화하십시오.
- 모든 변이가 매우 가변적 인 위치와 위치를 제거하기 위해 여과 단계 후에 Fast Tree 20 을 사용하여 정렬 된 서열로부터 계통수를 구축하십시오. 이 트리를 사용하여 알파 및 베타 다양성을 계산하고 희귀 곡선 및 샤논 인덱스를 계산합니다.
- 비 중량 UniFrac 거리 측정법 21 을 생성하고 시각화하려면 주 좌표 분석 (PCoA)을 사용하십시오.
참고 : s통계 분석을 사용하면 R 22 나 QIIME 16 내에 구현 된 통계 도구와 같은 다른 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. - 서로 다른 치료법 사이의 다양성에 대한 Shannon 지수의 비교를 위해 R을 연속 종속 변수로 고려한 ANCOVA를 사용하십시오.
- QIIME의 PCoA에서 치료 간의 거리를 양면 Student 's t-test를 사용하여 비교하고 Bonferroni 보정을 사용하여 1,000 몬테카를로 순열로 비모수적인 p 값을 계산합니다.
- 피어슨 상관 분석을 사용하여 특정 OTU의 상대적 존재 량과 콜레스테롤, HDL, LDL 등 의 혈청 수준과 같은 기타 측정 매개 변수 간의 상관 관계를 분석합니다. 이를 위해 CoNet 23 을 Cytoscape 3.1.1 24를 사용한 상관 관계 네트워크의 후속 시각화와 함께 사용하십시오.
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Representative Results
박테리오신의 생산은 기회 주의적 박테리아와 병원체의 성장을 막는 것으로 가정 되었기 때문에 LAB에서 긍정적 인 probiotic 특징으로 간주되어왔다. 이 연구의 목적은 쥐 모델에서 장내 미생물 군을 조절하는 박테리오신의 능력을 보여주는 것이 었습니다. 이 목적을 위해, 박테리오신 생산 균주 및 이들의 동종 비 생산 균주의 섭취 효과를 비교하기위한 절차가 개발되었다. 접종의 절차와 분석의 시간 연장은 그림 1에 표시됩니다. 마우스를 11 개의 우리 (어떤 치료도하지 않은 대조군, 박테리오신 생산 균주로 처리 한 5 개의 계사 및 박테리오신 생산을 감소 시키거나 동반하지 않는 상응하는 동종 돌연변이 체로 처리 한 5 개의 계사)로 분류 하였다. 시험 된 박테리오신 생산 LAB 및 식수 및 대변에서의 각 카운트 (cfu / mL)는 다음에 요약되어 있습니다.
그림 1 : Expe의 시간 코스 디자인을 보여주는 스키마림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 3 단계 프로토콜에 의한 대변에서 회수 한 LAB에서의 박테리오신 생산 검출 (절차에서 설명한대로). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 박테리아 트리 트먼트의 조성 비교. unweighted UniFrac 행렬에서 계산 된 거리를 기반으로 PCoA 플롯이 생성되었습니다. 동일한 샘플과 다른 시점 ( et al. , 2016 12 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 4 : 처리와 처리 기간 중 속 수준에 LAB와 박테리오 신 목표로 한 박테리아 그룹의 관계되는 풍부에있는 변화. 변화s를 대조군 (CON)과 비교 하였다. 이 그림의 명확성을 위해 garvicin과 sakacin 생산자 및 비 생산 균주 (색상 및 처리 관련 그림에서 범례 참조) 만 네 가지 변종으로 나타납니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 유의도는 다음과 같이 표현된다 : 도트 (.)로 P <0.1; 1 별 (*)로 P <0.05; 별 2 개 (**)로 P <0.01. Umu et al. , 2016 12 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 14 일째와 혈청 수준에서의 OTU의 상대적 존재 량의 상관 관계 네트워크. 상관 관계는 caCoNet에서 Pearson 상관 관계를 사용하여 계산됩니다. 유의 한 것들만 (P <0.05) 네트워크 상에 나타납니다. 혈청 총 콜레스테롤 ( Chol ), 고밀도 지단백질 ( HDL ), 저밀도 지단백질 ( LDL ), 트리글리 세라이드 ( Trig) 는 단색 (회색)으로 표시되는 반면, 다른 가족에 속한 OTU는 서로 다른 색 (범례 참조). 양의 상관 관계는 녹색 가장자리와 빨간색 가장자리와 음의 상관 관계로 표시됩니다. 노드의 OTU는 OTU 번호 또는 속한 속으로 표시됩니다. Umu 외 2016 12 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 식수에 접종 | 대변에 젖산균이 포함됩니다. | 지표 균주 | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (평균 log10) | |||
| 제어 | ---- | 10 마리 마우스 | 노스 다코타 | |
| 락토 바실러스 사 케이 B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 마리 마우스 | 8.53 ± 0.18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| 락토 바실러스 사 케이 B1501 (sakA -) | 2.0 | 9 마리 마우스 | 8.22 ± 0.05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (페드로 +) | 26 세 | 9 마리 마우스 | 8.73 ± 0.12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Pediocccus acidilactici B1503 (ped -) | 25 세 | 9 마리 마우스 | 8.75 ± 0.09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 마리 마우스 | 8.83 ± 0.14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 경화 -) | 10 | 9 마리 마우스 | 8.72 ± 0.14 | |
| 락토 바실러스 플랜 귤 ( Lactobacillus plantarum) B1507 (planta +) | 26 세 | 9 마리 마우스 | 9.14 ± 0.14 | 락토 바실러스 spp. 965 (LMG 2003) |
| 락토 바실러스 플랜 귤 ( Lactobacillus plantarum) B1508 (planta -) | 23 | 9 마리 마우스 | 8.60 ± 0.18 | |
| 락토 코커스 garviae B1515 (GarML +) | 17 세 | 9 마리 마우스 | 8.41 ± 0.08 | 락토 코커스 락 티스 IL1403 (LMG2705) |
| 락토 코커스 garviae B1516 (GarML -) | 17 세 | 9 마리 마우스 | 8.05 ± 0.18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783)은 SakA이고 PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397)는 엔테로 신, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003), GarML 용 락토 코커스 락 티스 IL1403 (LMG2705) 등이있다. | ||||
표 1 : 배설 된 균주 및 대변 샘플의 계수.
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Discussion
여기에 설명 된 절차는 미생물 군에서의 변화가 건강 또는 나이와 연관되어 있는지를 결정하는 데 사용되었습니다. 프로토콜의 다른 부분은 중요하지만, 그 중에서도 대변 샘플링, 시퀀싱 및 분석 할 DNA 단편의 선택, DNA 추출 및 생물 정보 분석의 수행이 가장 중요한 포인트 일 수 있습니다. 윤리적 이유로 마우스에 스트레스를주지 말아야하고 내장에서 박테리아의 비율을 변화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 샘플링은 중요합니다. 가능한 한 빨리 샘플을 처리해야하며, 일부 박테리아는 탈수 및 / 또는 산소에 매우 민감하므로 사용하기 전에는 얼려 야합니다. 증폭 된 16S rRNA 유전자로부터 서열 화 될 DNA 단편의 선택은 중요한 포인트이다. 이 작품에서 변수 지역 V3 - V4 (25)을 선택했다. DNA 추출법의 중요성은 과소 평가되어서는 안된다. 왜냐하면 표본에 존재하는 박테리아 세포가 모두 동일하지 않기 때문이다여러 가지 용해 프로토콜에 민감 할 수 있으며 박테리아 집단 추정에 편향은 불완전한 용해로 인한 결과 일 수 있습니다. 따라서 비드 비터 단계가 필요합니다. 균주의 경우 형질 전환 염색체로 코드화 된 박테리오신에 내성이 문제가 될 수도 있지만, 유전성 균주는 유전 적 넉다운 또는 플라스미드 큐 레이션에 의해 구축 될 수있다. 이 절차는 혐기성 방법과 같은 다른 특정 배양 기술을 사용하여 적용 할 수 있습니다 26 .
이 절차는 연구 할 요인 변경의 유형에 따라 대부분의 단계에서 수정할 수 있습니다. 예방 접종 절차는 단축 될 수 있지만 혈청 매개 변수의 변화에는 개발에 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 이 방법의 가능한 한계는 수 시간 동안 생존하지 못하거나 응집 될 수있는 (또는 화합물에 대해 침전되는) 박테리아 균주 (영양물 또는 화합물)에 대한 연구 일 수 있습니다. 따라서 이것은 반드시해야하는 요소입니다. 고려해야합니다.
지금까지 박테리오신 활성은 일반적으로 시험관 27 , 28 , 29 또는 혼합 배양 30 에서 결정 되었다 . 이 방법은 표준 실험용 쥐의 전체 내장균에서 5 종의 박테리오신의 활성을 생체 내에서 모니터링 할 수있게 해줍니다. 집단의 작은 변화뿐만 아니라 혈청 매개 변수와 같은 다른 세균 그룹 또는 생리적 요인에 대한 영향을 결정할 수 있습니다 12 . 박테리오신은 상대적으로 좁은 활성 스펙트럼을 가지며 분류 학적으로 관련된 박테리아의 성장을 억제한다. 그러나,이 분석에서 사용 된 것들 중 가장 효과적 인 것들은 사카신 A의 경우에서와 같이 Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 및 심지어 Escherichia coli 의 일부 균주에 대해 활성 인 것들이 있습니다ass = "xref"> 32. 생쥐에 접종했을 때, 박테리오신을 생산하는 LAB는 지구상의 미생물 군 구성에 현저한 변화를 일으키지 않았으며 박테리아 군의 감소 된 수를 나타냈다. 그럼에도 불구하고 전지구 적 상관 관계 네트워크 분석은 흥미로운 생태 학적 적합성과 다른 박테리아 사이의 적대감을 나타냈다. 이 방법은 건강 상태를 보존하기 위해 의도 된 결과가 의도적으로 제한 될 수 있지만 식품 성분, 약물 또는 기타 화합물의 영향을 분석하기 위해 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 연구원의 EEA Grant NILS 과학 및 지속 가능성 조정 이동성 (참조 번호 : 017-ABEL-CM-2013)에 감사드립니다. CB 및 GP-M. 스페인 경제 및 경쟁력 부문 (AGL2015-70487-P)의 지원을 받았다. OCOU와 DBD는 노르웨이 생명 과학 대학 (NMBU)의 식품 과학 연구를위한 전략적 장학금 프로그램 (프로젝트 1205051025)에 의해 지원되었습니다. 우리는 동물 보호 및 샘플링에 대한 그녀의 도움으로 Inmaculada Noguera와 동물 시설에서 실험실 재료의 사용 가능성을 보장하는 데 도움을 준 Jesus Dehesa에게도 감사드립니다. 우리는 또한 통계에 관한 조언을 해주신 Lars-Gustav Snipen 교수님 께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
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