Summary
Считается, что бактериоцины играют ключевую роль в определении микробного разнообразия в различных экологических нишах. Здесь мы описываем эффективную процедуру оценки того, как бактериоцины влияют на состав микробиоты кишечника на животной модели.
Abstract
Очень интригующие вопросы возникают с нашими продвигающимися знаниями о составе микробиоты кишечника и взаимоотношениями со здоровьем, особенно в отношении факторов, которые способствуют поддержанию баланса населения. Однако существуют ограниченные доступные методологии для оценки этих факторов. Бактериоцины являются антимикробными пептидами, продуцируемыми многими бактериями, которые могут принести конкурентное преимущество для получения пищи и / или создания ниши. Многие штаммы пробиотических молочнокислых бактерий (LAB) обладают большим потенциалом для развития здоровья людей и животных, предотвращая рост патогенов. Они также могут быть использованы для иммуномодуляции, поскольку они продуцируют бактериоцины. Однако антагонистическая активность бактериоцинов обычно определяется лабораторными биоанализами в четко определенных, но чрезмерно упрощенных условиях по сравнению со сложной средой кишечника у людей и животных, где бактерии сталкиваются с многофакторными влияниями хозяина и сотен микробных видов sУлавливая ту же самую нишу. В этой работе описывается полная и эффективная процедура оценки эффекта Из множества бактериоцинов с различной специфичностью мишени в мышиной системе. Изменения в составе микробиоты во время лечения бактериоцином контролируются с использованием композиционного секвенирования 16S рДНК. В нашем подходе используются как производители бактериоцина, так и их изогенные не-бактериоцин-продуцирующие мутанты, причем последний дает возможность отличать бактериоцин от не связанных с бактериоцином модификаций микробиоты. Методы секвенирования фекальной ДНК и 16S рДНК являются согласованными и вместе с биоинформатией представляют собой мощную процедуру для обнаружения слабых изменений в профилях бактерий и установления корреляций с точки зрения концентрации холестерина и триглицеридов между бактериальными популяциями и маркерами здоровья. Наш протокол является общим и может поэтому использоваться для изучения других соединений или питательных веществ с возможностью изменения микрофона хозяинаRobiota, либо при изучении токсичности, либо в положительных эффектах.
Introduction
Бактериоцины представляют собой антимикробные пептиды, продуцируемые широким спектром бактериальных видов 1 , 2 . Эти соединения и их производители, особенно LAB, были исследованы и эксплуатируются во всем мире в течение десятилетий для их потенциальных применений в области сохранения и медицины продуктов питания 3 . Известно, что несколько бактериоцинов убивают важные патогены, включая виды Listeria, Enterococcus, Staphylococcus и Bacillus . Некоторые бактериоцины даже обладают способностью модулировать иммунный ответ 4 . Многие бактериоцины имеют относительно узкие спектры, что очень ценится в некоторых применениях. Например, некоторые бактериоцины с узким спектром могут использоваться для направления специфической активности против отобранных групп проблемных бактерий без значительного беспокойства на комменсальной или полезной флоре, разделяющей одну и ту же нишу; Это особенно важно в кишечникеГде многочисленные полезные микробы процветают интерактивно и динамично 5 . Бактериоцины также очень привлекательны для профилактического или пробиотического использования, так как они могут подавлять (вызывать) рост патогенов, патобионов или оппортунистических бактерий, которые могут дисбалансить гомеостаз кишечника 6 , 7 .
С точки зрения их природы и физико-химических свойств бактериоцины очень разнообразны, поскольку они имеют разные структуры, специфичность мишени, способы действия и т. Д. Большинство бактериоцинов были изучены очень подробно в условиях in vitro , но очень немногие были протестированы в пищевых продуктах Матрицы 8 , 9 или in vivo, например, в животной кишке 6 , 10 . Свойства in vitro могут сильно различаться при оценке in vivo из-за сложности oF окружение кишечника, а также предполагаемое непреднамеренное воздействие на полезные бактерии. Большинство пробиотиков являются ЛАБ. Они производят множество других метаболитов, включая короткоцепочечные жирные кислоты, которые, как известно, влияют на физиологию хозяина, а также демонстрируют антимикробные свойства по отношению к определенным бактериям. Поэтому в случае пробиотических штаммов, которые производят бактериоцины, лучше всего установить реалистичные анализы, такие как здоровые животные с нормальной микробиотой.
В настоящем исследовании мы предлагаем стратегию, которая позволяет оценить влияние различных штаммов, продуцирующих бактериоцин, у которых бактериоцины имеют разные ингибирующие спектры, у здоровых мышей. Наша стратегия включает кормление мышей изогенными не бактериоциновыми мутантами, что позволяет дифференцировать эффекты, обусловленные бактериоцином, от эффектов, не связанных с бактериоцином. Последовательность 16S rDNA позволяет следить за динамическими изменениями бактериальной популяции в кишечнике. подпискаРавномерный статистический анализ расшифровывает корреляции между видами бактерий, а также между видами бактерий и измеренными физиологическими параметрами ( например, вес тела, биохимические параметры сыворотки и т . Д. ). Мы считаем, что протокол, представленный в этом исследовании, также применим к другим пробиотическим или пребиотическим применениям за пределами изучения бактериоцинов у живых животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход и уход должны проводиться в специализированном отделении по уходу за животными. Процедуры, описанные здесь, были одобрены соответствующим комитетом по этике Университета Валенсии и местными властями в соответствии с принципами лабораторного ухода за животными, обязательными в соответствии с Законом Европейского союза и 2010/63 / ЕС и правительством Испании RD 53/2013 о защите животных Используется для научных целей, чтобы соблюдать принцип 3R в экспериментах на животных (замена, сокращение, уточнение).
1. Замороженные бактериальные культуры, используемые для инокуляции мышей
- Инокулировать индивидуальные штаммы LAB в 5 мл среды инфузии головного мозга (BHI) и вырабатывать их в течение 20-24 ч (ночь) при 30 ° C.
- Разбавляют каждую ночную бактериальную культуру в 100 раз в BHI, перенося 2 мл ночной культуры на 200 мл BHI. Растите их при 30 ° C в течение 20-24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Штаммы, используемые в этом исследовании, приведены в таблице 1. - Harvest ceЦентрифугированием при 5000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
- Удаляют супернатант и промывают клетки дважды, суспендируя каждый клеточный осадок в 100 мл ледяного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и собирая клетки, как на этапе 1.3.
- После второй промывки суспендируйте каждый клеточный осадок в 20 мл ледяного 15% глицерина в PBS.
- Аликвоту суспензии клеток в 1 мл объема в пробирках и затем хранить их при -80 ° C до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки следует использовать в течение 1-2 месяцев после этой точки. - Определите номер ячейки перед хранением и до введения, чтобы было известно количество живых клеток, данных на мышах.
- Для подсчета клеток делайте десятикратные серийные разведения клеток в ледяном 0,9% растворе хлорида натрия (NaCl). Распространение 100 мкл каждого разведения на пластину агара BHI. Инкубируйте в течение ночи (20-24 часа) при 30 ° C для роста клеток и образования колоний, а затем для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл.
- Чтобы создать бактериальную питьевую воду, разбавьте клетки каждой бактериальной культуры в 100 мл стерильной, фильтрованной питьевой воды с конечным средним КОЕ 10 9 / мл воды. Для оценки выживаемости бактерий подсчитывайте живые клетки сразу после разведения и через 24 часа один раз в неделю в течение первых двух недель лечения бактериями.
2. Анализ мышей и экспериментальный дизайн
Примечание: для этого эксперимента необходимы особые бесклеточные (SPF) BALB / c молодые самки (6-8 недель); Здесь было приобретено в общей сложности 100 животных.
- Предоставьте мышам свободный доступ к таблетированным пищевым продуктам и воде в течение всего эксперимента.
- Разработайте эксперимент и вычислите мощность.
- Если каждая процедура имеет свой собственный контроль, примените парную конструкцию управления случаем (t-тест). Используйте предварительный анализ для вычисления средней и стандартной ошибки наиболее важного эффекта (ов), который будет определен. Оптимизируйте мощность анализа и количество животных, необходимых для каждой группы, используя различные методы и свободно доступные программы. 11 .
- Чтобы проверить влияние штаммов бактериоцина против непродуктивных штаммов, используйте 9 животных на экспериментальное состояние.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это число было определено на основе экспериментальной стандартной ошибки и обеспечило удовлетворительную мощность (0,7 - 1,0) и уровень значимости ниже 0,05.
ПРИМЕЧАНИЕ. В данном примере было сделано 11 групп мышей, по одному на клетку. Десять клеток соответствовали обработке с 5 штаммами, продуцирующими бактериоцин, и соответствующими 5 изогенными непродуктивными штаммами; 11- я клетка имела 10 мышей и составляла необработанный контроль.
- После прибытия мышей на объекты животноводства, распределите их в клетках и наклейте звездой животных для обеспечения индивидуального отслеживания. Акклиматизируйте мышей в хозяйствах и условиях на неделю доroceeding.
- Подготовьте питьевую воду, содержащую бактерии, как описано в шаге 1.8, и поместите бутылки с питьевой водой в соответствующие независимые клетки, которые четко идентифицированы, так что мыши в каждой клетке имеют одну и ту же бутылку с водой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Контрольную группу следует хранить в отдельной клетке, без контакта с тестируемыми бактериями. - Подготовьте новую бутылку со свежей питьевой водой (100 мл) каждый день и добавьте свежезамороженные бактериальные суспензии. Делайте это в течение 15 последовательных дней.
- Следуйте за обработкой бактерий в течение двух недель, в течение которых мышки пьют воду без бактерий ( рис. 1 ).
3. Сбор образцов
- Соберите образцы фекалий.
- Подготовьте автоклавированные клетки (пустые) и стерильные щипцы и промаркируйте стерильные пробирки объемом 1,5 мл для каждой мыши.
- Соберите образцы в одно и то же время суток, чтобы избежать изменения состава микробиоты во время thКурс дня. Для получения оптимальных результатов собирайте свежие образцы отдельно.
ПРИМЕЧАНИЕ. Предпочтительно собирать фекалии рано утром, когда мыши склонны дефекацию спонтанно. - Очистите пустую клетку с 70% -ным спиртом и поместите мышь внутрь. Позвольте ему дефекацию и собрать 2 - 4 фекальные гранулы, используя стерильные щипцы, помещая их в 1,5 мл пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Иногда достаточно удерживать хвост мыши вверх; Табурет затем может быть непосредственно собран из ануса в трубку. - Собирайте образцы фекалий с каждой мыши раз в неделю в течение четырехнедельного эксперимента ( рисунок 1 ). Соберите первые образцы в первый день (T0, нулевой момент времени), как раз перед воздействием мышей на бактерии. Соберите следующие образцы фекалий в дни 7, 14, 21 и 28.
- Охладите образцы при 4 ° C до их транспортировки в лабораторию, где они замораживаются при -80 ° C. Запланируйте заранее и обеспечьте достаточное количество ящиков для хранения, так как большое количество feОбразцы будут собираться во время эксперимента.
- Взвесьте всех мышей каждую неделю в день сбора фекалий.
- Собирайте образцы крови из лицевой вены у всех мышей на 15- й день, последний день введения бактерий, и определите уровни триглицеридов, общего холестерина, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в Сыворотка крови.
ПРИМЕЧАНИЕ. Опытный персонал должен собирать кровь, чтобы уменьшить стресс у животных.
4. Подсчет LAB и активность бактериоцина
- Взвесьте один фекальный осадок каждого образца в 1,5 мл пробирке и добавьте достаточный объем ледяного 0,9% NaCl для достижения 10% (мас. / Об.) Раствора. Используйте стерильные микропростолы для 1,5 мл пробирки для гомогенизации фекальной суспензии и готовят десятикратные серийные разведения в ледяной 0,9% NaCl.
- Подсчитайте общее количество клеток LAB.
- Перенесите разбавленные клетки (100 мкл) в 4 мл предварительно нагретой маN мягкий агар Rogosa Sharpe (MRS) (50 ° C, 0,8% агар). Смешайте путем встряхивания перед выливанием клеток на твердую пластину агара MRS (1,5% агар).
- Высушите пластину, сняв крышку в течение 5-10 минут в стерильном колпаке перед инкубацией клеток в течение 20-24 часов при 30 ° C для роста клеток и образования колоний.
- Считайте бактерии, продуцирующие бактерии.
- Перенесите разбавленные клетки (100 мкл) продуцента бактериоцина в 4 мл предварительно нагретого мягкого агара MRS (50 ° C, 0,8% агара), перемешайте путем встряхивания и вылейте клетки на пластину агара MRS (1,5% агар); Этот слой называется первым слоем.
- Перенесите еще 4 мл бесклеточного MRS-мягкого агара (0,8% агара) на первый слой, чтобы вставить все клетки в мягкий агар.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот слой предназначен для предотвращения роста клеток в виде колоний на поверхности пластин агара. Клетки, растущие на поверхности, легко перемещаются при выливании индикаторных ячеек сверху (шаг 4.3.4) иПоэтому усложнит интерпретацию результатов. Этот слой называется вторым. - Высушите пластину, сняв крышку в течение 5-10 минут в стерильном колпаке перед инкубацией в течение 20-24 часов при 30 ° C для роста клеток и образования колоний.
- Для идентификации колоний, продуцирующих бактериоцин, смешайте 40 мкл ночной культуры соответствующего индикаторного штамма, как показано в таблице 1 , с 4 мл предварительно нагретого мягкого агара. Вылейте смесь на пластину; Этот слой называется третьим слоем.
- Высушите пластину, сняв крышку в течение 5-10 минут в стерильном колпаке перед инкубацией в течение 20-24 часов при 30 ° C для роста клеток и образования колоний.
ПРИМЕЧАНИЕ. Бактериоцин-продуцирующие колонии имеют четкие (ингибирующие) зоны вокруг колоний ( рис. 2 ).
5. Экстракция ДНК, амплификация 16S рДНК и секвенирование
ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги fИли экстракция ДНК описаны для использования коммерческого набора ( например, Realpure «SSS» Kit).
- Приостановить 1 - 2 гранулы фекальных мышей (~ 200 мг) в 300 мкл раствора для лизиса.
- Перенесите образец в микротрубочку объемом 2 мл, в которой ранее было помещено около 0,5 г стеклянных шариков (диаметр: 0,1 мм).
- Добавьте 1 мкл мутанолизина при 10 Е / мкл и 2 мкл лизоцима при 20 мг / мл к каждому образцу и инкубируйте при 37 ° С в течение 40-60 мин. Выполните один из стандартных протоколов для извлечения ДНК из фекальных образцов 12 .
- Нанесите два цикла шашек для бисера, по 1 мин каждый.
- Добавьте 2 мкл протеиназы K и тщательно перемешайте.
- Инкубируйте в течение 20 мин и вихря каждые 5 мин.
- Охладите образцы до 37 ° С и добавьте 1 мкл 5 мкг / мл РНКазы А к образцу. Тщательно перемешайте.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 30-60 мин.
- Охлаждают образцы до комнатной температуры и добавляют 180 мклРаствора для осаждения белков. Вихрь энергично на максимальной скорости в течение 20-30 с.
- Центрифуга при 16000 мкг в течение 5 мин. Если в супернатанте есть частицы, инкубируйте образцы во льду в течение 5 мин, а затем снова центрифугируйте.
- Перенесите супернатант, содержащий ДНК, в новую 1,5-мл микротрубочку, содержащую 300 мкл изопропанола.
- Смешайте, повернув трубки 20-30 раз и инкубируйте в течение 1 часа при -20 ° C. Альтернативно, инкубируйте трубки дольше периода ( например, в течение ночи).
- Центрифуга при 16000 мкг в течение 2 мин.
- Удалите супернатант и высушите пробирку на впитывающей бумаге. Добавьте 300 мкл 70% этанола для промывки гранулы ДНК.
- Центрифугируют при 16000 мкг в течение 1 мин, удаляют супернатант и оставляют осадок сушить в течение примерно 15 мин.
- Как только осадок высохнет, добавьте 100 мкл стерильной воды или буфера Tris (10 мМ) / ЭДТА (1 мМ) и повторно суспендируйте гранулу.
- Для устранения любого возможного ингибитораСоединения на последующих стадиях, очистить ДНК. Смешайте экстрагированную ДНК с 2 объемами (200 мкл) буфера NTI для корректировки условий связывания для этапа 5.15.
- Поместите кремниевую мембрану, содержащую колонку для очистки ПЦР, в трубку для сбора (2 мл) и загрузите образец.
- Центрифуга в течение 30 с при 11000 x g. Отбросьте поток.
- Промойте кремнеземную мембрану 700 мкл буфера NT3 и повторите шаг 5.16.
- Высушите мембрану из диоксида кремния центрифугированием в течение 1 мин при 11000 × g для удаления остаточного этанола, содержащего промывочный буфер NT3.
- Перенесите колонку в новую 1,5-мл микротрубочку и инкубируйте в течение 2 - 5 минут при 70 ° C для полного удаления этанола.
- Добавить 30 мкл воды с ПЦР и инкубировать в течение 5 мин при 70 ° С. Элюат центрифугированием в течение 1 мин при 11000 х g.
- Количественное определение ДНК с использованием спектрофотометра UV / Vis или флуорометрического метода.
- Нормализовать и объединить образцы ДНК от мышей, которые используют один и тот же клетку при ea Ch время.
- Чтобы наблюдать отдельные изменения во времени, образцы ДНК ДНК из трех случайно выбранных мышей из контрольной группы и двух других случайных клеток в дни 0, 14 и 28.
6. Усиление и секвенирование генов 16S рРНК
- Подготовьте библиотеку амплифицированных генов 16S рРНК. Усилить область V3-V4 бактериального 16S рРНК-гена 5 с использованием прямых и обратных праймеров с соответствующими адаптерами навеса:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Проверьте амплифицированные полосы с помощью электрофореза с 1% агарозным гелем.
- Очистите продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием магнитных шариков для очистки ампликона.
- Выполните следующие шаги, указанные изготовителем в соответствии с используемой платформой массивного секвенирования> 6.
7. Анализ данных и статистика
- Качественная фильтрация (обычно выполняется при устройствах секвенирования).
- Отфильтруйте необработанные данные чтения и демультиплексирования с помощью программного обеспечения, поставляемого с оборудованием.
- Обработайте чтение парного конца с использованием конвейера 13 UPARSE, реализованного в USEARCH 14 (версия 7.0.1090). Объедините парные концы и примените фильтрацию качества с использованием максимального ожидаемого значения ошибки (maxee) 1.0. Отменить последовательности менее 150 нт. Выделенные последовательности для отбрасывания одиночных чисел.
- Сгруппируйте последовательности в оперативные таксономические единицы (ОТП) с идентификацией последовательности 97% и используйте UCHIME 15 для фильтрации химерных последовательностей.
- Сбор OTU, таксономическое назначение и филогенетическая реконструкция, а также анализ разнообразия и визуализация.
- Обработать OTU с помощью Quantitative Insights IntO Микробная экология (QIIME) 16 .
- Выбирайте и выровняйте репрезентативные OTU с базой данных ядра Greengenes 17 с использованием PyNAST 18 с минимальной идентичностью 75% (по умолчанию).
- Присвойте таксономию выровненным последовательностям, используя программу классификатора Ribosomal Database Project (RDP) 19 с доверием 0,8.
- Нормализовать таблицу OTU до количества последовательностей образца с наименьшей глубиной последовательности.
- Постройте филогенгенное дерево из выровненных последовательностей, используя Fast Tree 20 после этапа фильтрации, чтобы удалить сильно изменчивые области и положения, которые являются всеми пробелами. Используйте это дерево для вычисления альфа-и бета-значений, а также для расчета кривых разрежения и индексов Шеннона.
- Чтобы генерировать и визуализировать невзвешенные показатели расстояния UniFrac 21 , используйте основной анализ координат (PCoA).
ПРИМЕЧАНИЕ. Для sТатаристский анализ, могут использоваться различные программные пакеты, такие как R 22 или статистические инструменты, реализованные в QIIME 16 . - Для сравнения показателей Шаннона разнообразия между различными методами лечения используйте ANCOVA, рассматривая время как непрерывную зависимую переменную в R.
- Сравните расстояния между обработками в PCoA в QIIME с использованием двухстороннего t-критерия Стьюдента и вычислите непараметрические p-значения с 1000 перестановками Монте-Карло с использованием поправки Bonferroni.
- Проанализируйте корреляцию между относительным количеством специфических ОТУ и другими измеренными параметрами, такими как уровень холестерина в сыворотке, ЛПВП, ЛПНП и т. Д. , Используя корреляционный анализ Пирсона. С этой целью используйте CoNet 23 с последующей визуализацией корреляционных сетей с использованием Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Производство бактериоцинов считается положительной пробиотической особенностью ЛАБ, поскольку предполагалось, что это предотвращает рост оппортунистических бактерий и патогенов. Цель этой работы заключалась в том, чтобы показать способность бактериоцинов модулировать популяции микробиот кишки в модели мыши. С этой целью была разработана процедура для сравнения влияния приема штаммов, продуцирующих бактериоцин, и их изогенных непродуктивных штаммов. Процедура инокуляции и временное расширение анализа показаны на рисунке 1 . Мышей сгруппировали в одиннадцать клеток: контроль без какой-либо обработки, пять клеток, обработанных штаммами-продуцентами бактериоцина, и пять клеток, обработанных соответствующими изогенными мутантами, которые уменьшили или не привели к образованию бактериоцина. Испытуемый бактериоцин-продуцирующий LAB, а также соответствующие подсчеты (КОЕ / мл) в питьевой воде и подсчеты в фекалиях суммированы в
Рисунок 1: Схема, показывающая дизайн временного курса Experiment. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обнаружение продуцирования бактериоцинов в LAB, восстановленном из фекалий, посредством трехслойного протокола (как описано в процедуре). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение состава лечения бактерий. График PCoA был создан на основе рассчитанных расстояний в невзвешенной матрице UniFrac. Различные точки времени из того же образца ( et al. , 2016 год 12 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изменения относительного изобилия LAB и бактерицидных групп, базирующихся на бактериоцитах, на уровне родов во время периодов лечения и после лечения. + ИзменитьС в относительном распространении родов в обработках, полученных по времени 0, сравнивали с таковыми в контрольной группе (CON). Для наглядности иллюстрации показаны только четыре штамма: производитель гарвицина и сакацина и непродуктивные штаммы (см. Легенду на рисунке, чтобы рассказать о цвете и лечении). Шкала ошибок представляет собой стандартное отклонение. Степень значимости представлена следующим образом: P <0,1 с точкой (.); P <0,05 с одной звездой (*); P <0,01 с двумя звездами (**). Адаптировано из Umu et al. , 2016 год 12 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Корреляционная сеть относительных изобилия ОТС на 14-й день и уровни сыворотки. Корреляции былиLculated с использованием корреляции Пирсона в CoNet. В сети показаны только значимые (P <0,05). Параметры, определенные в сыворотке - общий холестерин ( хол ), липопротеин высокой плотности ( ЛПВП ), липопротеин низкой плотности ( ЛПНП ) и триглицериды ( Trig - показаны одним цветом (серый), тогда как ОТУ, принадлежащие к разным семействам, представлены различные цвета (см условных обозначений). Положительные корреляции отображаются с зелеными краями, а отрицательными корреляциями с красными краями. оТ на узлах представлены с номерами ОТА или родом , к которым они принадлежат. Адаптирован из Ума и др., 2016 г. 12. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Инокулированный в питьевой воде | Молочнокислые бактерии подсчитываются в фекалиях | Индикаторные напряжения | | |
| КОЕ / мл (log10) | КОЕ / г (среднее значение log10) | |||
| КОНТРОЛЬ | ---- | 10 мышей | Северная Дакота | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1,6 | 9 мышей | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) | 2,0 | 9 мышей | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 мышей | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (пед -) | 25 | 9 мышей | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 мышей | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (отвержденный L50 -) | 10 | 9 мышей | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 мышей | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 мышей | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 мышей | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 мышей | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) для SakA и PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) для энтероцинов, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) для plantaricins и Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) для GarML. | ||||
Таблица 1: Инокулированные штаммы и графы в фекальных образцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура, описанная здесь, была использована для определения того, связаны ли изменения микробиоты со здоровьем или возрастом. Различные части протокола важны, но среди них выборка фекалий, выбор фрагмента ДНК, подлежащего секвенированию и анализу, и выполнение экстракции ДНК и биоинформационного анализа, безусловно, могут быть самыми критическими моментами. Отбор проб имеет решающее значение, поскольку по этическим соображениям мышей не следует подчеркивать и потому, что известно изменение доли бактерий в кишечнике. Образцы должны быть обработаны как можно скорее или должны быть заморожены до использования, так как некоторые бактерии очень чувствительны к обезвоживанию и / или к кислороду. Выбор фрагмента ДНК, подлежащего секвенированию из амплифицированных генов 16S рРНК, является решающим моментом. В этой работе были выбраны переменные области V3 - V4 25 . Важность метода экстракции ДНК не следует недооценивать, так как бактериальные клетки, присутствующие в образцах, не всеЧувствительные к различным протоколам лизиса, а смещения в оценке популяций бактерий могут быть результатом неполного лизиса. Поэтому требуется введение шага для бисера. Изогенные штаммы могут быть сконструированы генетическим нокдауном или путем образования плазмид, хотя в случае штаммов рефрактерная трансформация хромосомных бактериоцинов может представлять проблему. Эта процедура может быть адаптирована с использованием различных конкретных методов культивирования, таких как анаэробные методы 26 .
Процедура может быть изменена на большинстве этапов в зависимости от типа факторов, которые необходимо изучить. Процедура инокуляции может быть сокращена, но изменения параметров сыворотки могут потребоваться некоторое время для разработки. Возможным ограничением метода может быть изучение бактериальных штаммов (питательных веществ или соединений), которые не могут выдержать несколько часов в воде или которые могут скопляться (или осаждаться для соединений). Следовательно, это фактор, который должен Поэтому следует учитывать.
До сих пор активность бактериоцина обычно определялась in vitro 27 , 28 , 29 или в смешанных культурах 30 . Этот метод позволил контролировать in vivo активность пяти бактериоцинов из микробиоты всего кишечника стандартных лабораторных мышей. Могут быть определены небольшие вариации в популяциях, а также их влияние на другие бактериальные группы или физиологические факторы, такие как параметры сыворотки 12 . Бактериоцины имеют относительно узкий спектр активности, препятствуя росту таксономически родственных бактерий. Однако те, которые используются в этом анализе, являются одними из наиболее эффективных, так как некоторые из них активны против Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 и даже некоторых штаммов Escherichia coli , как в случае сакацина AAss = "xref"> 32. При инокуляции мышей LAB, продуцирующих бактериоцины, не вызывало заметных изменений в составе глобальной микробиоты, а скорее уменьшало количество бактериальных таксонов. Тем не менее, глобальный анализ корреляционной сети показал интересную экологическую совместимость и антагонизм между различными бактериями. Этот метод может быть адаптирован для анализа влияния пищевых компонентов, лекарств или других соединений, хотя ожидаемый результат может быть намеренно ограничен для сохранения здоровых состояний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить EEA Grant NILS Science and Sustainability Скоординированную мобильность исследователей (ссылка 017-ABEL-CM-2013). CB и GP-M. Были поддержаны грантом AGL2015-70487-P от Министерства экономики и конкурентоспособности Испании. OCOU и DBD были поддержаны стратегической программой стипендий для исследований в области пищевых наук Норвежского университета наук о жизни (NMBU) (проект 1205051025). Мы также хотели бы поблагодарить Инмакуладу Ногуэру за ее помощь в уходе за животными и отборе проб и Иисусе Дехеса за его помощь в обеспечении доступности лабораторных материалов на объекте для животных. Мы также ценим профессора Ларса-Густава Снайпина за его совет по статистике.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C.
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J.
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
