Summary
Bakteriociner antas spela en nyckelroll för att definiera mikrobiell mångfald i olika ekologiska nischer. Här beskriver vi ett effektivt förfarande för att bedöma hur bakteriociner påverkar tarmmikrobiotasammansättningen i en djurmodell.
Abstract
Mycket spännande frågor uppstår med vår framväxande kunskap om gutmikrobiotasammansättning och förhållandet till hälsa, särskilt vad gäller de faktorer som bidrar till att bibehålla befolkningsbalansen. Det finns dock begränsade tillgängliga metoder för att utvärdera dessa faktorer. Bakteriociner är antimikrobiella peptider som produceras av många bakterier som kan ge en konkurrensfördel för matförvärv och / eller nischinrättning. Många probiotiska mjölksyrabakterier (LAB) -stammar har stor potential för att främja människors och djurs hälsa genom att förhindra tillväxten av patogener. De kan också användas för immunmodulering, eftersom de producerar bakteriociner. Den antagonistiska aktiviteten hos bakteriociner bestäms emellertid normalt av laboratorie bioassays under väldefinierade men överförenkladda betingelser jämfört med den komplexa tarmmiljön hos människor och djur, där bakterier står inför multifaktoriella influenser från värden och hundratals mikrobiella arter sHar samma nisch. I detta arbete beskrivs ett komplett och effektivt förfarande för att utvärdera effekten Av en mängd olika bakteriociner med olika målspecificiteter i ett murinsystem. Förändringar i mikrobiotasammansättningen under bakteriocinbehandlingen övervakas med användning av kompositionell 16S-rDNA-sekvensering. Vårt tillvägagångssätt använder både bakteriocinproducenterna och deras isogena icke-bakteriocinproducerande mutanter, vilka senare ger möjlighet att skilja bakteriocinrelaterade från icke-bakteriocinrelaterade modifieringar av mikrobiotan. Fekal DNA-extraktion och 16S rDNA-sekvenseringsmetoder är konsekventa och tillsammans med bioinformatiken utgör ett kraftfullt förfarande för att finna svaga förändringar i bakterieprofilerna och för att fastställa korrelationer i termer av kolesterol och triglyceridkoncentration mellan bakteriepopulationer och hälsomarkörer. Vårt protokoll är generiskt och kan därför användas för att studera andra föreningar eller näringsämnen med potential att ändra värdmikrofonenRobiota-kompositionen, antingen vid studier av toxicitet eller fördelaktiga effekter.
Introduction
Bakteriociner är antimikrobiella peptider framställda av ett brett spektrum av bakteriearter 1 , 2 . Dessa föreningar och deras producenter, särskilt LAB, har utforskats och utnyttjats över hela världen i årtionden för deras potentiella tillämpningar i livsmedelsförvaring och medicin 3 . Flera bakteriociner är kända att döda viktiga patogener, inklusive arter av Listeria, Enterococcus, Staphylococcus och Bacillus . Vissa bakteriociner har även förmågan att modulera immunsvaret 4 . Många bakteriociner har relativt snäva spektra, en egenskap som är mycket uppskattad i vissa applikationer. Till exempel kan vissa smala spektrum bakteriociner användas för att rikta specifik aktivitet mot utvalda grupper av problematiska bakterier utan stor störning på kommensal eller fördelaktig flora som delar samma nisch. Detta är särskilt viktigt i tarmkanalenOnment, där många positiva mikrober trivs på ett interaktivt och dynamiskt sätt 5 . Bakteriociner är också mycket attraktiva för profylaktisk eller probiotisk användning, eftersom de kan undertrycka (ut) tillväxten av patogener, patobioner eller opportunistiska bakterier som kan obalansera tarmhemostasen 6 , 7 .
Med avseende på deras natur och fysikalisk-kemiska egenskaper är bakteriociner mycket olika, eftersom de har olika strukturer, målspecificiteter, verkningsmetoder etc. De flesta bakteriociner har studerats i stor detalj i in vitro- inställningar, men väldigt få har testats i mat Matriser 8 , 9 eller in vivo, såsom i ett djurkärl 6 , 10 . In vitro- egenskaperna kan i stor utsträckning skilja sig in vivo på grund av komplexiteten oF tarmmiljön och även på förmodade oavsiktliga effekter på fördelaktiga bakterier. De flesta probiotika är LAB. De producerar en rad andra metaboliter, inklusive kortkedjiga fettsyror, vilka är kända för att påverka värdens fysiologi, liksom att visa antimikrobiella egenskaper mot vissa bakterier. Därför är det bäst att fastställa realistiska analyser, såsom friska djur med normal mikrobiota, när det gäller probiotiska stammar som producerar bakteriociner.
I den föreliggande studien tillhandahåller vi en strategi som möjliggör bedömning av effekten av olika bakteriocinproducerande stammar, vars bakteriociner har olika hämmande spektra på friska möss. Vår strategi innefattar att mata möss med isogena icke-bakteriocinmutanter, vilket möjliggör differentiering av bakteriocinmedierade effekter från icke-bakteriocinmedierade effekter. Sekvensering 16S rDNA möjliggör att följa de dynamiska förändringarna av bakteriepopulationen i tarmen. SubsEkvivalent statistisk analys avkänner korrelationer mellan bakteriearter och även mellan bakteriearter och uppmätta fysiologiska parametrar ( t.ex. kroppsvikt, serumbiokemiska parametrar etc. ). Vi anser att protokollet som presenteras i denna studie också är tillämpligt på andra probiotiska eller prebiotiska tillämpningar bortom studier av bakteriociner hos levande djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skötsel och hantering måste utföras hos en specialiserad djurvårdsenhet. Förfarandena som beskrivs här godkändes av motsvarande etiska kommitté vid universitetet i Valencia och lokala myndigheter, enligt principerna för laboratoriedjurvård obligatorisk enligt EU-rätten och 2010/63 / EU och den spanska regeringen RD 53/2013 om skydd av djur Används för vetenskapliga ändamål för att respektera 3R-principen i djurförsök (ersättning, reduktion, förfining).
1. Frosna bakteriekulturer användes för att inokulera möss
- Inokulera individuella stammar av LAB i 5 ml hjärthjärta infusion (BHI) medium och odla dem i 20-24 timmar (över natten) vid 30 ° C.
- Späd varje bakteriekultur över natten 100 gånger i BHI genom att överföra 2 ml över natten odling till 200 ml BHI. Växa dem vid 30 ° C i 20-24 h.
OBS: Stammar som används i denna studie finns listade i Tabell 1. - Harvest ceLls genom centrifugering vid 5000 xg under 20 min vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellerna två gånger genom att suspendera varje cellpellett i 100 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och samla cellerna som i steg 1.3.
- Efter den andra tvätten, suspendera varje cellpellett i 20 ml iskall 15% glycerol i PBS.
- Aliquot cell suspensionen i 1 ml volymer i rör och sedan lagra dem vid -80 ° C tills användning.
OBS! Cellerna ska användas inom 1-2 månader efter denna punkt. - Bestäm cellnumret före lagring och före administrering så att antalet levande celler som ges till möss är känt.
- För cellräkning gör du tiofaldiga serieutspädningar av celler i iskall 0,9% natriumkloridlösning (NaCl). Sprid 100 μl av varje utspädning på en BHI-agarplatta. Inkubera över natten (20-24 h) vid 30 ° C för celltillväxt och kolonibildning, den senare för att bestämma kolonnbildande enheter (cfu) / ml.
- För att göra bakterieinnehållande dricksvatten, späd celler av varje bakteriel stamkultur i 100 ml sterilt filtrerat dricksvatten med en slutlig genomsnittlig cfu på 10 9 / ml vatten. För bedömning av bakteriell överlevnad, räkna levande celler strax efter utspädning och efter 24 h en gång i veckan under de första två veckorna av bakteriebehandling.
2. Mössanalys och experimentell design
Obs! Specifika patogenfria (SPF) BALB / c unga kvinnliga möss (6-8 veckor) behövs för detta experiment; Här köptes totalt 100 djur.
- Ge mössen fri tillgång till pelleterad mat och vatten genom experimentet.
- Utforma experimentet och beräkna effekten.
- Om varje behandling har sin egen kontroll, applicera en parad case-control design (t-test). Använd en preliminär analys för att beräkna medel- och standardfelet för den viktigaste effekten som ska bestämmas. Optimera effekten av analysen och antalet djur som behövs per grupp med olika metoder och tillgängliga program 11 .
- För att testa för effekterna av bakteriocinproducenten jämfört med icke-producentstammar, använd 9 djur per experimentellt tillstånd.
OBS: Detta nummer bestämdes baserat på experimentell standardfel och gav en tillfredsställande effekt (0,7-1,0) och en signifikansnivå under 0,05.
OBS: I det givna exemplet gjordes 11 grupper av möss, en per bur. Tio burar motsvarade behandlingarna med 5 bateriocinproducerande stammar och motsvarande 5 isogena icke-producerande stammar; Den 11: e buret hade 10 möss och utgjorde den obehandlade kontrollen.
- Efter ankomsten av mössen till uppfödningsanläggningarna, fördela dem i burar och öronmärkta djuren för att möjliggöra individuell spårning. Acclimatize mössen till uppfödningsanläggningar och villkor för en vecka före sroceeding.
- Förbered bakteriehaltigt dricksvatten, som beskrivs i steg 1.8, och placera dricksvattenflaskor i motsvarande oberoende burar som tydligt identifieras så att mössen i varje bur delar samma vattenflaska.
OBS: Kontrollgruppen måste förvaras i en separat bur, utan kontakt med de testade bakterierna. - Förbered en ny flaska med färskt dricksvatten (100 ml) varje dag och tillsätt nyfrostade bakteriella suspensioner. Gör detta i 15 dagar i följd.
- Följ bakteriebehandlingen med en period på två veckor, under vilken tid möss dricker bakteriefri vatten ( Figur 1 ).
3. Samla in prover
- Samla fekalprover.
- Förbered autoklaverade burar (tomma) och sterila tångar och märka sterila 1,5 ml rör för varje mus.
- Samla prov på samma tid på dagen för att undvika variationer i mikrobiota sammansättning under thEn kurs på en dag. För bästa resultat, samla in färska prover separat.
ANMÄRKNING: Samla feces helst tidigt på morgonen, när möss tenderar att defekera spontant. - Rengör en tom bur med 70% alkohol och placera en mus inuti. Låt det defekera och samla 2-4 fekala pellets med hjälp av sterila tångar, placera dem i 1,5 ml rör.
OBS! Ibland räcker det att hålla musens svans uppåt; Avföringen kan sedan direkt samlas in från anuset till ett rör. - Samla fekalprover från varje mus en gång i veckan under fyra veckors experimentet ( Figur 1 ). Samla de första proven på dag ett (T0, tid noll), strax innan musen exponeras för bakterier. Samla följande fekalprover på dagarna 7, 14, 21 och 28.
- Kyl proverna vid 4 ° C tills de transporteras till laboratoriet, där de fryses vid -80 ° C. Planera i förväg och ge tillräckligt med förvaringslåda, som ett stort antal feKalprover samlas under experimentet.
- Väg alla möss varje vecka på fecal insamlingsdag.
- Samla blodprover från ansiktsvenen från alla möss på 15: e dagen, sista dagen för bakterieadministration och bestäm nivåerna av triglycerider, totalt kolesterol, högdensitetslipoprotein (HDL) och lågdensitetslipoprotein (LDL) i Blodserum.
OBS! Erfaren personal ska samla in blodet för att minska stressen i djuren.
4. LAB-räkning och bakteriocinaktivitet
- Väg en fekal pellet av varje prov i ett 1,5 ml rör och tillsätt en tillräcklig volym iskall 0,9% NaCl för att uppnå en 10% (vikt / volym) lösning. Använd sterila mikropestlar för 1,5 ml rör för att homogenisera fecalsuspensionen och förbereda tiofaldiga serieutspädningar i iskall 0,9% NaCl.
- Räkna det totala antalet LAB-celler.
- Överför utspädda celler (100 μl) till 4 ml förvärmd MaN Rogosa Sharpe (MRS) mjuk agar (50 ° C, 0,8% agar). Blanda genom virvelbildning innan man häller cellerna på en fast MRS agarplatta (1,5% agar).
- Torka tallriken genom att ta locket av i 5-10 minuter i den sterila huven innan inkubation av cellerna i 20-24 h vid 30 ° C för celltillväxt och kolonibildning.
- Räkna bakteriocinproducerande celler.
- Överför utspädda celler (100 μl) av bakteriocinproducenten till 4 ml förvärmd MRS mjukagar (50 ° C, 0,8% agar), blanda genom virvelbildning och häll cellerna på en MRS agarplatta (1,5% agar); Detta skikt kallas det första skiktet.
- Överför ytterligare 4 ml cellfri MRS mjuk agar (0,8% agar) på det första skiktet för att bädda in alla celler i den mjuka agar.
OBS! Detta skikt är avsett att förhindra att celler växer som kolonier på agarplattans yta. Celler som växer på ytan förflyttas lätt vid hällning av indikatorceller på toppen (steg 4.3.4) ochKommer därför att komplicera tolkningen av resultaten. Detta skikt kallas det andra skiktet. - Torka tallriken genom att ta locket av i 5-10 min i den sterila kåpan innan den inkuberas i 20-24 h vid 30 ° C för celltillväxt och kolonibildning.
- För att identifiera bakteriocinproducerande kolonier blanda 40 mikroliter av en övernattningskultur med en lämplig indikatorstam, såsom visas i Tabell 1 , med 4 ml föruppvärmd mjukagar. Häll blandningen på plattan; Detta skikt kallas det tredje skiktet.
- Torka tallriken genom att ta locket av i 5-10 min i den sterila kåpan innan den inkuberas i 20-24 h vid 30 ° C för celltillväxt och kolonibildning.
OBS: Bakteriocinproducerande kolonier har tydliga (inhibition) zoner runt kolonierna ( Figur 2 ).
5. DNA-extraktion, 16S-rDNA-amplifiering och sekventering
OBS: Steg fEller DNA-extraktion beskrivs för användning av ett kommersiellt kit ( t.ex. Realpure "SSS" Kit).
- Suspendera 1 - 2 fekala mösspellets (~ 200 mg) i 300 | il lysislösning.
- Överför provet till en 2 ml mikrotub, i vilken cirka 0,5 g glaspärlor (diameter: 0,1 mm) tidigare har placerats.
- Tillsätt 1 μl mutanolysin vid 10 U / μl och 2 μl lysozym vid 20 mg / ml till varje prov och inkubera vid 37 ° C under 40-60 min. Fortsätt med ett av standardprotokollen för DNA-extraktion från fekala prover 12 .
- Applicera två cykler av pärlbeatersteg, 1 min vardera.
- Tillsätt 2 μl proteinas K och blanda noggrant.
- Inkubera i 20 min och virvel varje 5 min.
- Kyl proverna till 37 ° C och tillsätt 1 μL 5 μg / ml RNas A till provet. Blanda noggrant.
- Inkubera vid 37 ° C under 30-60 minuter.
- Kyl proverna till rumstemperatur och tillsätt 180 μLAv proteinutfällningslösning. Vortex kraftigt med maximal hastighet i 20 - 30 s.
- Centrifugera vid 16 000 xg under 5 min. Om det finns några partiklar som flyter i supernatanten, inkubera proven i is under 5 minuter och centrifugera sedan igen.
- Överför supernatanten innehållande DNA till en ny 1,5 ml mikrotub innehållande 300 | il isopropanol.
- Blanda genom att invertera rören 20-30 gånger och inkubera i 1 h vid -20 ° C. Alternativt, inkubera rören under längre tid ( t.ex. över natten).
- Centrifugera vid 16 000 xg under 2 min.
- Ta bort supernatanten och torka röret på absorberande papper. Tillsätt 300 μl 70% etanol för att tvätta DNA-pelleten.
- Centrifugera vid 16 000 xg under 1 min, avlägsna supernatanten och låt pelleten torka i ca 15 min.
- När pelleten är torr, tillsätt 100 μL sterilt vatten eller Tris (10 mM) / EDTA (1 mM) buffert och resuspendera pelleten.
- För att eliminera eventuella hämmandeFöreningar under efterföljande steg, rengör DNA. Blanda extraherat DNA med 2 volymer (200 μl) buffert NTI för att justera bindningsförhållandena för steg 5.15.
- Placera en silikamembranhaltig PCR-rengöringskolonn i ett uppsamlingsrör (2 ml) och ladda provet.
- Centrifugera i 30 s vid 11 000 x g. Kasta bort flödet.
- Tvätta silikamembranet med 700 pl buffert NT3 och upprepa steg 5.16.
- Torka silikamembranet genom centrifugering i 1 min vid 11 000 xg för att avlägsna eventuell kvarvarande etanolhaltig tvättbuffert NT3.
- Överför kolonnen till en ny 1,5 ml mikrotub och inkubera i 2 - 5 min vid 70 ° C för total avlägsnande av etanolen.
- Tillsätt 30 μl vatten av PCR-kvalitet och inkubera i 5 minuter vid 70 ° C. Avlägsnas genom centrifugering i 1 min vid 11 000 x g.
- Kvantifiera DNA med användning av en UV / Vis-spektrofotometer eller en fluorometrisk metod.
- Normalisera och poola DNA-proverna från möss som delar samma bur på ea Ch tidpunkt.
- För att observera individuella variationer under tiden, sekvens DNA-prover från tre slumpmässigt valda möss från kontrollen och två andra slumpmässiga burar på dagarna 0, 14 och 28.
6. 16S rRNA-genförstärkning och sekventering
- Förbered ett bibliotek med amplifierade 16S rRNA-gener. Förstärka V3-V4-regionen hos den bakteriella 16S-rRNA-genen 5 med användning av fram- och bakre primers med lämpliga överhängsadaptrar:
5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3 '
5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3 ' - Kontrollera de amplifierade banden genom att använda elektrofores med 1% agarosgel.
- Rengör polymeras kedjereaktionsprodukter (PCR) med magnetiska pärlor för ampliconrening.
- Fortsätt med följande steg som anges av tillverkaren enligt den använda massiva sekvenseringsplattformen> 6.
7. Dataanalys och statistik
- Kvalitetsfiltrering (vanligtvis utförd vid sekvenseringsanläggningar).
- Filtrera den råa läser data och de-multiplex med hjälp av programvaran som medföljer utrustningen.
- Bearbeta den parade-slutet läser med UPARSE-pipelinen 13 implementerad i USEARCH 14 (version 7.0.1090). Slå samman de parade ändarna och använd kvalitetsfiltrering med ett maximalt förväntat fel (maxee) -värde på 1,0. Kassera sekvenser mindre än 150 nt. Dereplicera sekvenser för att kassera singletoner.
- Kluster sekvenserna i operativa taxonomiska enheter (OTU) på en 97% sekvensidentitet och använd UCHIME 15 för att filtrera chimära sekvenser.
- OTU-plockning, taxonomisk uppgift och fylogenetisk rekonstruktion, samt mångfaldsanalyser och visualiseringar.
- Behandla OTUs med hjälp av Quantitative Insights IntO Mikrobiell ekologi (QIIME) 16 .
- Välj och anpassa de representativa OTU-enheterna mot Greensens kärnuppsättningsdatabas 17 med PyNAST 18 med en minsta identitet på 75% (standard).
- Tilldela taxonomi till de inriktade sekvenserna med hjälp av Ribosomal Database Project (RDP) klassificeringsprogrammet 19 med ett förtroende på 0,8.
- Normalisera OTU-tabellen till sekvensräkningen av provet med det lägsta sekvensdjupet.
- Bygg ett filogen träd från inriktade sekvenser med hjälp av Fast Tree 20 efter filtreringssteget för att avlägsna högvarliga regioner och positioner som är alla luckor. Använd det här trädet för att beräkna alfa- och beta-diversiteter och för att beräkna rarefactionskurvor och Shannonindex.
- För att generera och visualisera ovägda UniFrac-distansmätningar 21 , använd principkoordinatanalysen (PCoA).
OBS: För sTatistisk analys kan olika mjukvarupaket användas, såsom R 22 eller de statistiska verktyg som implementeras inom QIIME 16 . - För jämförelse av Shannon-index för mångfald mellan de olika behandlingarna, använd en ANCOVA, med tanke på tiden som en kontinuerlig beroende variabel i R.
- Jämför avstånden mellan behandlingar i PCoA i QIIME med hjälp av ett tvåsidigt Students t-test och beräkna de icke-parametriska p-värdena med 1000 Monte Carlo-permutationer med Bonferroni-korrigeringen.
- Analysera korrelationer mellan den relativa överflödigheten av specifika OTU och andra uppmätta parametrar, såsom serumnivåer av kolesterol, HDL, LDL etc. med användning av Pearson korrelationsanalys. Använd därför CoNet 23 med efterföljande visualisering av korrelationsnät med Cytoscape 3.1.1 24 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktionen av bakteriociner har ansetts vara en positiv probiotisk egenskap hos LAB, eftersom det antogs hindra tillväxten av opportunistiska bakterier och patogener. Syftet med detta arbete var att visa bakteriocins förmåga att modulera tarmmikrobiotapopulationer i en musmodell. För detta ändamål utvecklades ett förfarande för att jämföra effekten av intaget av bakteriocinproducerande stammar och deras isogena icke-producerande stammar. Förfarandet för inokuleringen och tidsförlängningen av analysen visas i figur 1 . Mössen grupperas i elva burar: en kontroll utan behandling, fem burar behandlade med bakteriocinproducentstammar och fem burar behandlade med motsvarande isogena mutanter som har minskad eller ingen bakteriocinproduktion. Den testade bakteriocinproducerande LAB, liksom de respektive räkningarna (cfu / ml) i dricksvatten och räknas i avföring, sammanfattas i
Figur 1: Schema Visar tidskursdesignen av experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Detektion av bakteriocinproduktion i LAB återställd från avföring genom ett treskiktsprotokoll (som beskrivs i proceduren). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av sammansättningen av bakteriebehandlingar. En PCoA-plot genererades baserat på de beräknade avstånden i en obegod UniFrac-matris. Olika tidpunkter från samma prov ( et al. , 2016 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Förändringar i den relativa överflödigheten av LAB och bakterieocin-riktade bakteriegrupper på genusnivå under behandlings- och efterbehandlingsperioderna. BytaS i relativa överflöd av genera i behandlingar, erhållna med avseende på tid O, jämfördes med de i kontrollgruppen (CON). För tydligheten i illustrationen visas endast fyra stammar: garvicin- och sakacinproducent och icke-producentstammar (se legenden i figuren för att relatera färg och behandling). Felstänger representerar standardavvikelsen. Signifikansgraden representeras enligt följande: P <0,1 med punkt (.); P <0,05 med en stjärna (*); P <0,01 med två stjärnor (**). Anpassad från Umu et al. , 2016 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Korrelationsnätverk med relativa överflöd av OTU på dag 14 och serumnivåer. Korrelationerna var caLculated med hjälp av Pearsons korrelation i CoNet. Endast de signifikanta (P <0,05) visas på nätverket. Parametrar bestämda i serum - total kolesterol ( Chol ), högdensitetslipoprotein ( HDL ), lågdensitetslipoprotein ( LDL ) och triglycerider ( Trig - visas med en färg (grå), medan OTU som hör till olika familjer representeras av Olika färger (se legenden). Positiva korrelationer visas med gröna kanter och negativa korrelationer med röda kanter. OTU på noderna representeras med OTU-nummer eller släktet som de tillhör. Anpassad från Umu et al. , 2016 12 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Inokulerat i dricksvatten | Mjölksyrabakterierna räknas i avföring | Indikatorstammar | | |
| CFU / ml (log10) | CFU / g (medellog10) | |||
| KONTROLLERA | ---- | 10 möss | ND | |
| Lactobacillus sakei B1500 (sakA +) | 1,6 | 9 möss | 8,53 ± 0,18 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| Lactobacillus sakei B1501 (sakA-) | 2,0 | 9 möss | 8,22 ± 0,05 | |
| Pediocccus acidilactici B1502 (ped +) | 26 | 9 möss | 8,73 ± 0,12 | Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) |
| PediocccuS acidilactici B1503 (ped -) | 25 | 9 möss | 8,75 ± 0,09 | |
| Enterococcus faecium B1504 (L50 vikt +) | 6 | 9 möss | 8,83 ± 0,14 | Pediococcus damnosus (LMG 3397) |
| Enterococcus faecium B1505 (L50 härdad) | 10 | 9 möss | 8,72 ± 0,14 | |
| Lactobacillus plantarum B1507 (planta +) | 26 | 9 möss | 9,14 ± 0,14 | Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) |
| Lactobacillus plantarum B1508 (planta -) | 23 | 9 möss | 8,60 ± 0,18 | |
| Lactococcus garviae B1515 (GarML +) | 17 | 9 möss | 8,41 ± 0,08 | Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) |
| Lactococcus garviae B1516 (GarML -) | 17 | 9 möss | 8,05 ± 0,18 | |
| Enterococcus faecium P21 (LMG 2783) för SakA och PedPA-1, Pediococcus damnosus (LMG 3397) för enterociner, Lactobacillus spp. 965 (LMG 2003) för plantariciner och Lactococcus lactis IL1403 (LMG2705) för GarML. | ||||
Tabell 1: Inokulerade stammar och räkningarna i fekala prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förfarandet som beskrivs här har använts för att bestämma huruvida förändringar i mikrobioten är bundna till hälsa eller ålder. Olika delar av protokollet är viktiga, men bland dem kan provtagning av avföring, val av DNA-fragmentet som sekvenseras och analyseras och utföra DNA-extraktion och bioinformatisk analys säkert vara de mest kritiska punkterna. Provtagning är avgörande för att man av etiska skäl inte bör stressas och att det är känt att ändra andelen bakterier i tarmen. Proverna måste behandlas snarast möjligt eller frysas tills användning, eftersom vissa bakterier är mycket känsliga för uttorkning och / eller syre. Valet av DNA-fragmentet som ska sekvenseras från de amplifierade 16S-rRNA-generna är en avgörande punkt. I detta arbete valdes de variabla regionerna V3 - V4 25 . Betydelsen av DNA-extraktionsmetoden får inte underskattas, eftersom bakterieceller närvarande i proverna inte är alla ekvOalt känsliga för olika lysisprotokoll, och biaser vid uppskattningen av bakteriepopulationerna kan härledas från ofullständig lysis. Därför krävs införandet av ett pärlbeatersteg. Isogena stammar kan konstrueras genom genetisk knockdown eller genom plasmidkurering, även om det i fallet med stammar kan eldkromosomkodade bakteriociner, som är brännbara mot transformation, representera ett problem. Denna procedur kan anpassas med användning av olika specifika odlingstekniker, såsom anaeroba metoder 26 .
Förfarandet kan modifieras i de flesta steg, beroende på typen av faktorändringar som ska studeras. Inokulationsförfarandet kan förkortas, men förändringar i serumparametrar kan behöva lite tid att utvecklas. En eventuell begränsning av metoden kan vara studien av bakteriestammar (näringsämnen eller föreningar) som inte kan överleva flera timmar i vatten eller som kan klumpa (eller fälla ut för föreningar). Därför är detta en faktor som måste al Så övervägas.
Hittills bestämdes bakteriocinaktivitet i allmänhet in vitro 27 , 28 , 29 eller i blandade kulturer 30 . Denna metod har tillåtit för in vivo övervakning av verksamheten hos fem bakteriociner från hela gutmikrobioten hos standard laboratoriemus. Små variationer i populationer kan bestämmas, liksom deras inflytande på andra bakteriegrupper eller fysiologiska faktorer, såsom serumparametrar 12 . Bakteriociner har ett relativt smalt aktivitetsspektrum som hämmar tillväxten av taxonomiskt besläktade bakterier. De som används i denna analys är emellertid bland de mest effektiva, eftersom vissa av dem är aktiva mot Staphylococcus aureus , Listeria monocytogenes 31 , och även några stammar av Escherichia coli , som i fallet med sakacin ARöv = "xref"> 32. När man inokulerade i möss gav LAB-producerande bakteriociner inte upphov till anmärkningsvärda förändringar i den globala mikrobiota-kompositionen utan snarare till ett minskat antal bakteriella taxa. Den globala korrelationsnätanalysen avslöjade emellertid intressanta ekologiska kompatibiliteter och motstånd mellan olika bakterier. Denna metod kan anpassas för att analysera effekten av livsmedelskomponenter, droger eller andra föreningar, även om det förväntade resultatet kan avsiktligt begränsas för att bevara friska tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka EEA Grant NILS Scientific and Sustainable Coordinated Mobility of Researchers (referens 017-ABEL-CM-2013). CB och GP-M. Stöddes av AGL2015-70487-P bidrag från spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft. OCOU och DBD stöddes av ett strategiskt stipendiumsprogram för livsmedelsforskning från Norska Universitetet för Livsvetenskaper (NMBU) (projekt 1205051025). Vi vill också tacka Inmaculada Noguera för hennes hjälp med djurvård och provtagning och Jesus Dehesa för hans hjälp med att säkerställa tillgången på laboratoriematerial i djuranläggningen. Vi uppskattar också professor Lars-Gustav Snipen för hans råd om statistik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 - 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x TAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 mL tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
References
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54, Academic Press. 129-146 (2004).
- Dzung, B. D., Ingolf, F. N. Ribosomally Synthesized Antibacterial Peptides in Gram Positive Bacteria. Curr Drug Targets. 3 (2), 107-122 (2002).
- Dobson, A., Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocin Production: a Probiotic Trait? Appl Environ Microb. 78 (1), 1-6 (2012).
- Li, D., Wang, P., Wang, P., Hu, X., Chen, F. The gut microbiota: A treasure for human health. Biotechnol Adv. 34 (7), 1210-1224 (2016).
- Millette, M., et al. Capacity of Human Nisin- and Pediocin-Producing Lactic Acid Bacteria To Reduce Intestinal Colonization by Vancomycin-Resistant Enterococci. Appl Environ Microb. 74 (7), 1997-2003 (2008).
- Cotter, P. D., Ross, R. P., Hill, C. Bacteriocins [mdash] a viable alternative to antibiotics? Nat Rev Microb. 11 (2), 95-105 (2013).
- Leroy, F., Foulquié Moreno, M. R., De Vuyst, L. Enterococcus faecium RZS C5, an interesting bacteriocin producer to be used as a co-culture in food fermentation. Int J Food Microb. 88 (2-3), 235-240 (2003).
- Ananou, S., et al. Combined effect of enterocin AS-48 and high hydrostatic pressure to control food-borne pathogens inoculated in low acid fermented sausages. Meat Sci. 84 (4), 594-600 (2010).
- Riboulet-Bisson, E., et al. Effect of Lactobacillus salivarius Bacteriocin Abp118 on the Mouse and Pig Intestinal Microbiota. PLoS One. 7 (2), e31113 (2012).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies? J Pharmacol Pharmacother. 4 (4), 303-306 (2013).
- Umu, ÖC. O., et al. The Potential of Class II Bacteriocins to Modify Gut Microbiota to Improve Host Health. PLoS One. 11 (10), e0164036 (2016).
- Edgar, R. C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Meth. 10 (10), 996-998 (2013).
- Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).
- Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2200 (2011).
- Caporaso, J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Meth. 7 (5), 335-336 (2010).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl Environ Microb. 72 (7), 5069-5072 (2006).
- Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26 (2), 266-267 (2010).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naive Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl Environ Microb. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2 - Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments. PLoS One. 5 (3), e9490 (2010).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: a New Phylogenetic Method for Comparing Microbial Communities. Appl Environ Microb. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- R Core Team. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2014).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PLoS Comput Biol. 8 (7), e1002606 (2012).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: A Software Environment for Integrated Models of Biomolecular Interaction Networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), e1 (2013).
- Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J Vis Exp. (79), e50787 (2013).
- Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R. J., Hugenholtz, J. Applications of the bacteriocin, nisin. Antonie Van Leeuwenhoek. 69 (2), 193-202 (1996).
- Allende, A., et al. Growth and bacteriocin production by lactic acid bacteria in vegetable broth and their effectiveness at reducing Listeria monocytogenes in vitro and in fresh-cut lettuce. Food Microb. 24 (7-8), 759-766 (2007).
- Strompfová, V., Lauková, A. In vitro study on bacteriocin production of Enterococci associated with chickens. Anaerobe. 13 (5-6), 228-237 (2007).
- Caballero-Guerrero, B., Jiménez Díaz, R., Maldonado-Barragán, A., Ruiz-Barba, J. L. Coculture with specific bacteria enhances survival of Lactobacillus plantarum NC8, an autoinducer-regulated bacteriocin producer, in olive fermentations. Food Microb. 27 (3), 413-417 (2010).
- Drider, D., Fimland, G., Héchard, Y., McMullen, L. M., Prévost, H. The Continuing Story of Class IIa Bacteriocins. Microb. Mol Biol Rev. 70 (2), 564-582 (2006).
- Gao, Y., Jia, S., Gao, Q., Tan, Z. A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2, isolated from traditional Chinese fermented cabbage. Food Control. 21 (1), 76-81 (2010).
