Summary
セミフレキシブル高分子は、生きているシステムで広く適用されているユニークな力学特性を表示します。ただし、ポリマーの剛性などのプロパティにはアクセスできませんので、生体高分子に関する体系的な研究は制限されます。本稿では、プログラム可能な DNA ナノチューブ、フィラメント剛性の影響に関する実験的研究を有効にすることによってこの制限を回避する方法について説明します。
Abstract
細胞や生体高分子ネットワークなど、複雑なポリマー ベースのソフト問題の機械的性質は、どちらも古典的なフレームの柔軟なポリマーも棒状ので理解できます。基になるフィラメントは強い熱変動も残ります、失われつつある非バックボーン剛性のため、永続化長さ (lp) 経由で定量化は、差し出されました。自分の有限の曲げ剛性は一意、非自明な集団力学一括ネットワーク、大規模なメッシュ サイズを提供しながら低容積比で安定した足場の形成に します。この原則は (例えばセルかティッシュで)、自然で流行する分子含有量が高いとそれにより拡散の促進または能動輸送を最小限に抑えます。それらの生物学的意義と生体適合性ヒドロゲルの潜在的な技術アプリケーションのためセミフレキシブル高分子は、膨大な研究の対象とされています。しかし、わかりやすい調査残った挑戦以来、彼らは自由に可変であるアクチン フィラメントなどの天然高分子に依存します。これらの制限にもかかわらず、合成、機械的に可変、セミフレキシブル高分子材料の不足のため、アクチン フィラメントが共通のモデル システムとして確立されました。主な制限は、巨視的なバルク構造への影響を研究する中心数量lpを自由にチューニングできないです。この制限は、フィラメントの高剛性制御の変更を有効にする、構造的にプログラム可能な DNA ナノチューブを採用することにより解決しました。彼らは部分的に相補的な鎖の離散セットが離散円周リング構造で交配させるタイル ベース デザインを通して形成されます。これらのリングは粘着末端、フィラメントに効果的な重合、長さ数ミクロンの有効化の機能し、天然生体高分子として同様の重合速度を表示します。彼らのプログラム可能な力学のためこれらの管は、 lp一括スケールと同様、単一分子の影響を研究する汎用性の高い、新しいツールです。アクチン フィラメントと対照をなして顕著な変性がなく、数週間にわたって安定し、の取り扱いは比較的簡単です。
Introduction
そのユニークな力学的特性により複雑な振る舞い、セミフレキシブル高分子、生活物質の基本的なビルディング ブロックです。柔軟なポリマーとは異なりセミフレキシブル高分子は強い熱変動1対象まま、失われつつある非バックボーン剛性により差し出された構成を採用します。したがって、完全に柔軟なまたは硬質ポリマーの両極端と同様、彼らの行動と純粋な確率モデルを適用できません。いわゆるワームのようなチェーン モデル2,3,4は、フィラメント4に沿って接線-接線相関の崩壊定数であるlp経由でこの剛性を定量化する開発されました。Lpがフィラメントの輪郭の長さ (lc) に匹敵する場合、ポリマーは、セミフレキシブル1と見なされます。テントのポールと同様、ネットワークまたはバンドルの手配珍しい粘弾性特性5,6,7につながる、低ボリュームの分数で集合的なシステム全体を安定化します。 8,9。これらの構造は、高弾力性で大きなメッシュ サイズ10、まだ促進拡散と能動輸送過程時機械的整合性の維持を提供します。このプロパティは特に細胞骨格や細胞外マトリックスなどの生物学的システムに適してが、食品工学1,11,12でも広く使用されています。
生物にその意義にとどまらず、バイオミメティック材料や新規ハイドロゲルを開発するツールを持っているためにこれらの構造体の物性を総合的に診断することが重要です。セミフレキシブル高分子の面で、これはシングル フィラメント プロパティlpと記述の理論的枠組みの開発などから生じるネットワークの集団特性の系統的分析法を意味します。先駆的な研究で細胞の生体高分子アクチン セミフレキシブル高分子のモデル系として設立され、ゴールド スタンダード5,13,14,15をまだ広く考えられています。,16,17します。 ただし、徹底的に研究はこのシステムと限られているこの蛋白質の固有プロパティにバインドされているので。様々 な理論的アプローチ シングル フィラメント レベル以外の些細な力学的挙動の説明を構築することを目指した、線形弾性高原のせん断弾性係数 Gの依存性の特に異なるスケーリング予測につながっています。 0 (すなわちネットワークの「弾力性」)、(c) 濃度とlp6,7,13,14、に関して 15,18,19,20,21,22,23。アクチンを用いた実験や他のモデル システムで容易にアクセスできる濃度のスケールは理論的な予測が厳密にされている間、および検証13,16,24,25日は実験不可能であった、 lpを基準します。これは、主要な制限lpがセミフレキシブル高分子の定義数量は、独立変数でもあるので。
この中央の自然による制約アクチンの固定lpまたは他の生物学的由来高分子コラーゲンなど最近タイル ベース DNA チューブは、その力学的特性の可変が採用することにより解決されています9,26,27,28. (構成の DNA の数が異なるなど、ストランド単位リング内) チューブのアーキテクチャのわずかな変化をもたらすlp、蛍光顕微鏡で評価することができます、異なる値1 つの変動のチューブを分析することによってまたは複数の付着の管の曲面構成を評価することによって、として上記の9,28。これらの解析では、異なる管集団のlp値よりも 1 桁以上異なるし、異なる評価手法が一貫した結果9,28をもたらすことを明らかにしました。
驚いたことに、すべての前の理論的なアプローチと矛盾する報告されている濃度とlpに関して線形弾性高原のせん断弾性係数G0の全体的なスケール9、特に多くを示すlp依存予測よりも強い。これらの調査結果は、セミフレキシブル高分子の中央特性を研究する新しいモデル システムの価値を強調します。Nを採用-螺旋形 DNA チューブは劇的にこれらの調査の範囲を広げます。Lpが自由に変化させることが、基本マテリアルを変更することがなくただ DNA の本質的なプログラム可能な性質は、クロスリンクや速度論的スイッチング プロセスなどの追加要素の体系的な検討を有効にできます。さらに、これらの管は水に溶けるし、適切な pH およびイオンについては、数週間、検出分解9なしで安定したほとんどの蛋白質のとは対照的。
これらのチューブをアセンブルする DNA のオリゴヌクレオチドの離散セットを使用すると、それぞれの 2 つの近隣の鎖に相補的な塩基配列を共有する 2 つのドメインが含まれています (特定のシーケンスにより一本鎖を形成できません髪のピンなどの構造)。相補的な配列がn相互接続の二重螺旋セグメントの囲まれた、半分重なり合うリングを形成、周期的に交配させる (図 1 a とB)。離散直径 (図 1)、および半分重なって構成でこれらのリングのフォームは、別のリングの粘着性の両端に相補的な軸の粘着末端を公開します。オリゴヌクレオチドをマッチングこの選択的添加は糸状の DNA ヘリックス チューブ サイズn (nHT) の効果的な重合につながるリングの積み重ねをトリガーします。自分の輪郭の長さは通常、長さ数ミクロンを測定し、その長さの分布はアクチン フィラメント9,26,27,28に匹敵します。それは確かにに似てアクチン フィラメントと微小管の重合反応を示す同じような DNA ナノチューブ構造体の示されています。
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Protocol
1 です。 n 高温超伝導体の作製
注: ここでは、n は特定のサイズの螺旋管の形成に関与する別の単一 DNA の繊維の数。N = 8、8 つの異なる単一 DNA の繊維を補うユニット リング
。- 購入 DNA シーケンス (HPLC 純度グレード以上) 適切な DNA 合成からサービスや高品質の合成と精製 (表 1 に与えられた模範的なシーケンス) を実行します 。 会社から対応するマニュアルに書かれた
- 凍結乾燥再懸濁しますオリゴヌクレオチド精製水、従ってそれ以上の再懸濁の手順。最終濃度が 200 μ M のために水の量を調整します 。
- 単一 DNA の濃度を決定するストランド ディストリビューターによって与えられた値を確認します (例えば 260 で紫外可視分光法による nm) 正確な化学量論はアセンブリ プロセスの非常に重要ですので。特定のモルの重量と各単一座礁させた DNA のオリゴヌクレオチドの消散係数を考慮して、オリゴヌクレオチドの濃度を計算します
。 注: 絶滅の係数値は、本質的に異なるシーケンスによって変わるし、市販購入した DNA のマニュアルに記載されています。彼らは、自由に利用できるオンライン ツールの数を使用して、近傍モデルによると計算できます。分光器の線形の範囲を遵守するため濃度定量のための試料を希釈することを検討してください 。
- DNA ストランド各濃度で同じ目的 n HTs を形成する (例えば、 200 μ L の PCR チューブ) のたちに適したコンテナーをミックス、マイクロ ピペットを使用して (最後のバッファー条件: 1xTE (10 mM トリスと 1 ミリメートルの EDTA、pH 8) と12.5 mM MgCl 2).
注: n HT の最終的な DNA のサンプルから成る n - 1 鎖、U 1 − U n − 1、および 1 つの T n ストランド。サブ マイクロモル以上 10 μ M、ユーザーのニーズに応じて異なります 1 ストランドあたり濃度 (例えば、 < 単一のフィラメントを観察する後続の希釈のための鎖や審査のため高濃度あたり 1 μ m密なネットワークの力学). - 交配 (65 ° c 以降のクイック ドロップで、90 ° C で 10 分間の変性; 遅い温度 65 ° C から 55 ° C、30 分間-0.50 K 20 温度ステップで相補的な基本ペアリングに減少たちの HTs n各;55 ° C から 20 ° C へのクイック ドロップ); 図 2 a を参照してください
。 注: 65 ° C からの下落が遅いステップは平均チューブ長さを増加する長くことができます。しかし、20 ° C に後続のクイック ドロップは重合管の凝集を避けるために非常に重要です 。
- は検出すること無く 4 ° C で最大 3 週間交配させられた n HTs を格納します
。 注: 蛍光顕微鏡、n HTs をラベルが (部分的に) 変更された U1 Cy3 の (表 1) の U1 に置き換えることでハイブリッド型します。観測時間が長くなるため確立された反漂白剤の添加はことをお勧めします 。
- は慎重に所望の最終濃度にサンプルを希釈 (ネットワークまたは 20 μ M など 4 シングル フィラメントの観察の nM) 必要に応じてサンプル バッファーを使用して。エラー ソースの可能性を最小限に抑えるために望ましい最終的な集中でサンプルを組み立てるです 。
2。レオロジーをせん断
動的せん断粘度の- 選択適切なジオメトリ (プレートまたはコーン プレート)。少量 (すなわち、 200 μ L 以下)、コーン プレート形状を使用します 。
- 動的せん断粘度のサンプルを読み込む 。
- サンプルと潜在的な蒸発を防ぐために次の手順を使用して、環境の空気-水界面パッシベーションします。
- 2.5 ml サンプル バッファー風呂のサンプルを囲んで 。
- 界面活性剤ミセル濃度のすぐ下に追加します 。
- ハミルトン シリンジを使用して空気サンプルの直接接触を避けるために脂質とサンプルを囲みます 。
- ウェット スポンジ装備のキャップと試料室を密封し、可能であれば、さらに (サンプル) の接触していない追加の水お風呂と蒸発を抑制します 。
- 室温レオメータ固有のソフトウェアを使用して測定を開始; (生理学的な条件が必要な) 場合、または、37 ° C など、それぞれの温度で測定を実行します
。 注: サンプルを冷却よく伴われる水蒸気の凝縮周囲の空気から暖房が強化された蒸発になります。両方の効果は、サンプルの濃度を変更できます抑え切れずシリーズのすべての測定値が一定した温度で実行されます 。
- は、2 時間室温で平衡にサンプルを許可します。時間進化が時間掃引で監視されるかもしれない (1 つのデータ ポイント 1 分あたり; ひずみ γ = 5%; 周波数 f = 1 Hz).
- 目的のテスト プロトコルの機械的性質を測定します。周波数掃引のシリーズを開始 (f-スイープ) サンプルそのままさらに測定を可能にするためです
。 注: また、短い f-長い測定の前後にスイープを行う必要があります (長い f など-はるかに高い解像度でスイープ) サンプル計測プロトコル中変わらずに残ったことを確認します。- 実行短い f-スイープ (例えば γ = 5%;f = 0.01 Hz から 30 Hz;10 年ごとに 5 つのデータ ポイント).
- 実行長い f-スイープ (例えば γ = 5%;f = 0.001 Hz から 30 Hz;21 データごとにポイント 10 年);計測時間を短縮する必要がない場合、低周波領域を省略できます 。
- 短い f を実行-スイープします 。
- Γ-スイープの実行 (例えば、f = 1 Hzγ = 0.0125% から 100%;十年ごとの 20 のデータ ポイント).
注: を使用して、短い f - まず、掃引として、それは通常前 f と一致しない - ネットワークは通常 γ スイープ中に破裂やプレートから切り離すためにのスイープします。また、γ ランプを使用 (例えば、 = 0.025 s -1、t = 60 s);ただし、ランプは通常変更モーター モード、続いて短い f 必要-スイープ、反証されるだろう 。
- 箱および/または滑らかなガウス カーネルで raw データ
3. 蛍光アシストの DNA 解析アニール
- 12 の因数を準備 8 μ L 1-4 μ M を使用して各サンプルの DNA 核酸ゲル × 1、TE バッファー x 12.5 mM MgCl 2 で 1 ストランドあたり 10,000 x DMSO から染色在庫があります。陰性対照ではない DNA が核酸ゲル染色があります 。
- リアルタイム PCR プレートに試料を転送、シール粘着フィルム (例えば、 96 ウェル リアクション プレート).
注: 熱アニーリングのプロトコルで使用される高温サンプルすぐ乾きます。したがって、井戸は、特に長期的な実験の間に水の蒸発と濃度の増加を防ぐために接着フィルムで密閉を確認してください 。
- ガス気泡を除去する部屋の温度で 1 分の 100 x g でプレートを遠心分離機; ガス泡を展開、井戸が解析できません 。
- リアルタイム定量 PCR システムに封印されたプレートを読み込む 。
- は、焼鈍のプログラムを実行します。10 分ドロップすぐ 72 ° c. に温度 90 ° C で DNA を変化させなさい。その後、0.5 ° C 30 分毎でゆっくり温度を下げます。信号が崩壊すると後の加速温度ランプ
。 注: 72 ° C は十分に本当ハイブリダイゼーション温度;したがって、信号の必要な温度範囲を決定するのに適した広い温度範囲にわたって記録されます 。
- Cycler の蓋が粘着フィルムに蒸着サンプルの結露を防ぐために、少なくとも 100 ° C に加熱することを確認してください 。
- アセンブリ中に 488 のアルゴン イオン レーザーを用いたサンプルをエキサイト nm、550 で蛍光を検出 nm 核酸ゲル染色を使用する場合 (またはスペクトルと同様)。他の染料は、励起/蛍光の適切な組み合わせを選択します。全体を高めることできるだけ多くの蛍光信号を測定信号品質の内蔵カメラを使用しています
。 注: ここでは、測定したすべての 9 s. - プリセット溶解・熱処理のプログラムを適用すると、提供されたソフトウェアを使用してデータを分析します。そうでない場合を引く蛍光信号の相対的な変化を取得するステップごと温度平均値から以前の平均値 。
4。AFM イメージング
- 雲母を切断 (例えば、 雲母 " V1 ") 市販の粘着テープを添付してそれをリッピング; 雲母の最上位のレイヤーを削除必要があります 。
- 前もって形成された n HT で Mg 2 + たて劈開雲母の折りたたみのバッファーを含むと 10 分解決するようにし、マイクロ ピペットを使用して入金
- は、残りの液体を削除する小さなテーブル遠心 2,000 x g で短い 3 の間隔でサンプルをスピンします。いくつか n HTs はまだマイカ表面に添付します 。
- カンチレバー探針を使用し高剛性 (例えば、 54 Nm -1) と内部の原子間力顕微鏡のソフトウェアとその共振周波数を決定します 。
- タッピング モード低スキャン レート (例: 1 行/秒) または n HTs. を変位の損傷を避けるために空気の AFM による高さプロファイルのレコード
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Representative Results
温度ランプ (図 2) を介して DNA ナノチューブ構造体のアセンブリは、これらの人工セミフレキシブル高分子を形成する非常に信頼性の高い方法です。これらのポリマー アクチン フィラメントなど、自然に発生する対に匹敵する特性を持っているが、その機械的性質は生成を制御することができますのでより広範な実験的枠組み変更9,27 を提供.生体高分子のような彼らはネットワーク (図 3) での手配やバルクの構造と性質のフィラメント剛性の影響をテストする 1 つを明示的に許可。図 4に示すように、これらのネットワークがアクチン繊維のネットワークの特性を密接に似ている 10% までは緊張のため線形ひずみ政権表示します。この政権内で線形剪断レオロジー容易に適用できます、たとえば、異なる周波数9時プローブ DNA ナノチューブ ネットワークの弾性と粘性応答を調べます。これらのテストは、これらのネットワークが主に弾性に動作する明らかにする (図 5)。タンパク質の測定と対照をなしてこれらのチューブ サンプルの空気-水界面変化しないさせないとしたがって、洗練された戦略は、パッシベーション (図 6) が必要です。したがって、サンプルの取扱いは簡単ですではなく、低いサンプルにサンプル変化で一貫した結果をもたらす、非常に堅牢であると証明しました。
しかし、かどうか不対の無料「粘着終了」単一座礁させた DNA 各チューブの両端の質問はイベントに残った不要な確率の交配を引き起こすことができます。この問題に対処するため、チューブの両端をカバーする相補的な「キャップを終了」シーケンスは、交配プロセスが完了した後サンプルに追加しました。しかし、図 7に示します、フィラメントの両端をキャッピング検出可能な影響であり、管端がネットワーク9の一時的な架橋効果を誘発しないでください。こだわりイベント サンプルの扱いが雑すぎるときだけ重要な役割を再生、過酷なピペッティングによりチューブを破る。これらの破損のポイントは、ひずみ硬化 (図 8) などのシステムの非線型応答につながる架橋効果を誘導するために実際に表示されます。
場合はサンプルは慎重に作成されるとフィラメント濃度 (図 9 a) またはフィラメント剛性 (図 9 b)9がで構成されるネットワークの機械的性質に与える影響をテストするのには半屈曲性高分子。初めて、フィラメントの剛性と弾力性ネットワークの定量的接続を実験的、体系的に優勢な理論的に予想を反するリニア電源の則を降伏検討しました。これらの結果は、DNA ナノチューブ構造体があった以前実験的アクセス9,27セミフレキシブル高分子の効果を研究する新しい、多目的なツールであることを示しています。今、様々 な理論を実験テストするフィラメントの永続性長lpの依存関係に関するステートメントを含みます。さらに、剛性の異なる管を採用することによりは、レプテーション (図 10) などの非常に基本的な効果をさまざまな観点から調べることができます。
| 名 | シーケンス | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2 ・ b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2 ・ b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3 ・ b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4 ・ b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5 ・ b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-* b5 ・ a6 ・ b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7 ・ b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1 ・ b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1 ・ b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1 ・ b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1 ・ b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1 ・ b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1 ・ b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1 ・ b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1 ・ b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| エンド キャップ A1 | CCTAATCGCC | ||
| エンド キャップ A2 | CCTTTAGATCC | ||
| エンド キャップ A3 | CCACTCTTCC | ||
| エンド キャップ A4 | CCGTGAGAACC | ||
| エンド キャップ A5 | CCGCACGACC | ||
| エンド キャップ A6 | CCAACGATGCC | ||
| エンド キャップ A7 | ATGCACCTCC | ||
| エンド キャップ A8 | AACGGTAACTA | ||
| エンド キャップ B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| エンド キャップ B2 * | ACCAGATACA | ||
| エンド キャップ B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| エンド キャップ B4 * | ACGCATTGCA | ||
| エンド キャップ B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| エンド キャップ B6 * | ACTTCTATCA | ||
| エンド キャップ B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| エンド キャップ B8 * | TCCCAAGTCA | ||
表 1: nで表示高温超伝導の交配のためシーケンスの DNA の例図 1、またnHTs9,に関する過去の研究で使用されたクラス ="xref"> 26,27,28 。シーケンスの特定のセットは、(例えば、 a1 交配の補足シーケンス a1 *) 7 つの異なるチューブ アーキテクチャのアセンブリのことができます。指定されていないその他の管のアーキテクチャは、加算または減算鎖鎖n U1のよると環化反応を伴うので形作ることができます。
図 1: チューブ アセンブリとアーキテクチャ。(A) 、第 4 はレディースのアセンブリの模式図を 4 つの異なる 42 mers の形成します。隣接する一本鎖 dna は、黒い長いタイマー刻み (短い黒いダニ unhybridized 拠点を示す) で示される 10-11 拠点の継続的な交互ドメインを交配させます。この半分ずらしてモチーフの機能軸に沿って両側に粘着末端は、軸の成長を有効にする矢印で示されます。境界ストランド U1 と T4 も相補的なドメインを機能と閉じたリング右矢印によって示される。このスケッチは 2D 表現です。交配させられた状態でストランドは、二重らせんを形成し、すべての拠点がペアになっています。(B) 2 つの二重らせんと第 4 はレディースの四量体の擬似 3 D 模式図影遠い層に覆われています。二重らせんは相補的なドメインを形成し、単位長さの要素ごとに 1 回管の両方の隣接する二重らせんにリンクされています。わかりやすくするため厚い一本 U2 を描画します。(C) 7 つの異なるチューブ アーキテクチャの例を与えられて鎖番号 4 に至る 14 HT とlp 1.2 26 μ m に至るまで HT (DとE) Cy3 標識のエピ蛍光画像吸着 5 HT10 HT は異なる曲線を介して別の剛性を示します。赤のオーバーレイは、イメージ解析、エンド-エンドの距離 R と輪郭線長 lC経由で見つけられるフィラメント輪郭です。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 温度の傾斜路および DNA ナノチューブ構造体の対応するアセンブリ。(A) DNA ナノチューブ構造体、いくつかの異なる温度ステップ オーバー約 11, (B)リアルタイム定量 PCR システム、染色繊維の蛍光信号の相対的な変化でを含むプロトコル経由で、たちで組み立てられて。温度ランプを通過しながら新たに形成された二本鎖 DNA の測定であります。アセンブリ率 DNA ナノチューブ構造体の種類によって異なります。複雑なおそらくより多くの繊維からのより広いアセンブリの構造形成 (したがって異なる系列とローカルのアニーリングの温度よりセグメント) によって駆動プロセスの適切な位置に交配させる必要があります。熱ゆらぎ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 4 μ M で 8HTs のもつれネットワークの代表の AFM 像。雲母表面に吸収され 8HTs の前もって形成されたネットワークの高さプロファイルは、空気のタッピング モードを使用して記録されました。原子間力顕微鏡画像はネットワークの 2 D 投影を可視化する、ネットワークと同様にチューブが 2 D 構成で圧縮されますので、3 D の場合のデータ (例えば、メッシュ サイズ) の信頼性の高い抽出を許可しません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 線形範囲。ひずみ測定 (G' = 1 Hz) 幅広い線形弾性台地である、ひずみ硬化、非線型挙動のけんしょうなど架橋効果の兆しなしを明らかにします。(各nHT によって異なります) 特徴的なひずみ、上記高原の弾性係数は不可逆的遮断します。誤差範囲は、実行のすべての測定の平均値の標準偏差を表します。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 絡み合い 6HT ネットワークの典型的な周波数依存性。DNA の管のネットワークは、適用周波数に応じて 4 つの注文の大きさで上広範な弾力性高原を表示します。高分子ネットワークの弾性部分期待どおりに (G') 複雑なせん断の係数、粘性部分よりも有意に高かった (G')。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6:気液界面効果なし。周波数掃引 (f-スイープ; γ = 5%) 8HT の 8 μ M でサンプルを気液界面で蒸発とゲル化効果の影響が無視できること明らかにしました。異なる平衡時間だけでなく、タンパク質の界面 (界面活性剤および脂質)、クラスタ リングを大幅に削減する知られている 2 つの方法が使用されました。メソッドの独立、蒸発または表面弾性による抜本的な影響の兆候を記録しました。ここでは、G' 弾性率を表し、G ' 粘性係数 (破線) を表します。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 最後の変更の影響がない。高原の弾性係数を一定のまま、それぞれ相補的なシーケンスに 8HTs の粘着性がある端のキャップ。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 測定ネットワークの前もって形成された DNA の処理プロシージャの影響。交配の後で前もって形成されたネットワークの処理方法によって測定値が異なる場合があります。この例では DNA ナノチューブ構造体のピペッティング時にせん断流に大幅に変更されているとチューブを破った場合は扱いが雑すぎます。破損が公開、相補的な単一鎖弾力性の増加につながると非線形効果を誘導する、壊れたまたは破裂のセグメントに相関関係間の不要なやりとりにつながる such がひずみ硬化 (大規模な系統、緑のカーブのための弾力性の増加) として。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: DNA ナノチューブ構造体は、 lp依存関係の研究を有効にします。(A) nHTs セミフレキシブル高分子ネットワークを勉強して濃度 (濃度掃引)、アクチンなどの生体高分子を用いた研究に類似したシステムの力学的応答の調査を実行できます。(B)また、チューブの別のアーキテクチャを容易にする基になるフィラメントの変化lpに対する力学的応答の測定これは自然発生すると実現不可能半屈曲性高分子。このため、 Aからのデータはlpに関して高原の弾性係数のスケーリングに対応する replotted します。誤差範囲は、実行のすべての測定の平均値の標準偏差を表します。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: レプテーションとメッシュ サイズ。Reptating フィラメント (単一ラベル DNA 8HT、ラベル付けされていないネットワークに埋め込まれた録音、蛍光画像c = 14 μ M) ネットワークにおけるフィラメントの絡み合い性質を確認する使用することができます。任意の架橋効果この一次元拡散を妨げます。Inset: レプテーション解析は、アクチン測定によく比較し、理論的予測30に同意する濃度、スケーリング メッシュ サイズを決定する使用できます。誤差範囲は、実行のすべての測定の平均値の標準偏差を表します。図 Schuldtら9から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
適切に整形されたネットワークを得るためには、重要なステップは、DNA ナノチューブ構造体の組み立ています。合成処理中のエラーに悪影響をチューブの品質;したがって、高速液体クロマトグラフィーまたはより厳格なプロセスがオリゴヌクレオチドを浄化するために使用することをお勧めします。濃度を再する必要がある集計 DNA ナノチューブとその長さ分布ではなく離散の形成は、セット内のn構成オリゴヌクレオチドのモル比に依存、するので購入した鎖の以来与えられた値が大幅に変わる実際の集中から。実行できます、たとえば、260 の吸収波長紫外可視分光法による nm。別のシーケンス間の分子量と消散係数が異なることに注意したいと思いますしたがって、各 DNA のオリゴヌクレオチドの濃度を吸光度に変換する値を決定する必要があります。機器、NanoDrop などの小さなサンプル ボリュームの最適化を使用して各測定点数回を撮影され平均します。スペクトロメータの検出の線形の範囲を遵守します。必要に応じて濃度を決定するために使用する分数を希釈します。わずかな誤りが正しい化学量論と管形成; の品質に大きな影響を持つことができます。したがって、できるだけ正確で単一繊維のピペッティングなければなりません。その後、最終的なサンプル ソリューションは、サンプルをたちにそれを配置する前に上下にゆっくりとピペッティングにより徹底的に混合ください。直接光と後で確立された反漂白剤 (すなわち、酸素消去システムなどを追加からシールド環境ですべての手順を実行必要があります可視化用蛍光染料と繊維が変更されている場合グルコース酸化酵素/カタラーゼ) をお勧めします。単一繊維は、正しいバッファー条件で混合されている、温度ランプが構造 (図 2 a) を交配に適用されます。DNA がらせん形をダブルクリック、以前に決定された重要な交配温度をこの温度パターンに従います。DNA ハイブリダイゼーション反応 (すなわち、ネイティブの31DNA UV 吸光度、熱量計32、または蛍光染料33) を分析するいくつかの方法が開発されています。後者の方法で染料は非連結の染料よりも明るく強く蛍光錯体を形成、DNA 二重らせんにインターカ レートします。彼らは部分的に二本鎖が一本鎖 DNA34をバインドします。したがって、このような染料システム35で自己集合 DNA ナノ構造を監視に適用されている、理想的なアセンブリ条件を識別するために使用することができます。
最初に、サンプルには、定義済みおよび予期せぬデュプレックスなど任意の二本鎖 DNA が意図しない基本ペアリングを避けるために高温 (90 ° C) で変性します。温度 (図 2 aに類似) でその後徐々 に減少は、基本ペアリング イベントを有効にする DNA の繊維の熱運動を低減します。自由エネルギー最小化問題のため DNA の繊維は優先的にその相補系列で交配させます。DsDNA 固有デュアルインターカレーション染料を適用すると、明るさはターンで新たに形成された二本鎖 DNA34のための定量的測定高蛍光錯体の形成とが増加します。4HTs と 8HTs の形成のための蛍光信号の相対的な変化は、図 2 bにプロットされます。この相対的な変化は、各温度の蛍光強度を平均し、その後以前の温度の平均値を引いて計算されます。昇格した蛍光温度を下げるとすることができます (図 2 b) を検出し、この曲線のピークが大規模な交配のイベントが発生する温度を強調表示します。カーブのドロップは、プラトーに達すること強度値を指します。DNA の構造物とその複雑さを (例えば、小規模または大規模な一連の DNA の鎖)、によってピークはシャープ (図 2 b, 青の曲線) またはブロード (図 2 b, 緑の曲線) を指定できます。可能であれば、これは交配させられた dsDNA セグメントの形成を介してチューブの形成が行われている範囲が徐々 に減少温度ランプ部に含まれていることを確認するすべての新たに設計された構造のテストする必要があります。適切な温度政権、決定されますと、ナノ構造が正常に非常に狭い温度範囲 (図 2 b, 青の曲線)、または流水も35で組み立てることができます。複数の DNA の交配の周期格子繊維注共同アニーリング効果35,36, さらに DNA アニールをサポートするを誘導します。デュアルインターカレーション染料がヘリカル ターン構成、従って管の全体的なジオメトリを変更ごとの標準 10.5 塩基を超える DNA ヘリックスをストレッチを行うことを検討します。したがって、900 DNA 塩基対35あたり 1 分子の色素の濃度を上げることはお勧めできません。さらに、ピーク アセンブリ温度最適なアニーリング温度から逸脱するかもしれない。高精度を達成するために、管の形成のための最適条件を決定するため、DNA ハイブリダイゼーションは agarose のゲルの電気泳動をダブル チェックする必要があります多くの緩やかに変化する温度ステップ、中に調べる必要があります。DNA ナノチューブ構造体の場合、3 ステップのプロトコルを設立しました。最初に、サンプルを単一繊維に DNA を変性する 90 ° C に加熱します。その後、広い温度範囲 (蛍光信号のアセンブリ ピーク) の周りが覆われています。私たちのケースでは、10 ° C の範囲が覆われている 65 ° C からの 55 ° C、-0.50 ° C のステップに至るまで 30 分毎。最後の手順で温度急速にドロップしてください 20 ° C - 我々 の場合のように、または部屋の温度 - 中間温度 (図 2 a) で任意の不利な相互作用を防ぐために。通常、thermocyclers はより冷たい温度からサンプルを熱する。そのため、組み立ての最後のサンプル濃度を増加させる際に、サンプル内の液体の蒸発を抑える蓋の温度を調整することが重要です。
NHTs が適切に形成されている場合、彼らは異なるチューブ間の架橋効果を引き起こす相互作用せず純粋なもつれネットワーク (図 3) に配置します。クロスリンクは、対になっていない DNA セグメント チューブに沿ってまたは隣接管の相補的な一本鎖セグメントとペアに自由になる粘着性がある端に欠陥から延びるからおそらくなります。これらの効果は、ひずみ硬化などの非線形特性を誘発するだろう ( Gを増やす ' より大きい緊張のため)、欠席している彼らでもつれネットワーク (図 4)。表示されている γ スイープは、また一般にレオロジー測定のための適切な線形ひずみ体制を明らかにします。特定のしきい値を超えるネットワークが破裂したり、システムの不可逆的損害賠償レオメータのプレートとの接触を失います。したがって、応用系統は、信頼性の高いデータを取得する線形の領域においてする必要があります。通常、5% のひずみはノイズ政権を上回るデータを生成するのに十分です。高い系統を適用可能性があります。しかし、彼らは簡単に破裂のしきい値に近づくし、ぼすとなることができます。非線形領域における測定のための ed。
レオロジー測定は慎重に、一貫性のあるサンプル調製を必要とし、再現性と解釈の結果を得るための測定プロトコルを慎重に検討します。中心点は、レオメータ プレート以来、これらのネットワーク、主のみ再現可能な構造の間の完全にランダムな等方性ネットワークを確立することです。したがって、かなり長い平衡時間 (通常約 2 h、時々、さらに) はせん断配向、分注時にサンプルのため行われる順序効果を分散させるために必要です。事前テスト実験は、平衡時必要な時間枠を決定するためにシステムの時間発展 (時間掃引) の記録に適しています。信号がさらに変更することがなく高原に達すれば、システムが平衡します。平衡一度の条件が決定されている、目的のテストでは、ランプまたは f またはスイープ γ、歪みなどを実行できます。幅広い系統のテストは、ネットワークまたはプレートに接続を最終的に破壊できます。ただし、テストが破裂のしきい値以下の系統に限られている場合ひずみランプとスイープ繰り返すことができます繰り返し潜在的な高齢化やヒステリシスの効果を調査するため。Fの場合-スイープ、計測にかかる時間が大幅に変わることができます。1 回の振動は数分をかかる場合がありますので、実験を延長する劇的に低周波をテストします。N f高温超伝導体の場合、注意してください-スイープを明らかにする弾性率G'粘性係数Gを超える' 約 1 つ、大きさによってこれらのシステム (の優勢な弾性応答例図 5)。短いfをさまざまな種類の実験を伴うことが一般的には、-システムに残った測定自体によって妨げられていないことを確認する主な実験の前後にスイープ。ただし、いくつかのマシンは、動的実験から変更するときに特に測定、各種の基になるモーター モードを変更する必要 ( fの振動など-スイープ) 静的ひずみランプ。この変更は、しばしば以降の測定値を焼戻しネットワークを破壊する自然の大きな歪みを伴ってください。したがって、使用レオメータの仕様を確認することをお勧めします。
アクチン系のレオロジーの実験では、システムの空気-水界面で発生するタンパク質変性の劇的な効果を明らかにします。変性タンパク質付着不特定、互いにそれによりシステム全体の特性を支配することが高密度の高いゲルを形成します。周囲の空気のサンプルの直接接触を防ぐため、パッシベーション技術もサンプルの水分の蒸発を抑制するを使用できます。3 つの潜在的な方法: (i)、サンプルのように同じバッファーを持つ試料室を囲む(ii)、疎水性と親水性ドメイン (心配取られなければならない、いくつかの界面活性剤は高分子の立体構造を妨げるので) によるインタ フェースをカバーするため界面活性剤を使用してください。または (iii) は、界面活性剤と同様の効果を持つより生物学的互換性のある脂質を採用します。NHTs インターフェイスで変性効果の対象とする見つかりませんでした、結果はエラーの主要な潜在的なソースを排除パッシベーション法 (図 6) の独立は、この注意をしてください。一般に、試料室は帽子を蒸発を抑制、室内の湿度を高めるに湿気があるスポンジを装備することができますで常に密封する必要があります。
簡潔に記載されている以前は、DNA ベースのシステムで潜在的なエラーの発生元は交配させられたなど対になっていない単一座礁させた DNA の DNA 欠陥または追加の架橋効果を引き起こす可能性がありますナノチューブの両端をオーバー ハングします。調査および/またはこの可能性を排除、相補的な短い鎖はこれらの粘着性がある端のキャップに使用できます。しかし、私たち自身の調査をキャッピング鎖導入nHTs と量子もつれのネットワークの動作に及ぼす影響残っていたない変更されていない (図 7) 添加を示した。ただし、相補的な配列を持つ粘着末端をキャッピング望ましくない相互作用を抑制する DNA ベース (やより複雑な) システムの役に立ちます。NHTs のサンプルを注意深く戻必要がありますさらに、(例えば、サンプル調製および希釈ステップの) 管に速報やその他の損害を防ぐために。ソリューションを戻される場合余りに大体、チューブを手に負えないほど破る、公開多数につながる欠陥点で粘着性がある端のシステムの相互作用管および潜在的な架橋を望ましくないです。これは信号と干渉し、効果を補強するだけでなく、γ-スイープ (図 8) に現れるひずみ硬化などの非線型効果に 。したがって、量子もつれのソリューションは、ゆっくりとのみ行うべきピペッティングではなく大径のピペット チップを使用して (ピペット チップの終わりを切断することはお勧めです) 管力のずれを軽減します。
結論としては、DNA nHTs、セミフレキシブル高分子を研究し、メカニカルチューナブル ヒドロゲルの新しいクラスを表すこれらの繊維から形成されるネットワークを一括に適切かつ適応性の高いモデル システムです。チューブが慎重に準備されて場合、は、様々 なケースで、フィラメントのlpの影響をテストする使用できます。一括レオロジー測定ネットワークを例えば紛糾、濃度とlpと弾性率を理論的に予測された依存関係が実験的派生のスケーリングと一致しないことを明らかにします。(図 9)9 を法律します。本研究では、基になるポリマーの剛性を高めることによってネットワークの弾力性を増やすことができますを強調しています。伝統的に、ハイドロゲルの剛性の増加より多くのポリマーをソリューションに追加することによって、または近隣ポリマー37,38間のクロスリンク (物理または化学) を誘導することによって達成されました。ただし、分子の含量は 3 D 細胞培養などのアプリケーションを制限することができます減少網目に関連付けられています。クロスリンク、一方、機械的性質39の正確なチューニングをさらに複雑にする基になるネットワーク アーキテクチャ内で複雑な形態学的変化を誘導することができます。しかし、 nHTs のネットワークを使用して、これらのパラメーターは、メッシュ サイズを維持したままだけの基になるフィラメントの剛性を変更することによって硬化作用が発生するという完全な分離のためことができます。さらに、チューブのアーキテクチャが具体的に選択的に架橋、同様に絡み合ったネットワークを作成するさらに実験の理論的予測をテストする可能性などの追加の効果を統合する変更できます。などのパラメーターlpまたはクロスリンクのサイズとのネットワークの強さ。一般に、プログラム可能なアーキテクチャがlpの研究を可能にする、アプリケーションの範囲を拡大-一括、のみならず分子レベルに依存の効果。研究では、例えば、チューブのような監禁、レプテーション (図 10)9と呼ばれるフィラメントの 1 次元運動のlpの依存関係ネットワークのラベルの付いた管を埋め込むことができます。この拡散運動が表示されているでは、架橋効果によって抑えられるだろうので、そのネットワークの絡み合い自然も確認します。基になる解析もネットワークのメッシュ サイズを明らかにします。さらに、これらの管は剛性の依存関係と42,4341,バンドル40、、、の形成の基になるチューブのカイラリティを調査する使用ことができます。44,星のようなアスター46,47,48,49,50, 架橋効果によってまたは経由で誘導することができますなど、 45または高次構造分子混雑した環境27。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は、DFG (1116/17-1)、ライプツィヒ学校自然科学"BuildMoNa"(GSC 185) で資金調達を認めます。この作品は、フラウンホーファー誘致プロジェクト 601 683 によってサポートされています。T. h. は、欧州社会基金 (ESF 100077106) からの資金提供を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
References
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A.
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A.
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J.
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al.
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
