Summary
Acredita-se que as bacteriocinas desempenham um papel fundamental na definição da diversidade microbiana em diferentes nichos ecológicos. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para avaliar como as bacteriocinas afetam a composição da microbiota intestinal em um modelo animal.
Abstract
Perguntas muito intrigantes surgem com nosso conhecimento avançado sobre a composição da microbiota intestinal e a relação com a saúde, particularmente em relação aos fatores que contribuem para manter o equilíbrio populacional. No entanto, existem metodologias disponíveis limitadas para avaliar esses fatores. As bactérias são peptídeos antimicrobianos produzidos por muitas bactérias que podem conferir uma vantagem competitiva para aquisição de alimentos e / ou estabelecimento de nicho. Muitas bactérias de ácido láctico probiótico (LAB) têm um grande potencial para promover a saúde humana e animal, evitando o crescimento de agentes patogênicos. Eles também podem ser usados para imuno-modulação, pois produzem bacteriocinas. No entanto, a atividade antagonista das bacteriocinas é normalmente determinada por bioensaios laboratoriais em condições bem definidas, mas simplificadas em excesso, em comparação com o ambiente intestinal complexo em seres humanos e animais, onde bactérias enfrentam influências multifatoriais do hospedeiro e centenas de espécies microbianas sHaring o mesmo nicho. Este trabalho descreve um procedimento completo e eficiente para avaliar o efeito De uma variedade de bacteriocinas com diferentes especificidades alvo em um sistema murino. As alterações na composição de microbiota durante o tratamento com bacteriocina são monitoradas usando seqüência de rADN 16S composicional. Nossa abordagem usa os produtores de bacteriocina e os seus mutantes isogênicos que não produzem bacteriocinas, sendo este o último capaz de distinguir as modificações relacionadas à bacteriocina de modificações não relacionadas à bacteriocina nas microbiota. A extração de DNA fecal e os métodos de seqüência de rADN 16S são consistentes e, juntamente com a bioinformática, constituem um procedimento poderoso para encontrar mudanças fracas nos perfis bacterianos e estabelecer correlações, em termos de concentração de colesterol e triglicerídeos, entre populações bacterianas e marcadores de saúde. Nosso protocolo é genérico e, portanto, pode ser usado para estudar outros compostos ou nutrientes com o potencial de alterar o microfone hospedeiroComposição de robiota, seja ao estudar toxicidade ou efeitos benéficos.
Introduction
As bactérias são péptidos antimicrobianos produzidos por uma ampla gama de espécies bacterianas 1 , 2 . Esses compostos e seus produtores, especialmente LAB, foram explorados e explorados em todo o mundo há décadas por suas aplicações potenciais na preservação e medicina 3 . Várias bacteriocinas são conhecidas por matar agentes patogênicos importantes, incluindo espécies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus e Bacillus . Algumas bacteriocinas até têm a capacidade de modular a resposta imune 4 . Muitas bacteriocinas têm espectros relativamente estreitos, uma propriedade que é muito apreciada em algumas aplicações. Por exemplo, algumas bacteriocinas de espectro estreito podem ser usadas para dirigir a atividade específica contra grupos selecionados de bactérias problemáticas, sem muita perturbação na flora comensal ou benéfica compartilhando o mesmo nicho; Isto é especialmente essencial no ambiente intestinalOnde muitos micróbios benéficos prosperam de forma interativa e dinâmica 5 . As bactérias são também muito atraentes para o uso profilático ou probiótico, pois podem suprimir o crescimento (out) de patógenos, pathobiontes ou bactérias oportunistas que podem desbalancear a homeostase intestinal 6 , 7 .
Em termos de sua natureza e propriedades fisicoquímicas, as bacteriocinas são muito diversas, pois possuem estruturas diferentes, especificidades alvo, modos de ação, etc. A maioria das bacteriocinas foram estudadas com grande detalhe em configurações in vitro , mas muito poucos foram testados em alimentos Matrizes 8 , 9 ou in vivo, tal como num intestino de animal 6 , 10 . As propriedades in vitro podem diferir em grande medida quando avaliadas in vivo devido à complexidade oF o ambiente intestinal e também aos efeitos putativos não intencionais sobre bactérias benéficas. A maioria dos probióticos são LAB. Eles produzem uma série de outros metabólitos, incluindo ácidos graxos de cadeia curta, que são conhecidos por influenciar a fisiologia do hospedeiro, bem como para demonstrar propriedades antimicrobianas em relação a certas bactérias. Portanto, no caso de cepas probióticas que produzem bacteriocinas, é melhor estabelecer ensaios realistas, como animais saudáveis com microbiota normal.
No presente estudo, fornecemos uma estratégia que permite a avaliação do efeito de diferentes cepas produtoras de bacteriocina, cujas bacteriocinas possuem diferentes espectros inibitórios, em camundongos saudáveis. Nossa estratégia inclui a alimentação de camundongos com mutantes isogênicos não bacteriocinais, o que permite a diferenciação dos efeitos mediados pela bacteriocina dos efeitos não-bacteriocinados. Sequencing 16S rDNA permite seguir as mudanças dinâmicas da população bacteriana no intestino. SubsA análise estatística equitativa decide as correlações entre espécies bacterianas e também entre espécies bacterianas e parâmetros fisiológicos medidos ( por exemplo, peso corporal, parâmetros bioquímicos séricos, etc. ). Acreditamos que o protocolo apresentado neste estudo também é aplicável a outras aplicações probióticas ou prebióticas além do estudo de bacteriocinas em animais vivos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O cuidado e o manuseio devem ser realizados em uma unidade especializada de cuidados com animais. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo correspondente Comitê de Ética da Universidade de Valência e autoridades locais, seguindo os princípios de cuidados de animais de laboratório obrigatórios pelo Direito da União Européia e 2010/63 / UE e pelo Governo espanhol RD 53/2013 sobre proteção de animais Usado para fins científicos, a fim de respeitar o princípio 3R na experimentação animal (Replacement, Reduction, Refinement).
1. Culturas bacterianas congeladas usadas para inocular camundongos
- Inocule cepas individuais de LAB em 5 mL de meio de infusão de cérebro-coração (BHI) e cresça-as durante 20 a 24 h (durante a noite) a 30 ° C.
- Diluir cada cultura bacteriana durante a noite 100 vezes em BHI, transferindo 2 mL de cultura durante a noite para 200 mL de BHI. Cresça-os a 30 ° C por 20 a 24 h.
NOTA: As cepas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1. - ColheitaPor centrifugação a 5.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
- Remova o sobrenadante e lave as células duas vezes por suspensão de cada sedimento celular em 100 mL de solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e coletando as células como no passo 1.3.
- Após a segunda lavagem, suspender cada pastilha celular em 20 mL de glicerol 15% gelado em PBS.
- Alíquota a suspensão celular em volumes de 1 mL em tubos e depois guarde-os a -80 ° C até o uso.
NOTA: As células devem ser usadas dentro de 1-2 meses após esse ponto. - Determine o número da célula antes do armazenamento e antes da administração para que o número de células vivas fornecidas aos ratos seja conhecido.
- Para a contagem de células, faça diluições em série de dez vezes em células em solução de cloreto de sódio a 0,9% gelada (NaCl) gelada. Espalhe 100 μL de cada diluição sobre uma placa de ágar BHI. Incubar durante a noite (20 - 24 h) a 30 ° C para crescimento celular e formação de colônias, o último para determinar as unidades formadoras de colônias (cfu) / mL.
- Para produzir água potável contendo bactérias, dilua células de cada cultura de estoque bacteriana em 100 mL de água potável esterilizada e filtrada, com uma UFC média final de 10 9 / mL de água. Para a avaliação da sobrevivência bacteriana, conte as células vivas logo após a diluição e após 24 h uma vez por semana durante as duas primeiras semanas de tratamento de bactérias.
2. Ensaio de ratos e design experimental
Nota: São necessários ratos fêmeas jovens BALB / c livres de patógenos (SPF) (6 a 8 semanas) para esta experiência; Aqui, foram comprados 100 animais.
- Forneça aos camundongos o acesso gratuito a alimentos e água com sedimentação durante todo o experimento.
- Desenhe o experimento e calcule o poder.
- Se cada tratamento tiver o seu próprio controle, aplique um design de caso-controle emparelhado (teste t). Use um ensaio preliminar para calcular o erro médio e padrão do (s) efeito (s) mais importante (s) a ser determinado. Otimize o poder do ensaio e o número de animais necessários por grupo usando diferentes métodos e programas livremente disponíveis 11 .
- Para testar os efeitos do produtor de bacteriocina versus cepas não produtoras, use 9 animais por condição experimental.
NOTA: Este número foi determinado com base no erro padrão experimental e forneceu um poder satisfatório (0.7 - 1.0) e um nível de significância abaixo de 0.05.
NOTA: No exemplo dado, foram feitos 11 grupos de ratos, um por gaiola. Dez gaiolas correspondiam aos tratamentos com 5 cepas produtoras de bateriocinas e as correspondentes 5 cepas isogênicas não produtoras; A 11 ª gaiola tinha 10 ratos e constituía o controle não tratado.
- Após a chegada dos camundongos às instalações de criação, distribuí-los em gaiolas e rotular os animais para permitir rastreamento individual. Aclimatar os camundongos às instalações e condições de criação durante uma semana antes de pSeguindo.
- Prepare a água potável contendo bactérias, conforme descrito no passo 1.8, e coloque garrafas de água potável nas gaiolas independentes correspondentes que são claramente identificadas para que os ratos em cada gaiola compartilhem a mesma garrafa de água.
NOTA: O grupo de controle deve ser mantido em uma gaiola separada, sem contato com as bactérias testadas. - Prepare uma nova garrafa com água potável fresca (100 mL) todos os dias e adicione suspensões bacterianas recém-descongeladas. Faça isso por 15 dias consecutivos.
- Siga o tratamento com bactérias com um período de duas semanas, durante o qual os ratos bebem água sem bactérias ( Figura 1 ).
3. Coletando Amostras
- Coletar amostras fecais.
- Prepare as gaiolas autoclavadas (vazias) e fórceps estéreis e rotulhe os tubos esterilizados de 1,5 mL para cada mouse.
- Coletar amostras na mesma hora do dia para evitar variações na composição de microbiota durante o períodoÉ um curso de um dia. Para resultados ótimos, colete amostras frescas separadamente.
NOTA: De preferência, colete fezes no início da manhã, quando os camundongos tendem a defecar espontaneamente. - Limpe uma gaiola vazia com 70% de álcool e coloque o mouse dentro. Permitir que ele defece, e coletar 2 - 4 pastilhas fecais usando fórceps estéril, colocando-os em tubos de 1,5 mL.
NOTA: Às vezes é suficiente manter a cauda do mouse para cima; As fezes podem então ser coletadas diretamente do ânus em um tubo. - Colecione amostras fecais de cada mouse uma vez por semana durante o experimento de quatro semanas ( Figura 1 ). Colecione as primeiras amostras no primeiro dia (T0, tempo zero), imediatamente antes da exposição dos ratos às bactérias. Colecione as seguintes amostras fecais nos dias 7, 14, 21 e 28.
- Refrigerar as amostras a 4 ° C até o seu transporte para o laboratório, onde são congeladas a -80 ° C. Planeje com antecedência e forneça caixas de armazenamento suficientes, como um grande número de feAs amostras de calor serão coletadas durante o experimento.
- Pesar todos os ratos toda semana no dia da coleta fecal.
- Recolha de amostras de sangue a partir da veia facial de todos os ratinhos no dia 15 ° dia, o último dia da administração de bactérias, e determinar os níveis de triglicéridos, colesterol total, de lipoproteínas de alta densidade (HDL), e a lipoproteína de baixa densidade (LDL) no soro sanguíneo.
NOTA: pessoal experiente deve coletar o sangue para reduzir o estresse nos animais.
4. Atividade de contagem de LAB e Bacteriocin
- Pesar um grânulo fecal de cada amostra em um tubo de 1,5 mL e adicionar um volume adequado de 0,9% de NaCl gelado para se obter uma solução a 10% (p / v). Use micropestéis estéreis para tubos de 1,5 mL para homogeneizar a suspensão fecal e preparar diluições em série de dez vezes em NaCl 0,9% gelada.
- Contar o número total de células LAB.
- Transferir células diluídas (100 μL) para 4 mL de Ma pré-aquecidaN Rogosa Sharpe (MRS) agar macio (50 ° C, 0,8% de ágar). Misture por vortex antes de despejar as células sobre uma placa de agar MRS sólido (1,5% agar).
- Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar as células durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
- Contagem de células produtoras de bacteriocina.
- Transferir as células diluídas (100 μL) do produtor de bacteriocina para 4 mL de agar MRS pré-aquecido (50 ° C, 0,8% de agar), misturar por vortex e despejar as células sobre uma placa de agar MRS (1.5% agar); Esta camada é referida como a primeira camada.
- Transferir mais 4 mL de agar MRS livre de células (agar 0,8%) na primeira camada para incorporar todas as células dentro do agar macio.
NOTA: Esta camada destina-se a evitar que as células cresçam como colônias na superfície das placas de ágar. As células que crescem na superfície são facilmente deslocadas ao despejar células indicadoras na parte superior (passo 4.3.4) ePor conseguinte, complicará a interpretação dos resultados. Esta camada é referida como a segunda camada. - Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
- Para identificar colônias produtoras de bacteriocina, misture 40 μL de uma cultura durante a noite de uma estirpe indicadora apropriada, como mostrado na Tabela 1 , com 4 mL de agar macio pré-aquecido. Despeje a mistura no prato; Esta camada é referida como a terceira camada.
- Secar a placa retirando a tampa durante 5 a 10 min no capô estéril antes de incubar durante 20 a 24 h a 30 ° C para o crescimento celular e a formação de colônias.
NOTA: As colônias produtoras de bactérias têm zonas claras (inibição) em torno das colônias ( Figura 2 ).
5. Extração de DNA, Amplificação de RDNA 16S e Seqüenciamento
NOTA: Passos fOu extração de DNA são descritos para o uso de um kit comercial ( por exemplo, kit Realpure "SSS").
- Suspender 1 a 2 pellets de camundongos fecais (~ 200 mg) em 300 μL de solução de lise.
- Transfira a amostra para um microtubulo de 2 mL, no qual cerca de 0,5 g de pérolas de vidro (diâmetro: 0,1 mm) foram previamente colocadas.
- Adicionar 1 μL de mutanolisina a 10 U / μL e 2 μL de lisozima a 20 mg / mL a cada amostra e incubar a 37 ° C durante 40 a 60 min. Proceda com um dos protocolos padrão para extração de DNA de amostras fecais 12 .
- Aplique dois ciclos de passos do bead-beater, 1 min cada.
- Adicione 2 μL de proteinase K e misture bem.
- Incubar durante 20 min e vortex a cada 5 min.
- Arrefecer as amostras a 37 ° C e adicionar 1 μL de RNase A 5 μg / mL à amostra. Homogeneizar.
- Incubar a 37 ° C durante 30 a 60 min.
- Arrefecer as amostras para a temperatura ambiente e adicionar 180 μLDe solução de precipitação protéica. Vortex vigorosamente à velocidade máxima de 20 a 30 s.
- Centrifugar a 16.000 xg por 5 min. Se houver partículas que flutuam no sobrenadante, incubar as amostras em gelo durante 5 min e depois centrifugar novamente.
- Transfira o sobrenadante contendo o DNA para um novo microtubo de 1,5 mL contendo 300 μL de isopropanol.
- Misture invando os tubos 20-30 vezes e incube durante 1 h a -20 ° C. Alternativamente, incubar os tubos por mais tempo ( por exemplo, durante a noite).
- Centrifugar a 16,000 xg por 2 min.
- Remova o sobrenadante e retire o tubo no papel absorvente. Adicione 300 μL de etanol a 70% para lavar o sedimento de DNA.
- Centrifugar a 16.000 xg durante 1 min, remover o sobrenadante e deixar o sedimento secar por cerca de 15 min.
- Uma vez que o sedimento está seco, adicione 100 μL de água estéril ou tampão Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) e ressuspenda o sedimento.
- Para eliminar qualquer possível inibidorCompostos durante as etapas subseqüentes, limpe o DNA. Misture o DNA extraído com 2 volumes (200 μL) de NTI tampão para ajustar as condições de ligação para o passo 5.15.
- Coloque uma membrana de sílica contendo coluna de limpeza de PCR em um tubo de coleta (2 mL) e carregue a amostra.
- Centrifugação por 30 s a 11,000 x g. Descarte o fluxo contínuo.
- Lave a membrana de sílica com 700 μL de tampão NT3 e repita o passo 5.16.
- Secar a membrana de sílica por centrifugação durante 1 min a 11 000 xg para remover qualquer tampão de lavagem contendo NT3 residual contendo etanol residual.
- Transfira a coluna para um novo microtube de 1,5 mL e incuba durante 2 a 5 min a 70 ° C para a remoção total do etanol.
- Adicione 30 μL de água de grau PCR e incube durante 5 min a 70 ° C. Eluir por centrifugação durante 1 min a 11 000 x g.
- Quantifique o DNA usando um espectrofotômetro UV / Vis ou um método fluorométrico.
- Normalize e junte as amostras de DNA de ratos que compartilham a mesma gaiola em Ponto de tempo ch.
- Para observar as variações individuais durante o tempo, as amostras de DNA da sequência de três ratos selecionados aleatoriamente do controle e duas outras gaiolas aleatórias nos dias 0, 14 e 28.
6. 16S rRNA Gene Amplification and Sequencing
- Prepare uma biblioteca de genes 16S rRNA amplificados. Amplifique a região V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA 5 usando primers direto e reverso com adaptadores de sobreposição apropriados:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Verifique as bandas amplificadas usando eletroforese com 1% de gel de agarose.
- Limpe os produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) usando grânulos magnéticos para purificação do amplicão.
- Proceda com as seguintes etapas, conforme indicado pelo fabricante, de acordo com a plataforma de seqüenciamento maciça usada> 6.
7. Análise e Estatística de Dados
- Filtragem de qualidade (geralmente realizada em instalações de seqüenciamento).
- Filtre os dados de leitura em bruto e de-multiplex usando o software fornecido com o equipamento.
- Processe as leituras de par-fim usando o pipeline UPARSE 13 implementado no USEARCH 14 (versão 7.0.1090). Junte as extremidades emparelhadas e aplique filtragem de qualidade usando o valor máximo de erro esperado (maxee) de 1.0. Eliminar sequências inferiores a 150 nt. Seqüências desreplicadas para descartar singletons.
- Cluster as sequências em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em uma identidade de seqüência de 97% e use UCHIME 15 para filtrar sequências quiméricas.
- Seleção de OTU, atribuição taxonômica e reconstrução filogenética, e análises e visualizações de diversidade.
- Processo das OTUs usando Quantitative Insights IntO Ecologia microbiana (QIIME) 16 .
- Escolha e alinhe as OTUs representativas contra o banco de dados do conjunto de núcleos Greengenes 17 usando PyNAST 18 com uma identidade mínima de 75% (padrão).
- Atribua taxonomia às sequências alinhadas usando o programa classificador do Projeto de Banco de Dados Ribossomal (RDP) 19 com uma confiança de 0,8.
- Normalize a tabela OTU para a contagem de seqüência da amostra com a menor profundidade de seqüência.
- Crie uma árvore filogênica a partir de seqüências alinhadas usando Fast Tree 20 após o passo de filtração para remover regiões e posições altamente variáveis que sejam todas as lacunas. Use esta árvore para calcular as diversidades alfa e beta e para calcular curvas de rarefação e índices de Shannon.
- Para gerar e visualizar métricas de distância UniFrac não ponderadas 21 , use a análise de coordenadas principal (PCoA).
NOTA: para sAnálise tatistical, diferentes pacotes de software podem ser usados, como o R 22 ou as ferramentas estatísticas implementadas dentro do QIIME 16 . - Para a comparação dos índices de Shannon de diversidade entre os diferentes tratamentos, use um ANCOVA, considerando o tempo como variável dependente contínua em R.
- Compare as distâncias entre os tratamentos no PCoA no QIIME usando um teste t de Student de dois lados e calcule os valores p não paramétricos com 1.000 permutações de Monte Carlo usando a correção de Bonferroni.
- Analise as correlações entre a abundância relativa de OTUs específicas e outros parâmetros medidos, como níveis séricos de colesterol, HDL, LDL, etc. , utilizando a análise de correlação de Pearson. Para este fim, use o CoNet 23 com a subsequente visualização de redes de correlação usando o Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A produção de bacteriocinas foi considerada uma característica probiótica positiva no LAB, já que se supunha que ele evita o crescimento de bactérias oportunistas e patógenos. O objetivo deste trabalho foi mostrar a capacidade das bacteriocinas para modular as populações de microbiota intestinal em um modelo de mouse. Para este propósito, foi desenvolvido um procedimento para comparar o efeito da ingestão de cepas produtoras de bacteriocina e suas cepas isogênicas não produtoras. O procedimento para a inoculação e a extensão do tempo do ensaio são mostrados na Figura 1 . Os ratos foram agrupados em onze gaiolas: um controle sem tratamento, cinco gaiolas tratadas com cepas bacteriocinas produtoras e cinco gaiolas tratadas com os correspondentes mutantes isogênicos que reduziram ou não a produção de bacteriocina. O LAB testado com bacteriocina, bem como as respectivas contagens (cfu / mL) na água potável e contagens nas fezes, estão resumidos em
Figura 1: Esquema que mostra o curso Design do curso do ExpeRiment. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Detecção da produção de bacteriocina no LAB recuperado de fezes por um protocolo de três camadas (conforme descrito no procedimento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Comparação da Composição dos Tratamentos de Bactérias. Um gráfico do PCoA foi gerado com base nas distâncias calculadas em uma matriz UniFrac não ponderada. Diferentes pontos de tempo da mesma amostra ( et al. , 2016 12 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mudanças na Abundância Relativa de LAB e Bacteriocin-Grupos Bacterianos Alvo no Nível de Gênero durante os Períodos de Tratamento e Pós-Tratamento. mudançaS nas abundâncias relativas de gêneros em tratamentos, obtidos em relação ao tempo 0, foram comparados aos do grupo controle (CON). Para maior clareza da ilustração, apenas quatro cepas são mostradas: estirpes de produtores de garvicina e sakacina e não produtoras (veja a legenda da figura para relacionar cor e tratamento). Barras de erro representam o desvio padrão. O grau de significância é representado da seguinte forma: P <0,1 com ponto (.); P <0,05 com uma estrela (*); P <0,01 com duas estrelas (**). Adaptado de Umu et al. , 2016 12 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Rede de Correlação de Abundâncias Relativas de OTUs no Dia 14 e Níveis de Soro. As correlações foram caCalculado usando a correlação de Pearson na CoNet. Somente os significantes (P <0,05) são mostrados na rede. Os parâmetros determinados no soro - colesterol total ( Chol ), lipoproteína de alta densidade ( HDL ), lipoproteína de baixa densidade ( LDL ) e triglicerídeos ( Trig - são mostrados por uma cor (cinza), enquanto as OTUs pertencentes a diferentes famílias são representadas por Diferentes cores (veja a legenda). As correlações positivas são exibidas com bordas verdes e correlações negativas com bordas vermelhas. OTUs nos nós são representados com números OTU ou o gênero ao qual pertencem. Adaptado de Umu et al. , 2016 12 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Inoculado na água potável | A bactéria do ácido lático conta nas fezes | Estirpes indicadores | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (log10 médio) | |||
| AO CONTROLE | ---- | 10 ratos | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1.6 | 9 ratos | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA -) | 2.0 | 9 ratos | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 ratos | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 ratos | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 wt +) | 6 | 9 ratos | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 curado -) | 10 | 9 ratos | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 ratos | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 ratos | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 ratos | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 ratos | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) para SakA e PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) para enterocinas, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) para plantaaricinas e Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) para GarML. | ||||
Tabela 1: cepas inoculadas e contagens em amostras de fezes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O procedimento descrito aqui foi usado para determinar se as mudanças na microbiota são vinculadas à saúde ou à idade. Diferentes partes do protocolo são importantes, mas entre elas, amostragem das fezes, a escolha do fragmento de DNA a ser sequenciado e analisado, e a realização da extração de DNA e análises bioinformáticas certamente podem ser os pontos mais críticos. A amostragem é crucial porque, por razões éticas, os camundongos não devem ser estressados e porque é conhecido por mudar a proporção de bactérias no intestino. As amostras devem ser processadas o mais rápido possível ou devem ser congeladas até o uso, uma vez que algumas bactérias são muito sensíveis à desidratação e / ou ao oxigênio. A selecção do fragmento de ADN a ser sequenciado a partir dos genes de rRNA 16S amplificados é um ponto crucial. Neste trabalho, as regiões variáveis V3 - V4 foram selecionadas 25 . A importância do método de extração de DNA não deve ser subestimada, pois as células bacterianas presentes nas amostras não são todas eqEspecialmente sensíveis a diferentes protocolos de lise, e os viés na estimativa das populações bacterianas podem resultar de lise incompleta. Portanto, é necessária a introdução de uma etapa de batimento de talão. As estirpes isogênicas podem ser construídas por eliminação genética ou pela cura de plasmídeos, embora no caso de estirpes, as bacteriocinas codificadas por cromossomas de transformação podem representar um problema. Este procedimento pode ser adaptado usando diferentes técnicas de cultura específicas, como métodos anaeróbicos 26 .
O procedimento pode ser modificado na maioria dos passos, dependendo do tipo de alterações de fator a serem estudadas. O procedimento de inoculação pode ser encurtado, mas mudanças nos parâmetros séricos podem precisar de algum tempo para se desenvolver. Uma possível limitação do método pode ser o estudo de estirpes bacterianas (nutrientes ou compostos) que não podem sobreviver várias horas na água ou que podem aglomerar (ou precipitar para compostos). Por isso, esse é um fator que deve Então seja considerado.
Até agora, a actividade de bacteriocina era geralmente determinada in vitro 27 , 28 , 29 ou em culturas misturadas 30 . Este método permitiu o monitoramento in vivo das atividades de cinco bacteriocinas da microbiota intestinal completa de ratos de laboratório padrão. Pequenas variações nas populações podem ser determinadas, bem como sua influência em outros grupos bacterianos ou fatores fisiológicos, como os parâmetros séricos 12 . As bactérias têm um espectro de atividade relativamente estreito, inibindo o crescimento de bactérias relacionadas com taxonomia. No entanto, aqueles utilizados neste ensaio estão entre os mais eficazes, uma vez que alguns deles são ativos contra Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 e até mesmo algumas cepas de Escherichia coli , como no caso da sakacina AAss = "xref"> 32. Quando inoculado em camundongos, as bactériocinas produtoras de LAB não deram origem a mudanças notáveis na composição global de microbiota, mas sim a um número reduzido de táxons bacterianos. No entanto, a análise da rede de correlação global revelou compatibilidades e antagonismos ecológicos interessantes entre diferentes bactérias. Este método poderia ser adaptado para analisar o efeito de constituintes de alimentos, drogas ou outros compostos, embora o resultado esperado possa ser deliberadamente restrito para preservar condições saudáveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer a Mobilidade Coordenada da Ciência e da Sustentabilidade da NASA NELS Science (Coordenação 017-ABEL-CM-2013). CB e GP-M. Foram apoiados pela concessão AGL2015-70487-P do Ministério espanhol da Economia e Competitividade. OCOU e DBD foram apoiados por um programa de bolsas estratégicas para pesquisas em ciência da alimentação da Universidade de Ciências da Vida (NMBU) (projeto 1205051025). Também gostaríamos de agradecer a Inmaculada Noguera por sua assistência com cuidados com animais e amostragem e Jesus Dehesa por sua ajuda para garantir a disponibilidade de materiais de laboratório nas instalações de animais. Também apreciamos o professor Lars-Gustav Snipen pelo seu conselho sobre estatísticas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
