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Biology

Un método para evaluar los efectos de bacteriocinas en la microbiota intestinal de ratones

Published: July 25, 2017 doi: 10.3791/56053
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1
1Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), 2Department of Food Safety and Infection Biology, Norwegian University of Life Sciences (NMBU), 3Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid (UCM), 4Faculty of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences (NMBU)
* These authors contributed equally

Summary

Se cree que las bacteriocinas juegan un papel clave en la definición de la diversidad microbiana en diferentes nichos ecológicos. Aquí, describimos un procedimiento eficiente para evaluar cómo bacteriocinas afectan la composición microbiota intestinal en un modelo animal.

Abstract

Se plantean preguntas muy intrigantes con nuestro avance en el conocimiento sobre la composición de la microbiota intestinal y su relación con la salud, particularmente en relación con los factores que contribuyen al mantenimiento del equilibrio poblacional. Sin embargo, existen limitadas metodologías disponibles para evaluar estos factores. Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos producidos por muchas bacterias que pueden conferir una ventaja competitiva para la adquisición de alimentos y / o establecimiento de nichos. Muchas cepas de bacterias probióticas de ácido láctico (LAB) tienen un gran potencial para promover la salud humana y animal al prevenir el crecimiento de patógenos. También pueden utilizarse para la inmunomodulación, ya que producen bacteriocinas. Sin embargo, la actividad antagonista de las bacteriocinas se determina normalmente mediante bioensayos de laboratorio en condiciones bien definidas pero sobre simplificadas en comparación con el complejo ambiente intestinal en seres humanos y animales, donde las bacterias se enfrentan a influencias multifactoriales del huésped y cientos de especies microbianasCompartiendo el mismo nicho. Este trabajo describe un procedimiento completo y eficiente para evaluar el efecto De una variedad de bacteriocinas con diferentes especificidades de blanco en un sistema murino. Los cambios en la composición de la microbiota durante el tratamiento con bacteriocina se monitorean usando secuenciación de ADNr 16S de composición. Nuestro enfoque utiliza tanto los productores de bacteriocina como sus mutantes isogénicos no productores de bacteriocinas, este último dando la capacidad de distinguir bacteriocinas relacionadas con las modificaciones no relacionadas con la bacteriocina de la microbiota. La extracción de ADN fecal y los métodos de secuenciación del 16S rDNA son consistentes y, junto con la bioinformática, constituyen un potente procedimiento para detectar cambios débiles en los perfiles bacterianos y establecer correlaciones entre las poblaciones bacterianas y los marcadores de salud en términos de concentración de colesterol y triglicéridos. Nuestro protocolo es genérico y por lo tanto puede utilizarse para estudiar otros compuestos o nutrientes con el potencial de alterar el mic anfitriónRobiota, ya sea al estudiar la toxicidad o los efectos beneficiosos.

Introduction

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos producidos por una amplia gama de especies bacterianas 1 , 2 . Estos compuestos y sus productores, especialmente LAB, han sido explorados y explotados en todo el mundo durante décadas para sus aplicaciones potenciales en la preservación de los alimentos y la medicina 3 . Se conocen varias bacteriocinas para matar patógenos importantes, incluyendo especies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus y Bacillus . Algunas bacteriocinas incluso tienen la capacidad de modular la respuesta inmune 4 . Muchas bacteriocinas tienen espectros relativamente estrechos, una propiedad que es muy apreciada en algunas aplicaciones. Por ejemplo, algunas bacteriocinas de espectro estrecho pueden utilizarse para dirigir la actividad específica contra grupos seleccionados de bacterias problemáticas, sin que se produzca gran alteración en la flora comensal o beneficiosa que comparte el mismo nicho; Esto es especialmente esencial en el medio ambiente intestinalDonde numerosos microbios beneficiosos prosperan de una manera interactiva y dinámica 5 . Las bacteriocinas son también muy atractivas para el uso profiláctico o probiótico, ya que pueden suprimir el crecimiento de patógenos, pathobiontes o bacterias oportunistas que pueden desequilibrar la homeostasis intestinal 6 , 7 .

En cuanto a su naturaleza y propiedades fisicoquímicas, las bacteriocinas son muy diversas, ya que tienen diferentes estructuras, especificidades de objetivo, modos de acción, etc. La mayoría de las bacteriocinas se han estudiado con gran detalle en entornos in vitro , pero muy pocos han sido probados en alimentos Matrices 8 , 9 o in vivo, tal como en un intestino animal 6 , 10 . Las propiedades in vitro pueden diferir en gran medida cuando se evalúan in vivo debido a la complejidadF el ambiente intestinal y también a efectos no deseados putativos sobre bacterias beneficiosas. La mayoría de los probióticos son LAB. Producen una serie de otros metabolitos, incluyendo ácidos grasos de cadena corta, que se sabe que influyen en la fisiología del huésped, así como para demostrar propiedades antimicrobianas hacia ciertas bacterias. Por lo tanto, en el caso de las cepas probióticas que producen bacteriocinas, lo mejor es establecer ensayos realistas, como los animales sanos con microbiota normal.

En el presente estudio, proporcionamos una estrategia que permite evaluar el efecto de diferentes cepas productoras de bacteriocinas, cuyas bacteriocinas tienen diferentes espectros inhibidores, en ratones sanos. Nuestra estrategia incluye la alimentación de ratones con isogénicos no bacteriocin mutantes, que permite la diferenciación de bacteriocin mediada por efectos no bacteriocin mediada por los efectos. Secuenciación 16S rDNA permite seguir los cambios dinámicos de la población bacteriana en el intestino. SubsEl análisis estadístico equitativo descifra correlaciones entre especies bacterianas y también entre especies bacterianas y parámetros fisiológicos medidos ( p. Ej., Peso corporal, parámetros bioquímicos en suero, etc. ). Creemos que el protocolo presentado en este estudio es también aplicable a otras aplicaciones probióticas o prebióticas más allá del estudio de bacteriocinas en animales vivos.

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Protocol

El cuidado y manipulación deben llevarse a cabo en una unidad especializada de cuidado de animales. Los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Comité de Ética correspondiente de la Universidad de Valencia y las autoridades locales, siguiendo los principios de cuidado de animales de laboratorio obligatorio por la Ley de la Unión Europea y 2010/63 / UE y el Gobierno español RD 53/2013 sobre protección de animales Utilizados para fines científicos, con el fin de respetar el principio 3R en la experimentación animal (Reemplazo, Reducción, Refinamiento).

1. Culturas bacterianas congeladas utilizadas para inocular ratones

  1. Inocular cepas individuales de LAB en 5 mL de medio de infusión cerebro-corazón (BHI) y cultivarlas durante 20-24 h (durante la noche) a 30 ° C.
  2. Diluir cada cultivo bacteriano nocturno 100 veces en BHI transfiriendo 2 mL de cultivo durante la noche a 200 mL de BHI. Crecer a 30 ° C durante 20 - 24 h.
    NOTA: Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
  3. CosechaLls por centrifugación a 5.000 xg durante 20 minutos a 4 ° C.
  4. Se retira el sobrenadante y se lavan las células dos veces suspendiendo cada sedimento celular en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) enfriada con hielo y recogiendo las células como en el paso 1.3.
  5. Después del segundo lavado, suspender cada sedimento celular en 20 ml de glicerol al 15% enfriado con hielo en PBS.
  6. Alícuota de la suspensión de células en volúmenes de 1 ml en tubos y luego almacenarlos a -80 ° C hasta su uso.
    NOTA: Las celdas deben utilizarse dentro de 1-2 meses después de este punto.
  7. Determine el número de células antes del almacenamiento y antes de la administración para que se conozca el número de células vivas administradas a los ratones.
    1. Para el recuento celular, haga diez diluciones en serie de las células en una solución de cloruro sódico al 0,9% (NaCl) helada. Se disemina 100 μL de cada dilución sobre una placa de agar BHI. Incubar durante la noche (20 - 24 h) a 30 ° C para el crecimiento celular y la formación de colonias, este último para determinar las unidades formadoras de colonias (cfu) / mL.
  8. Para producir agua potable que contenga bacterias, diluya las células de cada cultivo bacteriano en 100 mL de agua potable estéril y filtrada, con un promedio final de ufc de 10 9 / mL de agua. Para la evaluación de la supervivencia bacteriana, contar las células vivas justo después de la dilución y después de 24 h una vez a la semana durante las primeras dos semanas de tratamiento con bacterias.

2. Ensayo de ratones y diseño experimental

Nota: Para este experimento se necesitan ratones hembra BALB / c específicos libres de patógenos (SPF) (6 - 8 semanas); Aquí, un total de 100 animales fueron comprados.

  1. Proporcionar a los ratones con acceso libre a los alimentos en pellets y el agua durante todo el experimento.
  2. Diseñar el experimento y calcular la potencia.
    1. Si cada tratamiento tiene su propio control, aplique un diseño pareado de control de casos (t-test). Utilice un ensayo preliminar para calcular la media y el error estándar de los efectos más importantes a determinar.
      2. Optimizar la potencia del ensayo y el número de animales necesarios por grupo utilizando diferentes métodos y programas de libre disposición 11 .
    2. Para probar los efectos de las cepas productoras de bacteriocina versus las no productoras, use 9 animales por condición experimental.
      NOTA: Este número se determinó sobre la base del error estándar experimental y proporcionó una potencia satisfactoria (0,7 - 1,0) y un nivel de significación por debajo de 0,05.
      NOTA: En el ejemplo dado, se hicieron 11 grupos de ratones, uno por jaula. Diez jaulas correspondieron a los tratamientos con 5 cepas productoras de bacteriocina y las correspondientes 5 cepas isogénicas no productoras; el 11 de jaula tenía 10 ratones y constituyó el control no tratado.
  3. Después de la llegada de los ratones a las instalaciones de cría, distribuirlos en jaulas y marcar los animales para permitir un seguimiento individual. Aclimate los ratones a las instalaciones y condiciones de cultivo durante una semana antes de pRoceeding
  4. Prepare el agua potable que contiene bacterias, como se describe en el paso 1.8, y coloque las botellas de agua potable en las correspondientes jaulas independientes que estén claramente identificadas para que los ratones de cada jaula compartan la misma botella de agua.
    NOTA: El grupo de control debe mantenerse en una jaula separada, sin contacto con las bacterias ensayadas.
  5. Prepare una nueva botella con agua potable fresca (100 ml) todos los días y agregue las suspensiones bacterianas recién descongeladas. Haga esto durante 15 días consecutivos.
  6. Siga el tratamiento de bacterias con un período de dos semanas, durante el cual los ratones beben agua libre de bacterias ( Figura 1 ).

3. Recolección de muestras

  1. Recoger las muestras fecales.
    1. Prepare jaulas autoclavadas (vacías) y fórceps estériles y etiquete tubos estériles de 1,5 ml para cada ratón.
    2. Recoge las muestras a la misma hora del día para evitar variaciones en la composición de la microbiota duranteE curso de un día. Para obtener resultados óptimos, recoger muestras frescas por separado.
      NOTA: De preferencia, recoger heces temprano en la mañana, cuando los ratones tienden a defecar espontáneamente.
    3. Limpie una jaula vacía con alcohol al 70% y coloque un ratón dentro. Permitir que defecar y recoger 2 - 4 pellets fecales con fórceps estéril, colocándolos en tubos de 1,5 ml.
      NOTA: A veces es suficiente para mantener la cola del ratón hacia arriba; Las heces se pueden recoger directamente desde el ano en un tubo.
    4. Recolectar muestras fecales de cada ratón una vez por semana durante el experimento de cuatro semanas ( Figura 1 ). Recoger las primeras muestras en el primer día (T0, tiempo cero), justo antes de la exposición de los ratones a las bacterias. Recoger las siguientes muestras fecales en los días 7, 14, 21 y 28.
    5. Refrigere las muestras a 4 ° C hasta su transporte al laboratorio, donde se congelan a -80 ° C. Planificar con antelación y proporcionar suficientes cajas de almacenamiento, ya que un gran número de feSe recogerán muestras de cal durante el experimento.
  2. Pesar todos los ratones cada semana en el día de recolección fecal.
  3. Recoger muestras de sangre de la vena facial de todos los ratones el día 15 de días, el último día de la administración de las bacterias, y determinar los niveles de triglicéridos, colesterol total, lipoproteína de alta densidad (HDL), y lipoproteína de baja densidad (LDL) en el tranfusion de sangre.
    NOTA: El personal experimentado debe recoger la sangre para reducir el estrés en los animales.

4. Recuento de LAB y Actividad de Bacteriocinas

  1. Se pesa un sedimento fecal de cada muestra en un tubo de 1,5 ml y se añade un volumen adecuado de NaCl al 0,9% enfriado con hielo para conseguir una solución al 10% (p / v). Utilizar micropilotes estériles para tubos de 1,5 ml para homogeneizar la suspensión fecal y preparar diluciones en serie de diez veces en NaCl helado al 0,9%.
  2. Cuente el número total de células LAB.
    1. Transferir las células diluidas (100 μl) a 4 ml de Ma precalentadaN de agar blando Rogosa Sharpe (MRS) (50 ◦ C, 0,8% de agar). Se mezcla agitando vorticialmente antes de verter las células sobre una placa de agar MRS sólida (agar al 1,5%).
    2. Se seca la placa retirando la tapa durante 5 - 10 min en la cubierta estéril antes de incubar las células durante 20 - 24 h a 30 ° C para el crecimiento celular y la formación de colonias.
  3. Contar las células productoras de bacteriocinas.
    1. Transferir las células diluidas (100 μl) del productor de bacteriocina a 4 ml de agar blando MRS precalentado (50 ºC, agar al 0,8%), mezclar por vórtex y verter las células sobre una placa de agar MRS (agar al 1,5%); Esta capa se conoce como la primera capa.
    2. Transferir otros 4 ml de agar MRS blando libre de células (0,8% de agar) sobre la primera capa para incrustar todas las células dentro del agar blando.
      NOTA: Esta capa pretende evitar que las células crezcan como colonias en la superficie de las placas de agar. Las células que crecen en la superficie se desplazan fácilmente al verter células indicadoras en la parte superior (paso 4.3.4) yComplicará la interpretación de los resultados. Esta capa se conoce como la segunda capa.
    3. Se seca la placa retirando la tapa durante 5 - 10 min en la cubierta estéril antes de incubar durante 20 - 24 h a 30 ° C para el crecimiento celular y la formación de colonias.
    4. Para identificar las colonias productoras de bacteriocinas, mezclar 40 μl de un cultivo durante la noche de una cepa indicadora apropiada, como se muestra en la Tabla 1 , con 4 ml de agar blando precalentado. Vierta la mezcla en la placa; Esta capa se conoce como la tercera capa.
    5. Se seca la placa retirando la tapa durante 5 - 10 min en la cubierta estéril antes de incubar durante 20 - 24 h a 30 ° C para el crecimiento celular y la formación de colonias.
      NOTA: Las colonias productoras de bacteriocinas tienen zonas claras (de inhibición) alrededor de las colonias ( Figura 2 ).

5. Extracción de ADN, 16S rDNA Amplification, y secuenciación

NOTA: Pasos fO extracción de ADN se describen para el uso de un kit comercial ( por ejemplo, Kit Realpure "SSS").

  1. Suspender 1 - 2 pastillas de ratones fecales (~ 200 mg) en 300 μl de solución de lisis.
  2. Transferir la muestra a un microtubo de 2 ml en el que se han colocado previamente aproximadamente 0,5 g de perlas de vidrio (diámetro: 0,1 mm).
  3. Añadir 1 μl de mutanolinsina a 10 U / μL y 2 μL de lisozima a 20 mg / ml a cada muestra e incubar a 37 ° C durante 40 - 60 min. Proceder con uno de los protocolos estándar para la extracción de ADN de muestras fecales [ 12] .
  4. Aplicar dos ciclos de pasos de batidor de cuentas, 1 min cada uno.
  5. Añadir 2 μl de proteinasa K y mezclar bien.
  6. Incubar durante 20 min y agitar cada 5 min.
  7. Enfriar las muestras a 37 ° C y añadir 1 μl de 5 μg / ml de RNasa A a la muestra. Mezcle bien.
  8. Incubar a 37 ° C durante 30 - 60 min.
  9. Enfriar las muestras a temperatura ambiente y añadir 180 μlDe la solución de precipitación de proteínas. Vórtice vigorosamente a velocidad máxima durante 20 - 30 s.
  10. Centrifugar a 16.000 xg durante 5 min. Si hay partículas flotando en el sobrenadante, incubar las muestras en hielo durante 5 min y luego centrifugar de nuevo.
  11. Se transfiere el sobrenadante que contiene el ADN a un nuevo microtubo de 1,5 ml que contiene 300 μl de isopropanol.
  12. Se mezclan invirtiendo los tubos 20-30 veces e incubando durante 1 h a -20ºC. Alternativamente, incubar los tubos durante un período más largo ( por ejemplo, durante la noche).
  13. Centrifugar a 16.000 xg durante 2 min.
  14. Retirar el sobrenadante y secar el tubo sobre papel absorbente. Añadir 300 μl de etanol al 70% para lavar el sedimento de ADN.
  15. Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min, eliminar el sobrenadante, y dejar el pellet para secar durante unos 15 min.
  16. Una vez que el sedimento esté seco, añadir 100 μl de agua estéril o tampón Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) y resuspender el sedimento.
  17. Para eliminar cualquier posible inhibiciónCompuestos durante las etapas siguientes, limpiar el ADN. Mezclar el ADN extraído con 2 volúmenes (200 μl) de tampón NTI para ajustar las condiciones de unión para el paso 5.15.
  18. Coloque una membrana de sílice que contenga una columna de PCR en un tubo de recogida (2 ml) y cargue la muestra.
  19. Centrifugar durante 30 s a 11.000 x g. Deseche el flujo.
  20. Lavar la membrana de sílice con 700 μl de tampón NT3 y repetir el paso 5.16.
  21. Se seca la membrana de sílice por centrifugación durante 1 min a 11.000 xg para eliminar cualquier tampón de lavado NT3 residual que contenga etanol.
  22. Transferir la columna a un nuevo microtubo de 1,5 ml e incubar durante 2 - 5 min a 70 ° C para la eliminación total del etanol.
  23. Añadir 30 μL de agua de grado PCR e incubar durante 5 minutos a 70 ° C. Eluir por centrifugación durante 1 min a 11.000 x g.
  24. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro UV / Vis o un método fluorométrico.
  25. Normalizar y agrupar las muestras de ADN de ratones que comparten la misma jaula a cada uno Ch tiempo punto.
  26. Para observar variaciones individuales durante el tiempo, secuenciar muestras de ADN de tres ratones seleccionados aleatoriamente del control y de otras dos jaulas aleatorias en los días 0, 14 y 28.

6. 16S rRNA Gene Amplification and Sequencing

  1. Preparar una biblioteca de genes 16S rRNA amplificado. Amplificar la región V3-V4 del gen de rRNA 16S bacteriano 5 usando cebadores directos e inversos con adaptadores de saliente apropiados:
    5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
    5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 '
  2. Compruebe las bandas amplificadas usando electroforesis con gel de agarosa al 1%.
  3. Limpiar los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando perlas magnéticas para la purificación del amplicón.
  4. Proceda con los siguientes pasos indicados por el fabricante de acuerdo con la plataforma de secuenciación masiva utilizada> 6.

7. Análisis de Datos y Estadísticas

  1. Filtrado de calidad (generalmente realizado en instalaciones de secuenciación).
    1. Filtra los datos de lectura sin procesar y de-multiplex utilizando el software suministrado con el equipo.
    2. Procesar las lecturas de pares de extremo utilizando la tubería UPARSE 13 implementada en USEARCH 14 (versión 7.0.1090). Combinar los extremos emparejados y aplicar el filtrado de calidad utilizando un valor de error esperado máximo (maxee) de 1,0. Descarte las secuencias de menos de 150 nt. Dereplicate secuencias para descartar singletons.
    3. Agrupe las secuencias en unidades taxonómicas operativas (OTU) en una identidad de secuencia del 97% y use UCHIME 15 para filtrar secuencias quiméricas.
  2. Cosecha OTU, asignación taxonómica y reconstrucción filogenética, y análisis y visualizaciones de la diversidad.
    1. Procesar las OTU utilizando Cuantitativas Insights IntO Ecología Microbiana (QIIME) 16 .
    2. Elija y alinee las OTU representativas contra la base de datos de conjuntos básicos de Greengenes 17 utilizando PyNAST 18 con una identidad mínima del 75% (predeterminada).
    3. Asignar taxonomía a las secuencias alineadas utilizando el programa de clasificación de bases de datos de Ribosomal (RDP) 19 con una confianza de 0,8.
    4. Normalizar la tabla OTU al recuento de secuencias de la muestra con la profundidad de secuencia más baja.
    5. Construir un árbol filogénico de secuencias alineadas utilizando Fast Tree 20 después de la etapa de filtración con el fin de eliminar regiones muy variables y las posiciones que son todas las lagunas. Utilice este árbol para calcular las diversidades alfa y beta y para calcular las curvas de rarefacción y los índices de Shannon.
    6. Para generar y visualizar métricas de distancia UniFrac no ponderadas 21 , utilice el análisis de coordenadas principal (PCoA).
      NOTA: Para sSe pueden utilizar diferentes paquetes de software, como R 22 o las herramientas estadísticas implementadas dentro de QIIME 16 .
    7. Para la comparación de los índices de diversidad de Shannon entre los diferentes tratamientos, utilice un ANCOVA, considerando el tiempo como una variable dependiente continua en R.
    8. Compare las distancias entre tratamientos en PCoA en QIIME usando una prueba t de Student de dos caras y calcule los valores p no paramétricos con 1.000 permutaciones de Monte Carlo usando la corrección de Bonferroni.
    9. Analizar las correlaciones entre la abundancia relativa de OTUs específicos y otros parámetros medidos, tales como los niveles séricos de colesterol, HDL, LDL, etc. , utilizando el análisis de correlación de Pearson. Para ello, utilice CoNet 23 con la posterior visualización de redes de correlación utilizando Cytoscape 3.1.1 24 .

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Representative Results

La producción de bacteriocinas ha sido considerada como una característica probiótica positiva en LAB, ya que se supuso que previene el crecimiento de bacterias y patógenos oportunistas. El objetivo de este trabajo fue mostrar la capacidad de las bacteriocinas para modular las poblaciones de microbiota intestinal en un modelo de ratón. Para ello, se desarrolló un procedimiento para comparar el efecto de la ingesta de cepas productoras de bacteriocina y sus cepas isogénicas no productoras. El procedimiento para la inoculación y la extensión de tiempo del ensayo se muestran en la Figura 1 . Los ratones se agruparon en once jaulas: un control sin tratamiento, cinco jaulas tratadas con cepas productoras de bacteriocina y cinco jaulas tratadas con los correspondientes mutantes isogénicos que han reducido o no la producción de bacteriocina. El laboratorio de laboratorio productor de bacteriocinas probado, así como los recuentos respectivos (cfu / mL) en agua potable y recuentos en heces, se resumen en Figura 2 muestra la determinación de la producción de bacteriocina por LAB recuperada de heces. No hubo diferencias significativas entre los tratamientos de bacteriocina y las cepas isogénicas cuando todas las muestras y todos los grupos bacterianos se consideraron juntos ( Figura 3 ). Sin embargo, hubo probables diferencias cuando géneros bacterianos particulares se estudiaron de forma independiente, como se muestra en la Figura 4 . Además, el análisis de correlación de Pearson reveló una relación significativa entre diferentes géneros bacterianos y una correlación entre géneros y triglicéridos bacterianos y LDL en el suero, como muestra la red construida en CoNet en la Figura 5 .

Figura 1
Figura 1: Esquema que muestra el diseño del curso del tiempo de la ExpeRimento Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Detección de la producción de bacteriocina en LAB recuperado de heces por un protocolo de tres capas (como se describe en el procedimiento). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: Comparación de la composición de los tratamientos con bacterias. Se generó un gráfico de PCoA basado en las distancias calculadas en una matriz UniFrac no ponderada. Diferentes puntos de tiempo de la misma muestra ( et al. , 2016 12 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Cambios en la abundancia relativa de grupos bacterianos dirigidos por bacterias bacterianas y de bactericina en el nivel de género durante los períodos de tratamiento y postratamiento. CambioS en la abundancia relativa de géneros en tratamientos, obtenidos con respecto al tiempo 0, se compararon con los del grupo control (CON). Para mayor claridad de la ilustración, solo se muestran cuatro cepas: cepas productoras de garvicina y sakacina y cepas no productoras (ver la leyenda en la figura para relacionar color y tratamiento). Las barras de error representan la desviación estándar. El grado de significancia se representa como sigue: P <0,1 con punto (.); P <0,05 con una estrella (*); P <0,01 con dos estrellas (**). Adaptado de Umu et al. , 2016 12 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Red de Correlación de Abundancias Relativas de OTUs en el Día 14 y Niveles Sueros. Las correlaciones fueron caCalculado utilizando la correlación de Pearson en CoNet. Sólo los significativos (P <0,05) se muestran en la red. Los parámetros determinados en el colesterol sérico total ( Chol ), lipoproteína de alta densidad ( HDL ), lipoproteína de baja densidad ( LDL ) y triglicéridos ( Trig - se muestran en un color gris), mientras que los OTU pertenecientes a familias diferentes están representados por Diferentes colores (ver leyenda) Correlaciones positivas se muestran con bordes verdes y correlaciones negativas con bordes rojos Adaptación de Umu et al. , 2016 12 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Inoculada en agua potable Las bacterias de ácido láctico cuentan en heces Cepas indicadores
CFU / ml (log10) CFU / g (log10 medio)
CONTROLAR ---- 10 ratones DAKOTA DEL NORTE
Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) 1,6 9 ratones 8,53 pm 0,18 Enterococcus faecium P21 (LMG 2783)
Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) 2,0 9 ratones 8,22 ± 0,05
Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) 26 9 ratones 8,73 pm 0,12 Enterococcus faecium P21 (LMG 2783)
PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) 25 9 ratones 8,75 ± 0,09
Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) 6 9 ratones 8,83 pm 0,14 Pediococcus damnosus (LMG 3397)
Enterococcus faecium B1505 (curado con L50) 10 9 ratones 8,72 pm 0,14
Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) 26 9 ratones 9,14 ± 0,14 Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003)
Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) 23 9 ratones 8,60 pm 0,18
Lactococcus garviae B1515 (GarML +) 17 9 ratones 8,41 ± 0,08 Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705)
Lactococcus garviae B1516 (GarML -) 17 9 ratones 8,05 pm 0,18
Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) para SakA y PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) para enterocinas, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) para plantaricinas, y Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) para GarML.

Tabla 1: cepas inoculadas y las cuentas en muestras fecales.

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Discussion

El procedimiento descrito aquí se ha utilizado para determinar si los cambios en la microbiota están ligados a la salud o la edad. Diferentes partes del protocolo son importantes, pero entre ellas, el muestreo de las heces, la elección del fragmento de ADN a ser secuenciado y analizado, y la realización de la extracción de ADN y el análisis bioinformático podría ser sin duda los puntos más críticos. El muestreo es crucial porque, por razones éticas, los ratones no deben ser subrayados y porque se sabe que cambia la proporción de bacterias en el intestino. Las muestras deben ser procesadas lo más pronto posible o congeladas hasta su uso, ya que algunas bacterias son muy sensibles a la deshidratación y / o al oxígeno. La selección del fragmento de ADN a secuenciar a partir de los genes 16S rRNA amplificados es un punto crucial. En este trabajo se seleccionaron las regiones variables V3 - V4 [ 25] . La importancia del método de extracción de ADN no debe subestimarse, ya que las células bacterianas presentes en las muestras no son todas eqUalmente sensibles a diferentes protocolos de lisis, y los sesgos en la estimación de las poblaciones bacterianas pueden resultar de la lisis incompleta. Por lo tanto, se requiere la introducción de una etapa batidora. Las cepas isogénicas pueden ser construidas por derribo genético o por curado de plásmido, aunque en el caso de cepas, las bacteriocinas codificadas por cromosomas refractarias a la transformación pueden representar un problema. Este procedimiento puede adaptarse utilizando diferentes técnicas de cultivo específicas, como los métodos anaeróbicos 26 .

El procedimiento puede modificarse en la mayoría de los pasos, dependiendo del tipo de cambios de factor a estudiar. El procedimiento de inoculación podría acortarse, pero los cambios en los parámetros séricos pueden necesitar algún tiempo para desarrollarse. Una posible limitación del método podría ser el estudio de cepas bacterianas (nutrientes o compuestos) que no pueden sobrevivir varias horas en agua o que pueden agruparse (o precipitar por compuestos). Por lo tanto, este es un factor que debe al Por lo que debe considerarse.

Hasta ahora, la actividad de la bacteriocina se determinó generalmente in vitro 27 , 28 , 29 o en cultivos mixtos [ 30] . Este método ha permitido el monitoreo in vivo de las actividades de cinco bacteriocinas de la microbiota de intestino entero de ratones de laboratorio convencionales. Se pueden determinar pequeñas variaciones en las poblaciones, así como su influencia sobre otros grupos bacterianos o factores fisiológicos, como los parámetros séricos 12 . Las bacteriocinas tienen un espectro de actividad relativamente estrecho, inhibiendo el crecimiento de bacterias taxonómicamente relacionadas. Sin embargo, los utilizados en este ensayo están entre los más eficaces, ya que algunos de ellos son activos contra Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 e incluso algunas cepas de Escherichia coli , como en el caso de la sakacina AAss = "xref"> 32. Cuando se inocularon en ratones, las bacteriocinas productoras de LAB no dieron lugar a cambios notables en la composición global de la microbiota, sino más bien a un número reducido de taxones bacterianos. Sin embargo, el análisis de redes de correlación global reveló interesantes compatibilidades ecológicas y antagonismo entre diferentes bacterias. Este método podría adaptarse para analizar el efecto de los constituyentes de los alimentos, fármacos u otros compuestos, aunque el resultado esperado puede ser deliberadamente restringido para preservar condiciones sanas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la Subvención de la AEMA NILS Ciencia y Movilidad Coordinada de Sostenibilidad de Investigadores (referencia 017-ABEL-CM-2013). CB y GP-M. Fueron apoyados por la subvención AGL2015-70487-P del Ministerio de Economía y Competitividad. OCOU y DBD fueron apoyados por un programa estratégico de la beca para la investigación de la ciencia del alimento de la universidad noruega de las ciencias de la vida (NMBU) (proyecto 1205051025). También queremos agradecer a Inmaculada Noguera por su ayuda en el cuidado de los animales y el muestreo y por Jesús Dehesa por su ayuda para asegurar la disponibilidad de materiales de laboratorio en la instalación de animales. También apreciamos al profesor Lars-Gustav Snipen por sus consejos sobre estadísticas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balb/c mice (female) Harlan Mice should be 6 - 8 weeks of age
Plastic Petri dish Thermo Scientific 101VR20
Brain-Heart-Infusion broth Conda 1400.00
European Bacteriological Agar Pronadisa 1800.00
Agarose D1 Low EEO Pronadisa 8010.00
1x TAE buffer Thermo Scientific 15558042
MRS broth Difco 288130
PBS tablets Sigma P4417-100TAB
scale Mettler Toledo PB602-S
sterile forceps Levantina de Laboratorios S.L. 260-3710014
Microcentrifuge Eppendorf 5424
Centrifuge Hermle Z383K
sodium chloride AppliChem Panreac 121659.1211
Realpure SSS Kit Real Life Science Solutions, Durviz, Spain RBME04 (300 ml)
Isopropanol AppliChem Panreac 131090.1611
Ethanol AppliChem Panreac 131086.1214
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851
AMPure XP beads Beckman Coulter Genomics, USA A63881 (60 ml)
PerfeCta NGS library quantification kit Quanta BioSciences, Maryland, USA 733-2300
MiSeq v3 reagent kit Illumina, San Diego, California, USA MS-102-3003
Primers for 16S rRNA gene amplification Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’
Nextera XT Index kit FC-131-1002 Indices and Illumina sequencing adaptors
Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. Sigma Z317314-1PAK
Glass beads, 0.1 mm diameter Biospec Products 11079-101
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740609.25
Omni Bead Ruptor 24 Omni International Inc. 19-040
mutanolysin Sigma M9901-10KU
lysozyme Roche 10837059001
proteinase K Roche 3115887001
RNase A Sigma R4875

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References

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Cellular Biology Número 125 Modelo de ratón muestras fecales microbiota intestinal bacteriocina secuenciación masiva análisis bioinformático poblaciones bacterianas colesterol triglicéridos
Un método para evaluar los efectos de bacteriocinas en la microbiota intestinal de ratones
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Bäuerl, C., Umu, Ö. C. O.,… More

Bäuerl, C., Umu, Ö. C. O., Hernandez, P. E., Diep, D. B., Pérez-Martínez, G. A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice. J. Vis. Exp. (125), e56053, doi:10.3791/56053 (2017).

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