Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

פולימרים semiflexible להציג תכונות מכניות ייחודי המוחלות בהרחבה על ידי מערכות החיים. עם זאת, מחקרים שיטתיים על biopolymers מוגבלות מאז מאפיינים כגון הפולימר קשיחות אינם נגישים. כתב יד זה מתאר איך מגבלה זו הוא מצויין לתכנות צינוריות דנ א, הפעלת ניסיוני מחקרים על ההשפעה של פילמנט קשיחות.

Abstract

תכונות מכאניות מורכבות, מבוסס פולימר חומר רך, כגון תאים או רשתות ביופולימרים, יכול להיות מובן במסגרת אף הקלאסית של פולימרים גמיש ולא של מוטות נוקשה. חוטים המשמש כבסיס להישאר פרושות עקב שלהם נעלם ללא עמוד שדרה נוקשות, אשר הוא לכמת דרך האורך ההתמדה (lp), אבל הם גם הפניה תרמית חזקה. נוקשות כיפוף סופיים שלהם מוביל מכניקה קולקטיבית ייחודי, לא טריוויאלי של רשתות בתפזורת, המאפשר הקמת פיגומים יציב על השברים בנפח נמוך תוך מתן רשת גדול מידות. העיקרון הבסיסי הזה נפוצה בטבע (למשל, תאים או רקמות), שמירה על איכות גבוהה בתוכן מולקולרית, ובכך להקל דיפוזיה או הובלה פעילה. בשל השלכות הביולוגי שלהם יישומים טכנולוגיים פוטנציאליים hydrogels מסתיימים, שהיו פולימרים semiflexible המחקר ניכר. עם זאת, חקירות מובנים נותר מאתגר מאז הם הסתמכו על פולימרים טבעיים, כגון חוטים אקטין, אשר אינם tunable בחופשיות. למרות מגבלות אלה, בגלל חוסר של פולימרים סינתטיים מכנית tunable, semiflexible, חוטים אקטין הוקמו מערכת מודל נפוץ. מגבלה משמעותית היא כי כמות מרכזי lp לא יכול להיות בחופשיות מכוון כדי לחקור את ההשפעה שלו על מבנים בצובר מאקרוסקופית. מגבלה זו נפתרה על ידי העסקת מבנית לתכנות צינוריות דנ א, המאפשר שינוי מבוקרת של הקשיחות נימה. הם נוצרו באמצעות עיצובים מבוסס-אריח, שבו קבוצה בדידה של גדילים משלימים חלקית hybridize במבנה הטבעת עם היקף דיסקרטית. טבעות אלו כוללים קצוות דביקים, המאפשר הפילמור יעיל לתוך חוטים מספר מיקרונים אורך, ולהציג קינטיקה הפילמור דומים כמו biopolymers טבעי. בשל המכניקה שלהם לתכנות, הצינורות האלה הם מגוונים, הרומן כלים לחקור את ההשפעה של lp בהמולקולה יחיד, כמו גם היקף בצובר. בניגוד אקטין חוטים, הם נשארים יציבים בשבועות, ללא ניוון הבולטים, הטיפול וסופן וזהובה.

Introduction

בשל התנהגויות מורכבות מופעל על-ידי תכונות מכניות הייחודי שלהם, פולימרים semiflexible הם אבני הבניין הבסיסיות של מרכיבי החיים. בניגוד פולימרים גמיש, פולימרים semiflexible לאמץ תצורה פרושות עקב שלהם נוקשות עמוד שדרה שאינו נעלם תוך שנותרו על תנודות תרמית חזקה1. לפיכך, מודלים סטוכסטיים גרידא ניתן להחילם על התנהגויות שלהם, כמו עם הקצוות של פולימרים גמיש לחלוטין או נוקשה. 3,4 2,מודל שרשרת תולעת כביכול פותחה כדי לכמת את נוקשות זו באמצעות lp, אשר הוא קבוע הדעיכה של המתאם משיק-משיק לאורך הלהט4. אם lp הוא להשוות אורך מתאר (lc) של חוט הלהט, הפולימר נחשב semiflexible1. מקביל והקטבים של אוהל, הסדרי שלהם רשתות או חבילות מייצבת את כל מערכת קולקטיבית על השברים בנפח נמוך, המוביל אל viscoelastic יוצא דופן מאפיינים5,6,7, 8,9. מבנים אלה מספקים בכללותו גבוהה elasticities mesh בגדלים10, שמירה על תקינות מכנית תוך עדיין הקלת המפזרת ותהליכים הובלה פעילה. מאפיין זה מתאים במיוחד עבור מערכות ביולוגיות כגון את שלד התא או את מטריצה חוץ-תאית, אך הוא גם משמש מזון-11,1,-הנדסה-12.

הולך מרכיבי החיים מעבר את משמעותם, חשוב לבחון באופן מקיף המאפיינים הפיזיים של מבנים אלה כדי יש את הכלים לפתח חומרים ביונים או hydrogels רומן. במונחים של פולימרים semiflexible, זה מרמז על הקביעה שיטתית של המאפיינים קולקטיבית של רשתות הנובע יחיד-פילמנט מאפיינים כגון lp והפיתוח של מסגרת תיאורטית תיאורי. במחקרים חלוצית, אקטין הסלולר ביופולימרים הוקמה מערכת מודל עבור פולימרים semiflexible והוא עדיין נחשב את תקן זהב5,13,14,15 , 16 , 17. עם זאת, מחקרים ממצה מוגבלות במערכת זו מאחר שהם קשורים למאפייני הטבועה של חלבון זה. גישות תיאורטיות שונות שכיוונתם בניין תיאור של ההתנהגויות מכני לא טריוויאלי ברמת יחיד-פילמנט, הובילו בעיקר שונים קנה מידה תחזיות עבור התלות של מישור אלסטיים לינאריים הטיה המודולוס, G 0 (קרי, "הגמישות" של הרשת), ריכוז (c), lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. בזמן הריכוז שינוי קנה מידה נגיש ניסויים עם מבוססי אקטין או מערכות אחרות דגם ובזמן תחזיות תיאורטיות היה בקפדנות לאמת13,16,24, 25, שינוי קנה מידה ביחס lp נותר נגיש השפעול. עם זאת, זו מגבלה משמעותית מאז lp הוא גם משתנה בלתי-תלוי מה הכמות המכונן של פולימרים semiflexible.

מגבלה זו המרכזי, טבעי המוטלים על-ידי קבוע lp של אקטין או פולימרים אחרים נגזר ביולוגית כגון קולגן לאחרונה נפתרה על ידי העסקת צינורות DNA מבוסס-אריח, אשר tunable תכונותיהם מכני 9 , 26 , 27 , 28. שייתכנו שינויים הארכיטקטורות של הצינורות (למשל, מספר שונה של DNA בוחרים קווצות בתוך הזירה היחידה) תשואה של ערכים שונים עבור lp, אשר ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, על-ידי ניתוח שפופרת אחת המשתנות או הערכת התצורות מעוקל של מספר צינורות מודבקת, כפי שתואר לעיל9,28. ניתוחים אלה חשף כי ערכיp lשל אוכלוסיות שונות צינור משתנות מעל סדר גודל אחד או יותר, טכניקות הערכה שונים להניב תוצאות עקביות9,28.

באופן מפתיע, גודל כולל הרמה אלסטי ליניארי הטיה מודולוס G0 הריכוז, lp דווחה להיות עקביים עם כל גישות תיאורטיות קודמות 9, בפרט הפגנת הרבה יותר תלות החזוי על lpחזק. ממצאים אלה מדגישים את הערך של מערכת מודל חדש ללמוד את התכונות המרכזיות של פולימרים semiflexible. העסקת n-סליל ה-DNA צינורות מרחיב באופן דרמטי את היקף החקירות האלה. לא רק יכולים lp להיות בחופשיות מגוונים מבלי לשנות את החומר הבסיסי, אבל הטבע לתכנות הטבועה של ה-DNA ניתן לאפשר בחינה שיטתית של רכיבים נוספים, כגון crosslinks או תהליכי מיתוג קינטי. בנוסף, הצינורות האלה הם מסיסים במים ויציב, בניגוד לרוב חלבונים, pH הולם ותנאי יוניים למשך מספר שבועות, ללא השפלה לזיהוי9.

להרכיב את הצינורות האלה, קבוצה בדידה של ה-DNA oligonucleotides משמש, שכל אחד מהם מכיל שתי קבוצות המחשבים חולקים רצפי הבסיס משלימים שני הגדילים הסמוכים (עקב רצפים ספציפיים, גדיל אחד לא יכול ליצור מבנים כמו סיכות לשיער). רצפים משלימים hybridize בצורה מחזורית, ויוצרים טבעות סגור, חצי חופפות של n מחוברים מקטעי כפול-הסליל (איור 1A ו- B). טופס אלה טבעות בקוטר דיסקרטית (איור 1C), ואת התצורה שלהם חופפות חצי חושף קצוות דביקים צירית משלימים בקצוות דביקים של טבעת אחרת. תוספת זו בררני של התאמת oligonucleotides מפעיל את הערמה של הטבעות, שמוביל הפילמור יעיל של צינורות סליל ה-DNA filamentous בגודל n (nHT). אורכי מתאר שלהם בדרך כלל למדוד מספר מיקרונים אורך, פריסתם אורך דומה לזו של אקטין חוטים9,26,27,28. הוכח עבור צינורות DNA דומה כי הם אכן מציגים הפילמור קינטיקה דומים לאלה של אקטין חוטים ו- microtubulesp class = "xref" > 29. בהתאם מספר n של גדילי DNA בודדים ממציא את המבנה הבסיסי טבעת, הארכיטקטורה nHT, וכן את היקף ואת קוטר, יכולים להיות מכאנית ופיקודית מגוונים. שימוש גדילי DNA יותר מגביר את היקף הטבעות/הצינורות, משתנה המתאימה הקפיצות תכונות מכאניות לערכים גבוהים יותר lp (איור 1C), המקביל קשיחות גבוהה יותר. בסולם mesoscopic, אלה ערכים גדולים יותר שלp lמתרגמים פחות כפופות הייצורים החיים בשל הקשיחות גבוה יותר (איור 1D ו- E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-הכנת n HTs

הערה: כאן, n מציין את מספר שונה גדילי DNA יחיד מעורב היווצרות הצינורות סליל בגודל מסוים. עבור n = 8, שמונה גדילי DNA שונה יחיד להמציא טבעת יחידה.

  1. רכישה DNA רצף (HPLC טוהר כיתה או גבוה יותר) מן סינתזה הדנ א מתאים שירות או לבצע סינתזה באיכות גבוהה, טיהור (למופת רצפים נתון טבלה 1).
  2. Resuspend lyophilized oligonucleotides מים מטוהרים, בצע resuspension נוספת השלבים במדריך המתאים מהחברה. התאימו את כמות המים בריכוז הסופי של מיקרומטר 200.
  3. לקבוע ריכוז של ה-DNA בודד קווצות כדי לוודא שהערכים שניתנו על ידי המפיץ (למשל, באמצעות ספקטרוסקופית UV-Vis ב-260 ננומטר) מאז סטויכיומטריה המדויק הוא קריטי עבור תהליך ההרכבה. לחשב את הריכוז של oligonucleotides, לוקח בחשבון את המשקל הסגולי טוחנת, המקדם הכחדה עבור כל oligonucleotide דנ א חד גדילי.
    הערה: הכחדה מקדם ערכי מטבעו להשתנות עבור רצפים שונים לבין מתוארים בתיעוד של DNA שנרכש באופן מסחרי. הם גם ניתן לחשב על פי המודל הקרוב ביותר-שכן תוך שימוש במספר כלים מקוונים זמינה בחופשיות. כדי לקיים מגוון ספקטרומטר ליניארי, שקול דילול המדגם המשמש לקביעת ריכוז.
  4. משתמש של micropipette, לערבב ה-DNA גדילי, כל באותו ריכוז-אין מיכל מתאים thermocycler (למשל, צינור PCR 200 µL) ליצור את הרצוי n HTs (מאגר הסופי תנאים: 1xTE (10 מ מ EDTA טריס ו- 1 מ מ, pH 8), MgCl 12.5 מ מ 2).
    הערה: דגימות DNA הסופית n HT מורכב n - 1 קווצות, U 1 − U n − 1 וגדיל אחד של n T. הריכוז לכל גדיל יכול להשתנות sub-micromolar על יותר מ- 10 מיקרומטר, בהתאם לצרכים של המשתמש (למשל, < 1 מיקרומטר לכל גדיל של דילול עוקבות להתבונן חוטים יחיד או ריכוז גבוה לבדיקת איכות רשת צפופה מכניקה).
  5. Hybridize של n. השודדים ב thermocycler (דנטורציה 10 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, עם ירידה מהירה הבאים עד 65 מעלות צלזיוס; איטי בטמפרטורה ירידה מ- 65 ° C עד 55 ° C, עם בסיס משלימים זיווג 20 צעדים בטמפרטורה של -0.5 K למשך 30 דקות בכל אחד מהם; ו ירידה מהירה מ- 55 ° צלזיוס עד 20 ° C); ראה איור 2A.
    הערה: השלבים ירידה איטית מ- 65 ° C יכול מאורכים כדי להאריך את אורך צינור הממוצע; עם זאת, הירידה מהירה הבאים עד 20 ° C חיוני למנוע הצבירה של צינורות polymerized.
  6. אחסן hybridized n HTs עד 3 שבועות ב 4 ° C ללא השפלה לזיהוי.
    הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, שכותרתו השודדים n הן hybridized על ידי (חלקית) החלפת U1 עם ששונה U1-Cy3 (טבלה 1). משכי זמן ארוכים יותר תצפית, התוספת של סוכנים אנטי-הלבנת הוקמה מומלץ.
  7. בקפידה לדלל את הדגימה לריכוז הסופי הרצוי (למשל, 4 מיקרומטר עבור רשתות או 20 ננומטר על תצפיות יחיד-פילמנט) באמצעות המאגר לדוגמה, במידת הצורך. כדי למזער שגיאות אפשריות מקורות, להרכיב דגימות-הריכוז הסופי הרצוי.

2. להטיה Rheology

גאומטריה
  1. בחר הולם (צלחת צלחת או חרוט-plate) עבור rheometer ההטיה דינמי. אחסון קטן (קרי, מתחת 200 µL), להשתמש הגיאומטריה פלייט-חרוט.
  2. לטעון את דגימות rheometer דינמי הטיה.
  3. Passivate הממשק מים אוויר של המדגם, סביבה באמצעות השלבים הבאים כדי למנוע אידוי תופעות אפשריות.
    1. המקיפים את הדגימה עם 2.5 מ של האמבטיה מאגר מדגם.
    2. הוספה של חומרים פעילי שטח מתחת הריכוז מיצלה.
    3. השתמש מזרק המילטון להקיף את הדגימה עם ליפופרוטאין להימנע ממגע ישיר של המדגם באוויר.
  4. חותם תא הדגימה עם כובע מצויד ספוגים רטובים, במידת האפשר, עם אמבט מים נוספים (לא בקשר עם המדגם) בכדי לדכא את אידוי.
  5. להתחיל את המדידה באמצעות תוכנה ספציפית rheometer בטמפרטורת החדר; לחלופין, לבצע את המדידה בטמפרטורות שונות, כגון 37 ° C (אם יש צורך בתנאים פיזיולוגיים).
    הערה: קירור המדגם לעתים קרובות היא מלווה את עיבוי של אדי מים מן האוויר שמסביב, ואילו חימום מוביל אידוי משופרת. שני אפקטים ללא שליטה יכול לשנות את הריכוז של המדגם, אז כל המדידות בסדרה יש לבצעו בטמפרטורה קבועה.
  6. לאפשר את הדגימה כדי equilibrate עבור 2 h בטמפרטורת החדר. ההתפתחות זמן יתועד עם מטאטא זמן (נתונים אחת הצבע לדקה; זן וγ = 5 %); בתדר f = 1 הרץ).
  7. למדוד תכונות מכאניות עם הפרוטוקולים המבחן הרצוי. להתחיל עם סדרה של תדירות מטאטא (f-מטאטא) כי הם השאירו את הדגימה ללא פגע ולאפשר מדידות יותר.
    הערה: בנוסף, קצר f-מטאטא תיעשנה בחוץ לפני ואחרי מדידות זמן רב יותר (כגון ארוך f-מטאטא ברזולוציה גבוהה יותר) כדי לוודא כי המדגם נותר ללא שינוי לאורך כל פרוטוקול מלא מדידה.
    1. בצע קצר f-סריקה (למשל, וγ = 5%; f = 0.01 הרץ עד 30 הרץ; נקודות נתונים 5 לכל עשור).
    2. לבצע ארוך f-סריקה (למשל, וγ = 5%; f = 0.001 הרץ עד 30 הרץ; 21 נקודות נתונים לכל עשור); המשטר בתדר נמוך יכול להיות מושמט אם לא הכרחי לצמצם את זמן מדידה.
    3. לבצע קצר f-לטאטא.
    4. לבצע סריקה וγ (למשל, f = 1 הרץ; וγ = 0.0125% עד 100%; נקודות נתונים 20 לכל עשור).
      הערה: השתמש קצר של f - לטאטא קודם, כפי שהוא בדרך כלל בקנה אחד עם הקודם f - מטאטא כי רשתות בדרך כלל להיקרע במהלך γ-סריקה או ניתוק של הלוחות. לחלופין, השתמש γ-שיפוע (למשל, = 0.025 s -1, t = 60 s); עם זאת, רמפות דורשות בדרך כלל לשנות את מצב המנוע, אז עוקבות קצר f-הרייטינג סולפה.
  8. סל ו/או חלקה הנתונים הגולמיים עם קרנל גאוסיאנית.

3. בסיוע פלורסצנטיות ניתוח של ה-DNA חישול

µL
  1. aliquots 8 להכין 12 עבור כל דגימה באמצעות 1-4 מיקרומטר DNA לכל סטרנד, 12.5 מ"מ MgCl 2 1 x מאגר TE ו 1 x חומצת גרעין ג'ל כתם של דימתיל סולפוקסיד 10,000 x מניות. הפוך פקד שלילי עם שום דנ א, אך כוללות חומצות גרעין ג'ל הכתם.
  2. להעביר את aliquots צלחת PCR בזמן אמת, לאטום עם סרט דביק (למשל, צלחת 96-ובכן התגובה).
    הערה: בטמפרטורות גבוהות בשימוש התרמי חישול פרוטוקולים יתפוגג דגימות. לפיכך, ודא כי הבארות חתומות באופן הדוק עם סרט דביק כדי למנוע עלייה אידוי וריכוז מים, במיוחד במהלך ניסויים ארוכי טווח.
  3. Centrifuge את הצלחת ב g x 100 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר את בועות הגז; אם להרחיב בועות הגז, לא יכול להיות מנותח הבארות.
  4. לטעון את הצלחת אטום לתוך מערכת ה-PCR כמותי בזמן אמת-
  5. להפעיל תוכנית מחזק. Denature ה-DNA ב 90 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ירידה הטמפרטורה במהירות כדי 72 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הקטנת הטמפרטורה באיטיות ב- 0.5 מעלות כל 30 דקות. אחרי האות נבלם, להאיץ את הרמפה טמפרטורה.
    הערה: 72 ° C הוא מספיק מעל הטמפרטורה הכלאה אמיתי; כך, האות נרשם על טווח טמפרטורות רחב המתאים לקביעת טווח הטמפרטורה הדרושים.
  6. לוודא המכסה של הצנטרפוגה מחממת עד לפחות 100 ° C כדי למנוע עיבוי מדגם המתאיידים בסרט דבק.
  7. במהלך ההרכבה, לרגש את הדגימות עם לייזר ארגון-יון-488 ננומטר ולגלות את זריחה ב- 550 ננומטר בעת שימוש כתם ג'ל חומצת גרעין (או spectrally דומה). על צבעים אחרים, בחרו שילוב המתאימים עירור/פליטה. למדוד את האות פלורסצנטיות לעיתים קרובות ככל האפשר כדי להגדיל הכולל איכות אות באמצעות המצלמה המובנית.
    הערה: כאן, מדידות נלקחו כל 9 ס
  8. אם נמס מראש, חישול תוכניות מיושמים, להשתמש בתוכנה שסופקו כדי לנתח את הנתונים. אם לא, להחסיר את הערך הממוצע הקודם מ הערך הממוצע עבור כל שלב טמפרטורה להשגת השינוי היחסי של האות פלורסנט.

4. AFM הדמיה

  1. קליב נציץ (למשל, נציץ " V1 ") על ידי הצמדת זמינים מסחרית דבק לשדוד אותו; להסיר את השכבה העליונה של נציץ.
  2. שימוש של micropipette, להפקיד הקבועים מראש n HT במ ג 2 + המכיל מאגר מתקפלים על מישה טרי cleaved ולתת לו להסתפק 10 דקות
  3. לסובב את הדגימות במרווחי זמן קצר 3-s-g x 2,000 על צנטריפוגה שולחן קטן כדי להסיר את הנוזל הנותר. מספר n. השודדים עדיין צריכה להיות מחוברת אל פני השטח נציץ.
  4. להשתמש טיפ זיז עם מנדנד גבוהה (למשל, 54 Nm -1) ולקבוע את תדר תהודה עם התוכנה AFM פנימי.
  5. שיא הפרופיל גובה עם AFM באוויר ב הקשה מצב בקצבי סריקה נמוך (למשל, 1 קו/s) כדי למנוע פגיעה או ועקרו מבתיהם את n HTs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההרכבה של צינוריות הדנ א באמצעות רמפה טמפרטורה (איור 2) היא שיטה אמינה. כדי ליצור פולימרים semiflexible מלאכותיים אלה. פולימרים אלה בעלי מאפיינים דומים לכלים המקבילים המתרחשים באופן טבעי, כגון חוטים אקטין, אך מספק מסגרת ניסיונית הרבה יותר רחב שכן תכונות מכניות שלהם יכול להיות מכאנית ופיקודית שינו9,27 . כמו biopolymers, הם מארגנים ברשתות (איור 3), ליתר דיוק לאפשר אחד לבחון את ההשפעה של הקשיחות פילמנט בצובר מבנים ומאפיינים. כפי שמוצג באיור4, רשתות אלה מציגים משטר זן ליניארי עבור זנים עד 10%, אשר הדומה המאפיינים של רשתות של אקטין חוטים. בתוך המשטר, גזירה קווית rheology ניתן בקלות להחיל, למשל, כדי לקבוע את התגובה אלסטיות וחוזק צמיגה של ה-DNA nanotube רשתות ובחן תדרים שונים9. בדיקות אלה לחשוף אותן רשתות בעיקר מתנהגים elastically (איור 5). בניגוד מדידות עם חלבונים, הצינורות האלה לא denature-ממשק מים אוויר של המדגם לכן, מתוחכם פסיבציה אסטרטגיות הנדרש (איור 6). לכן, הטיפול בדגימות די פשוטה, הוכיחה להיות מאוד חזקים, מניב תוצאות עקביות עם וריאציות מדגם-כדי-sample נמוכה.

עם זאת, השאלה אם "דביק הפנויות" של אינטראקצית חד גדילי DNA בשני הקצוות של כל שפופרת יכול לגרום הכלאה בלתי רצויה, סטוכסטי אירועים נשארו. כדי לטפל חשש זה, רצפים משלימים "סיים את הכובע", המכסה את הקצוות של הצינור נוספו המדגם לאחר תהליך הכלאה הושלמה. עם זאת, איור 7 ממחיש כי מיצוי את קצוות חוטים לה כל השפעה לזיהוי, כי קצות צינור אל תגרום / השפעה ארעית crosslinking ב רשת9. דבק אירועים רק לשחק תפקיד משמעותי כאשר המדגם מתבצע גם בערך ולשבור הצינורות עקב pipetting קשה. נקודות שבירה אלה אכן מופיעים לזירוז crosslinking אפקטים, שמוביל תגובות שאינו ליניארי של המערכת, כגון זן stiffening (איור 8).

אם הדגימות הן שהוכנו בקפידה, הם יכולים לשמש כדי לבדוק את ההשפעה שיש ריכוז נימה (איור 9 א) או נוקשות (איור 9B) נימה9 על התכונות המכאניות של רשתות המורכב פולימרים semiflexible. בפעם הראשונה, החיבור כמותית בין פילמנט נוקשות גמישות הרשת היה למד השפעול באופן שיטתי, מניב התנהגות חוק כוח לינארי, אשר סותרת תחזיות תיאורטיות הדומיננטית. תוצאות אלו ממחישים כי ה-DNA צינוריות הן כלי חדש, תכליתי כדי לחקור את ההשפעות של פולימרים semiflexible, אשר היו בעבר ניסיוניים שאינם נגישים9,27. עכשיו, התיאוריות השונות יכול השפעול להיבדק, הכוללים הצהרות על יחסי תלות באורך lp ההתמדה של חוטים. בנוסף, אפקטים מאוד בסיסי, כגון reptation (איור 10), יכול ייחקרו מזוויות שונות על ידי העסקת צינורות אשר נבדלים נוקשות.

שם רצף
U1: a1 *-b1 *-a2-b2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
ו- U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
U11: a11 *-b11 *-a12-b12 AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
T4: a4 *-b4 *-a1-b1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
סוף קאפ A1 CCTAATCGCC
סוף קאפ A2 CCTTTAGATCC
סוף קאפ A3 CCACTCTTCC
סוף קאפ A4 CCGTGAGAACC
סוף קאפ A5 CCGCACGACC
סוף קאפ A6 CCAACGATGCC
כובע קצה A7 ATGCACCTCC
סוף קאפ A8 AACGGTAACTA
כובע סוף B1 * ACGCTAAGCCA
כובע סוף B2 * ACCAGATACA
כובע סוף B3 * ACAAGATGTCA
כובע סוף B4 * ACGCATTGCA
כובע סוף B5 * ACTGTCGAACA
כובע סוף B6 * ACTTCTATCA
כובע סוף B7 * CATTCAAAGCT
כובע סוף B8 * TCCCAAGTCA

טבלה 1: דוגמה של ה-DNA רצף של הכלאה nHTs המוצגים איור 1C, אשר שימשו גם במחקרים קודמים על nHTs9, class = "xref" >,2627,28. סט נתון של רצפי מאפשר ההרכבה של שבעה ארכיטקטורות צינור שונה (למשל, a1 hybridizes עם a1 משלימים רצף *). אחרים ארכיטקטורות צינור לא ניתנה כאן יכול להיווצר גם על ידי חיבור או חיסור של קווצות מלווה את cyclization עפ י של גדיל n U1.

Figure 1
איור 1: צינור הרכבה ואדריכלות. (א) תיאור סכמטי של ההרכבה של 4HT יצרו של ארבעה ברורים 42-מרס. גדילי הדנ א חד-גדילי סמוכים hybridize דרך תחומים מתחלפים רציפה של 10-11 בסיסים, שמסומן על ידי קרציות ארוך שחור (הקרציות שחור קצר לציין unhybridized בסיסים). מוטיב זה חצי-מעד כולל קצוות דביקים משני הצדדים לאורך הציר, המאפשר צמיחה צירית, שמציין החץ. הגדילים גבול U1 ו- T4 גם כוללים תחומים משלימים, ובכך יוצרים טבעת סגורה, כפי שמציין החץ ימינה. שים לב כי המערכון הזה הוא ייצוג 2D; במצב hybridized, הגדילים יוצרים זוגיות helices, כל הבסיסים משויכים. (B) Quasi-3D שתתמודדו tetramer 4HT עם שני כפול helices מכוסה בשכבה מרוחק מוצל. Helices כפול, טופס משלים, קשורים שני helices כפול סמוכים של הצינור פעם אחת עבור כל יחידת אורך רכיב. גדיל אחד של U2 מצויר עבה על בהירות. (ג) דוגמאות של ארכיטקטורות שונות צינור שבע ינתנו במספרים סטרנד החל 4 HT כדי 14 HT ו- lp הנע בין 1.2 ל- 26 מיקרומטר. (D , E) Epi-פלורסנט תמונות של Cy3-ידי, הספוחה 5 HT ו- 10 HT להמחיש את stiffnesses שונים באמצעות קווי המתאר באופן שונה מעוקל. הכיסוי האדום הוא קו המתאר פילמנט מצא דרך ניתוח התמונה, עם מרחק מקצה-לקצה R ו- l אורך מתארג. איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: טמפרטורה הרמפה והרכבה המקביל של צינוריות דנ א. (א) ה-DNA צינוריות הם התאספו thermocycler באמצעות פרוטוקול המכיל שטמפרטורה נפרדים מספר צעדים מעל בערך 11 ח' (B) מערכת ה-PCR כמותי בזמן אמת, השינוי היחסי של אותות פלואורסצנט של קווצות מוכתם הוא מדד עבור שהוקם כפול גדילי DNA תוך עובר את הרמפה טמפרטורה. בהתאם לסוג ה-DNA צינוריות, הקצב הרכבה יכולים להיות שונים. מורכבת יותר היווצרות מבנה, רחבות ההרכבה, ככל הנראה מאז גדילים נוספים (, ולכן יותר מגזרים עם רצפים שונים וטמפרטורות מחזק מקומי) צריך hybridize-העמדות המתאים, תהליך אשר מונעת על ידי . תנודות תרמי סטוכסטי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג AFM תמונות של רשת סבוכה של 8HTs ב 4 מיקרומטר. לפרופיל גובה של רשת preformed של 8HTs נספג על משטח נציץ הוקלט במצב הקשה באוויר. AFM תמונות להמחיש הקרנה 2D של הרשת אך אינן מאפשרות להפקת אמין (למשל, רשת שינוי גודל) לנתוני המקרה 3D מאז הצינורות, כמו גם את הרשתות נדחסים בתצורת 2D. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: טווח ליניארי. זן מדידות (G' = 1 הרץ) לחשוף רחבה ליניארי אלסטי מישור, ללא סימנים של crosslinking תופעות כגון מפגין התנהגות שאינו ליניארי כמו זן התקשות. מעל זן אופיינית (שונה עבור כל nHT), המודולוס מישור אלסטי שוברת את בלתי הפיך. קווי השגיאה כל לייצג סטיית התקן של הערך הממוצע של כל המדידות שבוצעו. איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תדר טיפוסית התלות של רשת סבוכה 6HT. רשתות של ה-DNA צינורות להציג רמה גמישות רחב על פני ארבעה סדרי גודל, תלוי בתדירות יישומית. כצפוי לרשת פולימר, החלק האלסטי (G') של הטיה מורכבים מודולוס זה גבוה יותר משמעותית מאשר החלק צמיגה (G'). איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: אין תופעות אוויר נוזלי ממשק. תדירות מטאטא (f-מטאטא; וγ = 5%) של 8HT דגימות ב 8 מיקרומטר חשף כי ההשפעה של אידוי ואפקטים gelation-הממשק מים אוויר הם זניחים. פעמים equilibration שונים, כמו גם שתי שיטות ידועים כדי להפחית באופן דרסטי חלבון קיבוץ באשכולות על הממשק (פיתחה ושומנים), שימשו. בלתי תלוי של השיטה, אין אינדיקציה של השפעות דרסטית על-ידי אידוי או משטח אלסטיות נרשמו. כאן, G' מייצג את הנפח ו- G ' מייצג את המודולוס צמיגה (קווים מקווקווים). איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: אין השפעה של שינוי סוף. מישור אלסטי המודולוס נשארת קבועה כאשר מיצוי הפנויות דביק של 8HTs עם רצפי משלימים המתאימים שלהם. איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: ההשפעה של הפרוצדורות של ה-DNA preformed רשתות במדידה. תלוי איך הרשתות preformed מטופלים לאחר הכלאה, המדידות עשויים להיות שונים. בדוגמה זו, זרימת הטיה במהלך pipetting של הנאנו DNA כבר השתנו באופן דרסטי, צינורות שבר מטופל גם בערך. שבירה מוביל אינטראקציות בלתי רצויים בין נחשף, משלימים חד-גדילי מתאם את מקטעי שבור או קרע, אשר מובילה לעליה הגמישות ומשרה אפקטים ליניארי, sאוך כמו זן מרווה (עלייה של גמישות עבור זנים גדולים, ירוקים עקומה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: DNA צינוריות מאפשרות חקר יחסי תלותp l. (א) לומד רשתות של פולימרים semiflexible עם nHTs מאפשר החקירה של התגובה מכני של המערכת עם הגדלת ריכוז (ריכוז מטאטא), מקביל מחקרים המבוססים על biopolymers כמו אקטין. (B) בנוסף, ארכיטקטורות שונות של הצינורות להקל על הקביעה של התגובה מכני ביחס lp בדרגות שונות של חוטים המשמש כבסיס, וזה כהצפנה עם באופן טבעי פולימרים semiflexible. למטרה זו, הנתונים מ- A הוא replotted לפנות את קנה המידה של המודולוס מישור אלסטי ביחס lp. קווי השגיאה כל לייצג סטיית התקן של הערך הממוצע של כל המדידות שבוצעו. איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10: גודל Reptation ואת רשת. הקלטת תמונות זריחה של חוטים reptating (התווית על-ידי יחיד DNA 8HT מוטבע ברשת ללא תווית; c = 14 מיקרומטר) יכול לשמש כדי לאמת את אופי חוטים ברשת סבוכה. תופעות crosslinking לעכב זה דיפוזיה חד-ממדי. שיבוץ: ניתוח Reptation יכול לשמש כדי לקבוע את גודל רשת שינוי קנה מידה עם ריכוזים, אשר משווה טוב למידות אקטין ומסכים עם תחזיות תיאורטיות30. קווי השגיאה כל לייצג סטיית התקן של הערך הממוצע של כל המדידות שבוצעו. איור מקורי ואחSchuldt9. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשיג רשתות בנוי כראוי, בהרכבת הנאנו DNA היא צעד חיוני. שגיאות במהלך תהליך סינתזה השפעה שלילית על איכות צינור; לכן, מומלץ כי hplc, קורס או תהליך מחמירים יותר לשמש כדי לטהר את oligonucleotides. מאז היווצרות דיסקרטית במקום צינוריות DNA צבור, וכן הפצה האורך שלהם, תלוי סטויכיומטריה equimolar של oligonucleotides בוחרים n בתוך הקבוצה, יש צורך remeasure ריכוז של גדילי שנרכשו, מאז שניתנה ערכים יכול להשתנות באופן משמעותי הריכוז בפועל. זה יכול להתבצע, למשל, על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis-גל ספיגת של 260 ננומטר. אנו רוצים לציין כי מולקולרית משקולות, המקדמים של הכחדה משתנות בין הרצפים שונים; לכן, צריך להיות נחוש את הערכים כדי לתרגם את ספיגת לתוך ריכוז עבור כל oligonucleotide דנ א. בעת שימוש בציוד אופטימיזציה עבור אמצעי אחסון מדגם קטן, כגון NanoDrop, כל נקודת מדידה צריכה להיות לקחו מספר פעמים, בממוצע. לעלות בקנה אחד עם טווח גילוי של ספקטרומטר ליניארי. לדלל את השבר המשמש לקביעת ריכוז במידת הצורך. אי דיוקים קלים עלולה להיות השפעה גדולה על סטויכיומטריה הנכונה ועל האיכות של היווצרות צינור; לכן, pipetting הגדילים יחיד חייב להיות מדויק ככל האפשר. לאחר מכן, הפתרון הסופי מדגם אמור. להיות מעורב ביסודיות על ידי לאט pipetting למעלה ולמטה המדגם לפני הנחת לתוך thermocycler. אם גדילי השתנו עם צבעי פלורסנט להמחשת, כל הצעדים צריכה להתבצע בסביבה מפני אור ישיר, ותוספת מאוחרת יותר של סוכנים אנטי-הלבנת הוקמה (קרי, חמצן ניקוי מערכות, כגון גלוקוז אוקסידאז/קטלאז) מומלץ. לאחר הגדילים יחיד יש מספר בתנאים מאגר נכון, רמפה טמפרטורה מוחל על hybridize המבנים (איור 2 א). דפוס טמפרטורה זה עוקב אחר הטמפרטורה הכלאה הקריטי שנקבע בעבר, איפה ה-DNA כפול helices טופס. פותחו מספר שיטות כדי לנתח קינטיקה הכלאה DNA (קרי, יליד DNA UV ספיגת31, calorimetry32או צבעי פלורסנט33). בשיטה השנייה, צבעי intercalate לתוך ה-DNA כפול helices, ויוצרים מתחמי מאוד ניאון בהיר יותר צבעים לא מאוגד. הם לוחצים חלקית גדילי כפול אך לא חד-גדילי הדנ א34. לכן, כגון צבעי הוחלו על לפקח על ננו-מבנה ה-DNA הרכבה עצמית בתוך המערכת35 , יכול לשמש כדי לזהות מכלול אידיאלי תנאים.

בתחילה, כל DNA גדילי כפול בתוך המדגם, כגון דופלקסים מוגדרים מראש, unpredicted, הם שפגע בסימני בטמפרטורה גבוהה (90 ° C) כדי למנוע זיווג הבסיס לא מכוונות. ירידה הדרגתית עוקבות טמפרטורה (בדומה איור 2A) מפחית את התנועה התרמית של גדילי ה-DNA, הפעלת אירועים הקילוף הבסיס. עקב צמצום אנרגיה חופשית, גדילי הדנ א מעדיפים hybridize-רצפים המשלימים שלהם. בעת החלת צבע intercalating dsDNA ספציפיים, הבהירות מגדיל עם הקמת מתחמי פלורסנט מאוד, אשר בתורו הוא מדד כמותי עבור שהוקם כפול גדילי הדנ א34. השינוי היחסי של האות זריחה על היווצרות של 4HTs ו- 8HTs ההתוויה של איור 2B. השינוי היחסי מחושב לפי ממוצע של עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור כל טמפרטורה, לאחר מכן החסרת הערך הממוצע של הטמפרטורה הקודם. עם הטמפרטורה יורדת, ניתן ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברות זוהה (איור 2B) ולאחר הפסגה של עקום זה מדגיש את הטמפרטורה שבו מתרחשים אירועים הכלאה מסיבית. הירידה של העקומות מתייחס ערכי העוצמה להגיע מישור. בהתאם דנ א הבונה את המורכבות שלה (למשל, קווצות סט קטן או גדול של ה-DNA), הפסגה ניתן שארפ (איור 2B, עקומת כחול) או רחבה (איור 2B, עקומת ירוק). במידת האפשר, זה צריך להיבדק על כל המבנה החדש תוכנן להבטיח כי חלק הרמפה הטמפרטורה יורדת בהדרגה מכיל את הטווח שבו מתרחשת היווצרות של צינורות דרך היווצרות של מקטעי hybridized dsDNA. לאחר הטמפרטורה המתאימה המשטר נקבע, nanostructures יכולים להיות מורכבים בהצלחה טווחי טמפרטורה צר מאוד (איור 2B, עקומת כחול), או אפילו isothermally35. שימו לב: הכלאה של DNA מרובים קווצות בפומפיה תקופתיים גורם שיתופית מחזק אפקטים35,36, אשר תומך חישול DNA נוספות. זה יש לקחת בחשבון כי צבעי intercalating למתוח את הדנ א helices מעבר שלהם סטנדרטי 10.5 בסיסי זוגות לכל סיבוב הסליל תצורה, ובכך שינוי הצורה הגיאומטרית הכוללת של הצינורות. לכן, לא מומלץ להרים את הריכוז לצבוע מעל מולקולה אחת לכל דנ א 900 בסיסים35. יתר על כן, הטמפרטורה הרכבה שיא עשוי לחרוג ממנה טמפרטורה אופטימלית מחזק בפועל. כדי להשיג דיוק גבוהה וכדי לקבוע את מצב הפעולה הטובה ביותר עבור צינור היווצרות, הכלאה דנ א צריך להיחקר במהלך לאט שינוי טמפרטורה שלבים רבים, אשר צריכה להיות בדקתי פעמיים עם agarose בג'ל. על המקרה של הנאנו דנ א, הקמנו פרוטוקול שלושה שלבים. ראשית, המדגם מחומם עד 90 ° C כדי denature את ה-DNA לתוך גדילי יחיד. לאחר מכן, בטווח טמפרטורות רחב (סביב הפסגה הרכבה של האות קרינה פלואורסצנטית) מכוסה. במקרה שלנו, מגוון של 10 ° C מכוסה, החל 65 ° C עד 55 ° C, בצעד של -0.5 ° C בכל 30 דקות. בשלב הסופי, הטמפרטורה צריך במהירות להביא לטמפרטורת החדר - או, כמו במקרה שלנו, 20 ° C - כדי למנוע באינטראקציה שלילי בטמפרטורות ביניים (איור 2 א). בדרך כלל, thermocyclers חום דגימות מן הטמפרטורות קר. לכן, חשוב להתאים את הטמפרטורה של המכסה בהתאם להגבלת האידוי של נוזל במדגם במהלך ההרכבה, אשר מגביר את הריכוז הסופי מדגם.

אם nHTs נוצרות כראוי, הם לארגן לתוך רשתות סבוכה גרידא (איור 3), ללא אינטראקציות גרימת תופעות crosslinking בין צינורות ברורים. Crosslinks ככל הנראה תוצאה של מקטעי DNA אינטראקצית הארכת פגמים לאורך צינור או קצוות דביקים, חופשייה לשייך משלימים חד גדילי המקטעים בכל הצינורות הסמוכים. תופעות אלו זירוז מאפיינים לא לינאריות, כגון זן התקשות (הגדלת G' עבור זנים גדולים יותר), אבל הם נעדרים ב מסובכת רשתות (איור 4). Γ המוצג-ואת הקריפים חושפים גם המשטרים זן ליניארי המתאים למדידות rheological באופן כללי. מעל לסף מסוים, הרשת ציסטות נקרעות או מאבד קשר עם לוחיות הרישוי. של rheometer, אשר גורם נזק בלתי הפיך למערכת. לכן, זנים יישומית צריך להיות במשטר ליניארית כדי לקבל מידע אמין. בדרך כלל, זן של 5% מספיקה להניב נתונים מעל המשטר רעש. ניתן להחיל זנים גבוהים יותר; עם זאת, הם ניגשים בקלות את הסף קרע, תוצאות וניתן falsifiאד עקב מדידה המשטר לא לינאריות.

מדידות rheological דורשים הכנה זהירה, עקבית של המדגם, לשקול בזהירות פרוטוקולים מדידה כדי להשיג תוצאות interpretable הדירים. הנקודה המרכזית היא ליצור רשת אקראי לחלוטין, איזוטרופיות בין הלוחות rheometer מאז רשתות אלה הם בעיקר המבנה רק לשחזור. לכן, פעמים equilibration ארוך למדי (בדרך כלל בסביבות 2 h, לעיתים אף יותר) יש צורך לפזר שום תופעות הזמנת המתרחשים כתוצאה הנוצרות על-ידי הטיה יישור במהלך pipetting המדגם. Pre-test ניסויים מומלצים עבור הקלטה ההתפתחות זמן (זמן סריקה) של המערכת במהלך equilibration על מנת לקבוע את מסגרת הזמן הדרוש. ברגע האותות להגיע מישורים ללא שינויים נוספים, המערכת equilibrated. פעם אחת equilibration תנאי שנקבע, הבדיקות הרצויות, כגון זן הרמפה או f - או γ-מטאטא, שניתן לבצע. בדיקות קשת רחבה של זנים יכול להרוס בסופו של דבר את הרשת או את החיבור אל צלחות. עם זאת, אם בדיקות מוגבלים זנים מתחת לסף קרע, רמפות זן ו מטאטא יכול iteratively לחזור לחקור תופעות הזדקנות או היסטרזיס האפשריות. במקרה של f-מטאטא, מדידה פעמים יכול להשתנות באופן משמעותי. בדיקות תדרים נמוכים באופן משמעותי מאריך את הניסויים, מאז תנודה אחת עשוי להימשך מספר דקות. שימו לב, במקרה של n. השודדים, f-מטאטא מגלה כי הנפח G' חורג המודולוס צמיגה G' מאת כ אחד סדר גודל, אשר מדגים את התגובה אלסטי הדומיננטית של מערכות אלה ( איור 5). בדרך כלל, סוגים שונים של ניסויים יכולה להיות מלווה קצר f-מטאטא לפני ואחרי הניסוי הראשי כדי לוודא כי המערכת נותר מופרעת על ידי המדידה עצמה. עם זאת, יש כמה מכונות לשנות את מצב המנוע המשמש כבסיס עבור סוגים שונים של מידות, במיוחד בעת שינוי דינמי ניסויים (למשל, תנודות עבור f-מטאטא) כדי רמפה מתח סטטי. שינוי זה מלווה לעיתים קרובות ספונטנית זנים גדולים להרוס את הרשת, ומרככים מדידות עוקבות. לכן, מומלץ לבדוק את המפרט של rheometer פעם.

ראולוגיה ניסויים במערכות מבוססות-אקטין חושפים אפקט דרמטי של דנטורציה של חלבונים המתרחשים ממשק מים אוויר של המערכת. חלבונים שפגע בסימני לדבוק unspecifically אחד את השני, ובכך יוצרים ג'ל צפוף זה יכול מאוד לשלוט התכונות המכאניות של המערכת כולה. כדי למנוע מגע ישיר של הדגימה עם האוויר הסובב, טכניקות פסיבציה גם לדכא את האידוי של מים בתוכן הדגימה יכול לשמש. שלוש שיטות אפשריות הן: (i) סביב תא הדגימה עם המאגר אותו כמו הדגימה; (ii) באמצעות את פיתחה כדי לכסות את הממשק עקב חזקותיה הידרופוביות, הידרופיליות (חייבים להקפיד, מאז פיתחה קצת להפריע הייצורים החיים פולימר); או (iii) העסקת שומנים תואם יותר מבחינה ביולוגית, עם תופעות דומות כמו פיתחה. יצוין כי n. השודדים לא נמצאו להיות נתון דנטורציה אפקטים על הממשק, התוצאות תלויות בשיטת פסיבציה (איור 6), מה שמבטל את מקור פוטנציאלי העיקריים של שגיאה. בדרך כלל, תא הדגימה צריך להחתם תמיד עם כובע, אשר יכול להיות מצויד ספוגים רטיבות להגברת הלחות בבית הבליעה, דיכוי אידוי.

כפי שתואר בקצרה בעבר, מקור השגיאה פוטנציאלי במערכות מבוססות DNA הוא unhybridized ה-DNA, כגון דנ א חד גדילי אינטראקצית חופות סלעיות פגמים או בקצוות של הנאנו, אשר עלול לגרום לתופעות crosslinking נוספים. לחקור ו/או לשלול את האפשרות הזו, גדילים קצרים משלימים ניתן להרוג את הקצוות הדביקים האלה. עם זאת, חקירות משלנו הראו כי תוספת בהגבלת גדילי אין השפעה על הציג n. השודדים, אופן הפעולה של הרשתות סבוכה נשארה ללא שינוי (איור 7). עם זאת, מיצוי קצוות דביקים עם רצפי משלימים יכול להיות שימושי עבור מערכות אחרות מבוסס DNA (ומורכב יותר) לדכא אינטראקציות בלתי רצויה. בנוסף, דגימות של nHTs צריך להיות pipetted בזהירות (למשל, דילול צעדים, הכנת הדוגמא) כדי למנוע נזק מבזק או אחרים הצינורות. אם הפתרון הוא pipetted גם בערך, הצינורות לשבור ללא שליטה, חשיפת מספר רב של קצוות דביקים בנקודות פגם, המוביל לא רצויות, אינטראקציות בין צינורות crosslinking פוטנציאליות במערכת. זה משבש את האות ומוביל אל stiffening תופעות, כמו גם תופעות לא לינאריות כגון זן התקשות, אשר הופך לגלוי בγ-מטאטא (איור 8). לפיכך, pipetting הפתרון סבוכה רק לעשות לאט ושימוש פיפטה טיפים בקוטר גדול (חיתוך סוף טיפ פיפטה, מומלץ) כדי להפחית את ההטיה כוחות על הצינורות.

לסיכום, ה-DNA nHTs הם מערכת מודל מתאים וישימה מאוד ללמוד על פולימרים semiflexible ואף לרשימת תפוצה רשתות של חוטים אלה, המייצג את סוג חדש של hydrogels מכנית tunable. אם הצינורות מוכנים בקפידה, הם יכולים לשמש כדי לבחון את ההשפעה של lp של חוטים במקרים שונים. המדד rheological בצובר של מסובכת רשתות, למשל, מגלה כי התלות תיאורטית החזוי של הנפח עם ריכוז ו- lp עולה בקנה אחד עם נגזרת השפעול שינוי קנה מידה חוקים (איור 9)9. מחקר זה מדגיש כי ניתן להגדיל את האלסטיות של רשת על-ידי הגדלת את הנוקשות של פולימרים המשמש כבסיס. באופן מסורתי, הגדלת את הנוקשות של הידרוג הושג על-ידי הוספת פולימרים יותר לפתרון או על ידי גרימת crosslinks (פיזי או כימי) בין פולימרים שכנות37,38. עם זאת, תוכן מולקולרי גבוה יותר קשורה גם גודל רשת מופחתת, אשר יכול להגביל יישומים כגון תרבית תאים תלת-ממד. Crosslinks, מצד שני, יכול לגרום שינויים מורפולוגיים מורכבות בתוך הארכיטקטורה הרשת הבסיסית, אשר מסבך עוד יותר את כוונון מדויק של תכונות מכניות39. באמצעות רשתות של n. השודדים, אולם, מאפשר מלאה סופגת של פרמטרים אלה, לפיה ההשפעות stiffening יכולה להיגרם על ידי לשנות אך ורק את הנוקשות של חוטים הבסיסית כל עוזב את גודל רשת ללא שינוי. יתר על כן, ארכיטקטורות שפופרת במיוחד הרקעים להשתלב באופן סלקטיבי אפקטים נוספים, כגון crosslinking, אשר, בדומה ברשתות סבוכה, יוצר עוד יותר אפשרויות לבדוק השפעול תחזיות תיאורטיות עבור פרמטרים כגוןl p או crosslink גודל וכוח עבור רשתות. באופן כללי, הארכיטקטורה ניתן לתיכנות מרחיב את היקף יישומים, המאפשר לימוד lp-אפקטים תלויה לא רק בכמות גדולה, אלא גם ברובד מולקולה בודדת. ניתן להטביע את צינורות שכותרתו לרשת ללמוד, למשל, את התלות של lp בהתנועה חד-ממדי של נימה בבידוד כמו שפופרת, שבדרך כלל נקרא reptation (איור 10)9. אם זו תנועה המפזרת גלוי, זה גם מאמת את הטבע סבוכה של הרשת, מאז זה להיחסם על ידי crosslinking אפקטים. לנתח את הדינמיקה הבסיסית גם חושף את גודל רשת של הרשת. יתר על כן, הצינורות האלה יכול לשמש כדי לחקור את התלות של הקשיחות ואת כיראליות הצינורות המשמשים כבסיס על היווצרות של חבילות40,41,42,43, 44 , מבנים 45 או מסדר גבוה, כגון asters כמו כוכב46,47,48,49,50, אשר יכולה להיגרם על ידי אפקטים crosslinking או באמצעות סביבות מולקולרי צפוף27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר מימון מאת DFG (1116/17-1), את לייפציג בבית הספר למדעי הטבע "BuildMoNa" (GSC 185). עבודה זו תמכה באמצעות הפרויקט פראונהופר Attract 601 683. T. H מאשר מימון הקרן החברתית האירופאית (ESF-100077106).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 128 Rheology פולימרים semiflexible אורך התמדה צינורות ה-DNA biopolymers אקטין הידרוג רשתות
ה-DNA צינוריות כמו כלי רב-תכליתי ללמוד פולימרים Semiflexible
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter