Summary
Si crede che i batteriossinici svolgano un ruolo fondamentale nella definizione della diversità microbica in diverse nicchie ecologiche. Qui descriviamo una procedura efficace per valutare come i batteriosi influenzano la composizione del microbiota intestinale in un modello animale.
Abstract
Domande molto interessanti nascono con la nostra conoscenza avanzata sulla composizione del microbiota intestinale e sul rapporto con la salute, in particolare per quanto riguarda i fattori che contribuiscono a mantenere l'equilibrio della popolazione. Tuttavia, ci sono limitate metodologie disponibili per valutare questi fattori. Le batteriossine sono peptidi antimicrobici prodotti da molti batteri che possono conferire un vantaggio competitivo per l'acquisizione di cibo e / o la creazione di nicchia. Molti ceppi probiotici di batteri lattici (LAB) hanno un grande potenziale per promuovere la salute umana e animale impedendo la crescita degli agenti patogeni. Possono essere utilizzati anche per l'immuno-modulazione, in quanto producono batteriosi. Tuttavia, l'attività antagonista dei batteriosi è normalmente determinata da biotestimenti di laboratorio in condizioni ben definite ma sovra-semplificate rispetto all'ambiente complesso dell'intestino negli esseri umani e negli animali, dove i batteri affrontano influenze multifattorie dell'host e centinaia di specie microbicheLa stessa nicchia. Questo lavoro descrive una procedura completa ed efficiente per valutare l'effetto Di una varietà di batteriosi con differenti specificità di bersaglio in un sistema murino. I cambiamenti nella composizione microbiota durante il trattamento con batteriosi vengono monitorati utilizzando sequenze di composizione 16S rDNA. Il nostro approccio utilizza entrambi i produttori di batteriossina e le loro mutanti isogene che non producono batteriossine, quest'ultimo che consente di distinguere i batteriosi dalle relative modificazioni del microbiota non legate ai batteriosi. L'estrazione del DNA fecale e il metodo di sequenziamento 16D rDNA sono coerenti e, insieme alle bioinformatiche, costituiscono una potente procedura per individuare deboli cambiamenti nei profili batterici e per stabilire le correlazioni, in termini di concentrazione del colesterolo e trigliceride, tra popolazioni batteriche e marcatori sanitari. Il nostro protocollo è generico e può quindi essere usato per studiare altri composti o nutrienti con il potenziale di alterare il mic del hostRobiota, sia quando si studia tossicità o effetti benefici.
Introduction
Le batteriossine sono peptidi antimicrobici prodotti da una vasta gamma di specie batteriche 1 , 2 . Questi composti ei loro produttori, in particolare LAB, sono stati esplorati e sfruttati in tutto il mondo da decenni per le loro potenziali applicazioni nella conservazione e nella medicina 3 . Alcune batteriossine sono noti per uccidere importanti agenti patogeni, tra cui specie di Listeria, Enterococcus, Staphylococcus e Bacillus . Alcuni batteriosi hanno anche la capacità di modulare la risposta immunitaria 4 . Molte batteriossine hanno spettri relativamente stretti, una proprietà molto apprezzata in alcune applicazioni. Ad esempio, alcuni batteriosi di spettro a strisce possono essere utilizzati per dirigere attività specifica contro gruppi selezionati di batteri problematici, senza molta disturbo sulla flora commensale o benefica che condividono la stessa nicchia; Questo è particolarmente importante nell'entroterraDove numerosi microbi benefici beneficiano in maniera interattiva e dinamica 5 . Anche le bakteriociine sono molto attraenti per l'uso profilattico o probiotico, in quanto possono sopprimere la crescita (out) di patogeni, pathobionti o batteri opportunistici che possono sbilanciare l'omeostasi dell'intestino 6 , 7 .
In termini di natura e proprietà fisico-chimiche, le batteriossine sono molto diverse, in quanto hanno strutture diverse, specificità target, modalità di azione, ecc. La maggior parte delle batteriossine sono state studiate in grande dettaglio in condizioni in vitro , ma pochissime sono state testate negli alimenti Matrici 8 , 9 o in vivo, come ad esempio in un intestino animale 6 , 10 . Le proprietà in vitro possono differire in larga misura quando valutate in vivo a causa della complessità oL'ambiente dell'intestino e anche gli effetti involontari su ipotesi sui batteri benefici. La maggior parte dei probiotici sono LAB. Essi producono una serie di altri metaboliti, inclusi acidi grassi a catena corta, che sono noti per influenzare la fisiologia dell'host, nonché per dimostrare proprietà antimicrobiche verso alcuni batteri. Pertanto, nel caso di ceppi probiotici che producono batteriosi, è meglio stabilire saggi realistici, come ad esempio gli animali sani con microbiota normale.
Nel presente studio forniamo una strategia che permette di valutare l'effetto di diversi ceppi produttori di batteriossina, i cui batteriosi hanno diversi spettri inibitori, sui topi sani. La nostra strategia comprende l'alimentazione di topi con mutanti isogeni non batteriosi, che consente la differenziazione degli effetti batteriocin mediati da effetti non mediati da batteriosi. Sequencing 16S rDNA consente di seguire i cambiamenti dinamici della popolazione batterica nell'intestino. sottotitoliEquazioni di analisi statistiche di decifrare le correlazioni tra le specie batteriche e anche tra le specie batteriche ei parametri fisiologici misurati ( es., Peso corporeo, parametri biochimici sierici, ecc .). Crediamo che il protocollo presentato in questo studio sia applicabile anche ad altre applicazioni probiotiche o prebiotiche al di là dello studio di batteriosi in animali vivi.
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Protocol
La cura e la manipolazione devono essere eseguiti presso un'unità specializzata per la cura degli animali. Le procedure descritte qui sono state approvate dal corrispondente Comitato Etico dell'Università di Valencia e dalle autorità locali, seguendo i principi della cura degli animali da laboratorio obbligatori da parte della Legge dell'Unione Europea e dal 2010/63 / UE e dal governo spagnolo RD 53/2013 sulla protezione degli animali Utilizzati a fini scientifici, al fine di rispettare il principio 3R nella sperimentazione animale (Sostituzione, Riduzione, Raffinazione).
1. Le culture batteriche congelate utilizzate per inoculare i topi
- Inoculare i singoli ceppi di LAB in 5 ml di mezzo di infusione cerebrale-cuore (BHI) e svilupparli per 20-24 ore (durante la notte) a 30 ° C.
- Diluire ogni coltura batterica durante la notte a 100 volte in BHI trasferendo 2 mL di coltura overnight a 200 mL di BHI. Farli crescere a 30 ° C per 20 - 24 h.
NOTA: I ceppi utilizzati in questo studio sono elencati nella tabella 1. - Harvest cePer centrifugazione a 5.000 xg per 20 minuti a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte sospendendo ogni pellet di cellule in 100 ml di soluzione fisiologica salata fosfato ghiacciata (PBS) e raccogliendo le cellule come nel punto 1.3.
- Dopo il secondo lavaggio, sospendere ogni pellet di cellule in 20 ml di ghiaccio ghiacciato al 15% in PBS.
- Aliquota la sospensione cellulare in volumi da 1 ml in tubi e quindi conservarli a -80 ° C fino all'uso.
NOTA: Le cellule devono essere utilizzate entro 1-2 mesi dopo questo punto. - Determinare il numero di cellula prima dell'archiviazione e prima della somministrazione in modo che sia noto il numero di cellule vive somministrate ai topi.
- Per il conteggio delle cellule, fare le diluizioni seriali dieci volte delle cellule in soluzione fredda del 0,9% di cloruro di sodio (NaCl). Distribuire 100 μL di ciascuna diluizione su una piastra BHI agar. Incubare per una notte (20 - 24 h) a 30 ° C per la crescita cellulare e la formazione di colonie, quest'ultimo per determinare unità di formazione della colonia (cfu) / mL.
- Per produrre acqua potabile contenente batteri, diluire le cellule di ogni coltura batterica in 100 ml di acqua potabile filtrata sterile, con una cfu media finale di 10 9 / ml di acqua. Per la valutazione della sopravvivenza batterica, contate le cellule vive subito dopo la diluizione e dopo 24 h una volta alla settimana durante le prime due settimane di trattamento batterico.
2. Analisi dei topi e progettazione sperimentale
Nota: per questo esperimento sono necessari specifici topi femmina BALB / c (6 - 8 settimane) specifici per patogeni (SPF); Qui sono stati acquistati un totale di 100 animali.
- Fornire ai topi l'accesso libero ai cibi e all'acqua pelletati durante l'esperimento.
- Progettare l'esperimento e calcolare il potere.
- Se ogni trattamento ha il proprio controllo, applicare un disegno di controllo caso-controllo accoppiato (t-test). Utilizzare un dosaggio preliminare per calcolare l'errore medio e standard degli effetti più importanti da determinare. Ottimizzare la potenza del saggio e il numero di animali necessari per gruppo utilizzando metodi diversi e programmi liberamente disponibili 11 .
- Per testare gli effetti del produttore di batteriossin contro ceppi non produttori, utilizzare 9 animali per condizione sperimentale.
NOTA: Questo numero è stato determinato in base all'errore standard sperimentale e ha fornito una potenza soddisfacente (0,7 - 1,0) e un livello di significatività inferiore a 0,05.
NOTA: Nell'esempio riportato sono state effettuate 11 gruppi di topi, uno per gabbia. Dieci gabbie corrispondevano ai trattamenti con 5 ceppi produttori di bateriocin e dai corrispondenti 5 ceppi non producenti isogeni; L' 11a gabbia aveva 10 topi e costituiva il controllo non trattato.
- Dopo l'arrivo dei topi agli impianti di allevamento, distribuirli in gabbie e con l'orecchio degli animali per consentire il tracciamento individuale. Acclimatare i topi alle strutture e alle condizioni di allevamento per una settimana prima di proceeding.
- Preparare l'acqua potabile contenente batteri, come descritto nel punto 1.8, e collocare le bottiglie d'acqua potabile nelle corrispondenti gabbie indipendenti che sono chiaramente identificate in modo che i topi in ciascuna gabbia condividano la stessa bottiglia d'acqua.
NOTA: Il gruppo di controllo deve essere tenuto in una gabbia separata, senza contatto con i batteri testati. - Preparare ogni giorno una nuova bottiglia con acqua potabile fresca (100 ml) e aggiungere sospensioni batteriche appena sbrinate. Fai questo per 15 giorni consecutivi.
- Seguire il trattamento batterico con un periodo di due settimane, durante il quale i topi bevono acqua senza batteri ( Figura 1 ).
3. Raccolta di campioni
- Raccogli i campioni di fecale.
- Preparare le gabbie autoclavate (vuote) e pinze sterili e etichettare i tubi sterili da 1,5 ml per ogni topo.
- Raccogli i campioni allo stesso tempo del giorno per evitare variazioni nella composizione microbiota durante il thUn corso di giorno. Per risultati ottimali, raccogliere separatamente campioni freschi.
NOTA: Preferibilmente, raccogli le feci presto la mattina, quando i topi tendono a defecare spontaneamente. - Pulire una gabbia vuota con alcool al 70% e collocare un mouse all'interno. Lasciarlo defecare e raccogliere 2 - 4 pellet fecali utilizzando pinze sterili, collocandole in tubi da 1,5 ml.
NOTA: A volte è sufficiente tenere la coda del mouse verso l'alto; Lo sgabello può essere raccolto direttamente dall'ano in un tubo. - Raccogli i campioni di fecale da ogni mouse una volta alla settimana durante l'esperimento di quattro settimane ( Figura 1 ). Raccogli i primi campioni il primo giorno (T0, zero), poco prima dell'esposizione dei topi ai batteri. Raccogli i seguenti campioni di fecali nei giorni 7, 14, 21 e 28.
- Refrigerare i campioni a 4 ° C fino al loro trasporto al laboratorio, dove vengono congelati a -80 ° C. Pianificare in anticipo e fornire abbastanza scatole di stoccaggio, come un gran numero di feI campioni calcolati verranno raccolti durante l'esperimento.
- Pesare tutti i topi ogni settimana sulla giornata di raccolta fecale.
- Raccogliere i campioni di sangue dalla vena viso da tutti i topi, il 15 ° giorno, l'ultimo giorno di somministrazione batteri, e determinare i livelli di trigliceridi, colesterolo totale, ad alta densità di lipoproteine (HDL) e lipoproteine a bassa densità (LDL) nel Sangue siero.
NOTA: Il personale esperto dovrebbe raccogliere il sangue per ridurre lo stress negli animali.
4. LAB Counting e attività battericosi
- Pesare un pellet fecale di ciascun campione in un tubo da 1,5 ml e aggiungere un adeguato volume di NaCl da 0,9% di ghiaccio freddo per ottenere una soluzione al 10% (in peso). Utilizzare micropiastre sterili per tubi da 1,5 ml per omogeneizzare la sospensione fecale e preparare diluizioni seriali dieci volte in 0.9% NaCl di ghiaccio freddo.
- Conta il numero totale di cellule LAB.
- Trasferire le cellule diluite (100 μL) in 4 ml di Ma prewarmedN Rogosa Sharpe (MRS) agar agar (50 ° C, 0,8% agar). Mescolare da vortexing prima di versare le cellule su una piastra agar agile MRS (1,5% agar).
- Asciugare la piastra prelevando il coperchio per 5-10 minuti nel cappuccio sterile prima di incubare le cellule per 20-24 ore a 30 ° C per la crescita cellulare e la formazione della colonia.
- Contare cellule che producono batteriossina.
- Trasferire le cellule diluite (100 μL) del produttore di batteriocinato a 4 ml di agar aglasti MRS preriscaldati (50 ° C, 0,8% agar), mescolare per vortexing e versare le cellule su un piatto agar MRS (1,5% agar); Questo livello viene indicato come primo strato.
- Trasferire altri 4 mL di agar soft soft MRS (0.8% agar) sul primo strato per incorporare tutte le cellule all'interno dell'agarico morbido.
NOTA: Questo strato è inteso per impedire alle cellule di crescere come colonie sulla superficie delle piastre agar. Le cellule che crescono sulla superficie vengono facilmente spostate quando versano le celle di indicatore sulla parte superiore (punto 4.3.4) eComplicano pertanto l'interpretazione dei risultati. Questo livello è definito come il secondo livello. - Asciugare la piastra prelevando il coperchio per 5-10 minuti nel cappuccio sterile prima di incubare per 20-24 ore a 30 ° C per la crescita cellulare e la formazione della colonia.
- Per identificare colonie che producono batteriossine, mescolare 40 μL di una coltura di notte di un adeguato ceppo di indicatore, come mostrato nella Tabella 1 , con 4 ml di agar aglume preampaltato. Versare la miscela sul piatto; Questo livello è definito come il terzo livello.
- Asciugare la piastra prelevando il coperchio per 5-10 minuti nel cappuccio sterile prima di incubare per 20-24 ore a 30 ° C per la crescita cellulare e la formazione della colonia.
NOTA: Le colonie che producono bakteriocine hanno zone chiare (inibizione) attorno alle colonie ( Figura 2 ).
5. Estrazione del DNA, amplificazione 16D rDNA e sequenza
NOTA: passo fO l'estrazione del DNA sono descritti per l'uso di un kit commerciale ( ad esempio, kit Realpure "SSS").
- Sospendere 1 - 2 pellet di topi fecali (~ 200 mg) in 300 μl di soluzione di lisi.
- Trasferire il campione in un microtube da 2 mL in cui sono stati precedentemente posizionati circa 0,5 g di perle di vetro (diametro: 0,1 mm).
- Aggiungere 1 μL di mutanolisina a 10 U / μL e 2 μL di lisozima a 20 mg / ml per ogni campione e incubare a 37 ° C per 40-60 minuti. Procedere con uno dei protocolli standard per l'estrazione del DNA da campioni fecali 12 .
- Applicare due cicli di gradini di bead-beater, 1 min ciascuno.
- Aggiungere 2 μl di proteinasi K e mescolare accuratamente.
- Incubare per 20 minuti e vortex ogni 5 min.
- Raffreddare i campioni a 37 ° C e aggiungere 1 μL di 5 μg / mL RNasi A al campione. Mescolare accuratamente.
- Incubare a 37 ° C per 30-60 minuti.
- Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 180 μLDella soluzione di precipitazione delle proteine. Vorticare vigorosamente alla velocità massima per 20-30 s.
- Centrifugare a 16.000 xg per 5 min. Se ci sono particelle che galleggiano nel surnatante, incubare i campioni in ghiaccio per 5 minuti e poi centrifugare di nuovo.
- Trasferire il surnatante contenente il DNA in un nuovo microtubo da 1,5 ml contenente 300 μL di isopropanolo.
- Mescolare invertendo i tubi 20-30 volte e incubare per 1 ora a -20 ° C. In alternativa, incubare i tubi per un periodo più lungo (per esempio, durante la notte).
- Centrifugare a 16.000 xg per 2 min.
- Rimuovere il surnatante e asciugare il tubo sulla carta assorbente. Aggiungere 300 μl di etanolo al 70% per lavare il pellet di DNA.
- Centrifugare a 16.000 xg per 1 min, togliere il surnatante e lasciare asciugare il pellet per circa 15 minuti.
- Una volta che il pellet è asciutto, aggiungere 100 μl di acqua sterile o tampone Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) e risospendere il pellet.
- Per eliminare qualsiasi possibile inibizioneComposti durante i passaggi successivi, pulire il DNA. Mescolare il DNA estratto con 2 volumi (200 μL) di tampone NTI per regolare le condizioni di legame per la fase 5.15.
- Mettere una membrana di silice contenente una colonna di pulizia PCR in un tubo di raccolta (2 mL) e caricare il campione.
- Centrifugare per 30 s a 11.000 x g. Scartare il flusso.
- Lavare la membrana di silice con 700 μL di buffer NT3 e ripetere la fase 5.16.
- Asciugare la membrana di silice mediante centrifugazione per 1 min a 11.000 xg per rimuovere qualsiasi residuo etanolo contenente NT3 di lavaggio.
- Trasferire la colonna in un nuovo microprocessore da 1,5 ml e incubare per 2 - 5 minuti a 70 ° C per la rimozione totale dell'etanolo.
- Aggiungere 30 μL di acqua di PCR e incubare per 5 min a 70 ° C. Eluire per centrifugazione per 1 min a 11.000 x g.
- Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro UV / Vis o un metodo fluorometrico.
- Normalizzare e raggruppare i campioni di DNA dai topi che condividono la stessa gabbia a ea Ch time point.
- Per osservare le variazioni individuali nel tempo, sequenza di campioni di DNA da tre topi casualmente selezionati dal controllo e altre due caselle casuali nei giorni 0, 14 e 28.
6. 16S rRNA Amplificazione e sequenziazione dei geni
- Preparare una biblioteca di geni amplificati 16R rRNA. Amplificare la regione V3-V4 del batterica 16S rRNA 5 usando primer in avanti e con adattatori sbalzo appropriate inverso:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Controllare le bande amplificate usando elettroforesi con 1% agarosio gel.
- Pulire i prodotti della reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando perline magnetiche per la purificazione dell'amplicone.
- Procedere con le seguenti fasi indicate dal costruttore in base alla piattaforma di sequenza massiccia utilizzata> 6.
7. Analisi dei dati e statistiche
- Filtraggio di qualità (di solito eseguito in impianti di sequenziamento).
- Filtra i dati di lettura e de-multiplex utilizzando il software fornito con l'apparecchiatura.
- Procedere alla lettura finale con l'utilizzo della pipeline UPARSE 13 implementata in USERARCH 14 (versione 7.0.1090). Unire le estremità associate e applicare il filtraggio di qualità utilizzando un valore di errore massimo previsto (maxe) di 1,0. Scartare sequenze inferiori a 150 nt. Separare le sequenze per scartare i singoli.
- Bloccare le sequenze in unità tassonomiche operative (OTUs) su una identità di sequenza del 97% e utilizzare UCHIME 15 per filtrare sequenze chimeriche.
- Raccolta OTU, assegnazione tassonomica e ricostruzione filogenetica, analisi e visualizzazioni della diversità.
- Processare le OTU utilizzando Quantitative Intights IntO Ecologia microbica (QIIME) 16 .
- Selezionare e allineare le OTU rappresentative contro il database di set di core Greengenes 17 utilizzando PyNAST 18 con un'identità minima del 75% (impostazione predefinita).
- Assegnare la tassonomia alle sequenze allineate usando il programma di classificazione ROS (Ribosomal Database Project) 19 con una fiducia di 0,8.
- Normalizzare la tabella OTU al numero di sequenza del campione con la profondità di sequenza più bassa.
- Creare un albero filogeno dalle sequenze allineate usando Fast Tree 20 dopo la fase di filtrazione per rimuovere le regioni e le posizioni altamente variabili che sono tutte le lacune. Utilizzare questa struttura per calcolare le diversità alfa e beta e per calcolare le curve di rarefaction e gli indici di Shannon.
- Per generare e visualizzare le metriche di distanza UniFrac non ponderate 21 , utilizzare l'analisi di coordinate di base (PCoA).
NOTA: per sAnalisi tattiche possono essere utilizzati diversi pacchetti software, come R 22 o gli strumenti statistici implementati in QIIME 16 . - Per il confronto degli indici Shannon di diversità tra i diversi trattamenti, utilizzare un ANCOVA, considerando il tempo come una variabile dipendente continua in R.
- Confronta le distanze tra i trattamenti in PCoA in QIIME usando un t-test di due studenti e calcoli i p-valori non parametrici con 1000 permutazioni Monte Carlo usando la correzione Bonferroni.
- Analizzare le correlazioni tra l'abbondanza relativa di OTU specifiche e altri parametri misurati, come i livelli di siero di colesterolo, HDL, LDL, ecc. , Utilizzando l'analisi di correlazione di Pearson. A tal fine, utilizzare CoNet 23 con la successiva visualizzazione delle reti di correlazione utilizzando Cytoscape 3.1.1 24 .
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Representative Results
La produzione di batteriossine è stata considerata una caratteristica probiotica positiva nel LAB, in quanto si suppone che impedisca la crescita di batteri opportunistici e patogeni. Lo scopo di questo lavoro era quello di mostrare la capacità dei batteriosi per modulare le popolazioni di microbiota intestinale in un modello di topo. A tal fine, è stata sviluppata una procedura per confrontare l'effetto dell'inserzione di ceppi produttori di batteriossio e dei loro ceppi non-produttivi isogeni. La procedura per l'inoculazione e l'estensione del tempo del saggio sono mostrati in Figura 1 . I topi sono stati raggruppati in undici gabbie: un controllo senza alcun trattamento, cinque gabbie trattate con ceppi batteriosi-produttori e cinque gabbie trattate con i corrispondenti mutanti isogeni che hanno ridotto o no la produzione di batteriosi. La LAB prodotta da batteriossina, nonché i rispettivi conteggi (cfu / mL) in acqua potabile e conteggi nelle feci, sono riassunti in
Figura 1: Schema che mostra il corso del corso del progettoriment. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento della produzione di bakteriocina in LAB recuperato dalle feci mediante un protocollo a tre strati (come descritto nella procedura). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: confronto della composizione dei trattamenti batterici. Un diagramma PCoA è stato generato in base alle distanze calcolate in una matrice UniFrac non ponderata. Punti di tempo differenti dal medesimo campione ( et al. , 2016 12 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Variazioni nell'abbondanza relativa di gruppi batteri con targeting di baceriocina e LAB al livello genitale durante i periodi di trattamento e post-trattamento. ModificareS nelle relative abbondanze di generi nei trattamenti, ottenuti rispetto al tempo 0, sono stati confrontati con quelli del gruppo di controllo (CON). Per la chiarezza dell'illustrazione, sono mostrati solo quattro ceppi: garvicina e produttore di saccacina e ceppi non produttori (vedere la legenda nella figura per relazionare il colore e il trattamento). Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. Il grado di significatività è rappresentato come segue: P <0,1 con punto (.); P <0,05 con una stella (*); P <0.01 con due stelle (**). Adattato da Umu et al. , 2016 12 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rete di correlazione di abbondanti relative di OTU sul giorno 14 e livelli di siero. Le correlazioni erano caSi è calcolato utilizzando la correlazione di Pearson in CoNet. Solo quelli significativi (P <0.05) vengono visualizzati sulla rete. I parametri determinati nel siero - colesterolo totale ( Chol ), lipoproteina ad alta densità ( HDL ), lipoproteina a bassa densità ( LDL ) e trigliceridi ( Trig - sono indicati da un colore (grigio), mentre le OTU appartenenti a diverse famiglie sono rappresentate da colori differenti (vedere la legenda). le correlazioni positive sono visualizzate con bordi verdi, e correlazioni negative con bordi rossi. OTU sui nodi sono rappresentati con numeri OTU o del genere a cui appartengono. Adattato da Umu et al. 2016 12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Inoculato in acqua potabile | I batteri di acido lattico contano nelle feci | Ceppi di indicatore | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (media log10) | |||
| CONTROLLO | ---- | 10 topi | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 topi | 8.53 ± 0.18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) | 2.0 | 9 topi | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 topi | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 topi | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 topi | 8,83 ± 0,14 | Danni di Pediococcus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 curato -) | 10 | 9 topi | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 topi | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 topi | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 topi | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 topi | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) per SakA e PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) per enterocine, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) per plantaricine e Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) per GarML. | ||||
Tabella 1: ceppi inoculati ei conteggi nei campioni di feci.
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Discussion
La procedura qui descritta è stata utilizzata per determinare se i cambiamenti nel microbiota siano legati alla salute o all'età. Diverse parti del protocollo sono importanti, ma tra loro, il campionamento delle feci, la scelta del frammento di DNA da sequenziare e analizzare, e l'esecuzione dell'estrazione del DNA e dell'analisi bioinformatica potrebbero certamente essere i punti più critici. Il campionamento è cruciale perché, per motivi etici, i topi non devono essere sottolineati e perché è noto cambiare la proporzione di batteri nell'intestino. I campioni devono essere trattati il più presto possibile o devono essere congelati fino all'uso, poiché alcuni batteri sono molto sensibili alla disidratazione e / o all'ossigeno. La selezione del frammento di DNA da sequenziare dai geni rRNA 16S amplificati è un punto cruciale. In questo lavoro, le regioni variabili V3 - V4 sono state selezionate 25 . L'importanza del metodo di estrazione del DNA non deve essere sottovalutata, in quanto le cellule batteriche presenti nei campioni non sono tutte eqSensibilmente sensibili a diversi protocolli di lisi e le biasioni nella stima delle popolazioni batteriche possono risultare da una lisi incompleta. Pertanto è necessaria l'introduzione di un passaggio del bead beater. I ceppi isogenici possono essere costruiti con la rottura genetica o con la curazione del plasmide, anche se nel caso di ceppi, i batteriossinici refrattari alla trasformazione dei cromosomi possono rappresentare un problema. Questa procedura può essere adattata utilizzando diverse tecniche di coltura specifiche, come metodi anaerobi 26 .
La procedura può essere modificata nella maggior parte dei passaggi, a seconda del tipo di variazioni di fattore da studiare. La procedura di inoculazione potrebbe essere abbreviata, ma i cambiamenti nei parametri del siero potrebbero richiedere un certo tempo per svilupparsi. Una possibile limitazione del metodo potrebbe essere lo studio di ceppi batterici (sostanze nutritive o composti) che non sopravvivono per parecchie ore in acqua o che possono bloccare (o precipitare per i composti). Quindi, questo è un fattore che deve al Quindi da considerare.
Fino ad ora l'attività batteriossina è stata generalmente determinata in vitro 27 , 28 , 29 o in colture miste 30 . Questo metodo ha permesso il monitoraggio in vivo delle attività di cinque batteriosi dal microbiota intero-intestinale di topi di laboratorio standard. Potrebbero essere determinate piccole variazioni nelle popolazioni, nonché la loro influenza su altri gruppi batterici o fattori fisiologici, come i parametri del siero 12 . Le batteriossine hanno uno spettro di attività relativamente ridotto, inibendo la crescita di batteri tassonomicamente correlati. Tuttavia, quelli usati in questo dosaggio sono tra i più efficaci, poiché alcuni di essi sono attivi contro Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 e persino alcuni ceppi di Escherichia coli , come nel caso di saccinina AAss = "xref"> 32. Quando inoculato nei topi, i batteriosi che producono LAB non hanno dato origine a notevoli cambiamenti nella composizione globale del microbiota, ma piuttosto ad un numero ridotto di taxa batterici. Tuttavia, l'analisi globale della rete di correlazioni ha rivelato interessanti compatibilità ecologiche e antagonismo tra diversi batteri. Questo metodo potrebbe essere adattato per analizzare l'effetto dei componenti alimentari, dei farmaci o di altri composti, sebbene il risultato atteso possa essere deliberatamente limitato per preservare le condizioni sane.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vogliono ringraziare la SEIL Grant NILS Scienza e sostenibilità mobilità coordinata dei ricercatori (riferimento 017-ABEL-CM-2013). CB e GP-M. Sono stati sostenuti dal contributo AGL2015-70487-P del Ministero spagnolo per l'economia e la competitività. OCOU e DBD sono stati sostenuti da un programma di borse di studio strategiche per la ricerca sulle scienze alimentari dell'Università norvegese delle Scienze della Vita (NMBU) (progetto 1205051025). Ringraziamo anche Inmaculada Noguera per la sua assistenza con la cura e il prelievo degli animali e Jesus Dehesa per il suo aiuto per garantire la disponibilità di materiali di laboratorio nella struttura animale. Apprezziamo anche il professor Lars-Gustav Snipen per il suo consiglio sulle statistiche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
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