Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

DNA nanorør som et alsidigt værktøj til at studere Semiflexible polymerer

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Semiflexible polymerer vise enestående mekaniske egenskaber, der er i vid udstrækning anvendes af levende systemer. Systematiske undersøgelser på Biopolymerer er dog begrænset, da egenskaber såsom polymer stivhed er utilgængelige. Dette manuskript beskriver, hvordan denne begrænsning er omgået af programmerbare DNA nanorør, aktivering af eksperimentelle undersøgelser af virkningen af glødetrådens stivhed.

Abstract

Mekaniske egenskaber af komplekse, polymer-baserede blødt materiale, såsom celler eller polymer netværk, kan forstås i hverken klassisk ramme af fleksible polymerer eller af stiv stænger. Underliggende filamenter forbliver udstrakte på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed, som skal være talbestemt via persistens længde (lp), men de er også underlagt stærke termisk udsving. Deres begrænsede bøjning stivhed fører til unikke, ikke-trivielle kollektive mekanik af bulk netværk, gør det muligt for dannelsen af stabil stilladser på lav volumenbrøkerne samtidig store maskestørrelser. Dette grundlæggende princip er udbredt i naturen (f.eks. i celler eller væv), minimere høj Molekylær indhold og dermed lette diffuserende eller aktiv transport. På grund af deres biologiske virkninger og potentielle teknologiske applikationer i biokompatible hydrogels, har semiflexible polymerer været genstand for betydelig undersøgelse. Men forståelige undersøgelser forblev udfordrende, da de har påberåbt sig naturlige polymerer, såsom actin filamenter, der ikke er frit afstemmelige. På trods af disse begrænsninger, og på grund af manglende syntetiske, mekanisk afstemmelige og semiflexible polymerer blev actin filamenter etableret som den fælles modelsystem. En stor begrænsning er, at centrale mængde lp ikke kan indstilles frit for at studere dens indvirkning på makroskopisk bulk strukturer. Denne begrænsning blev løst ved at ansætte strukturelt programmerbare DNA nanorør, gør det muligt for kontrolleret ændring af glødetrådens stivhed. De er dannet gennem flise-baseret design, hvor et diskret sæt af delvist supplerende tråde krydse sig i en ring struktur med en diskret omkreds. Disse ringe indslag sticky ender, muliggør den effektive polymerisering til filamenter flere mikron i længde, og vise lignende polymerisering kinetik som naturlige Biopolymerer. På grund af deres programmerbare mekanik er disse rør alsidige, Roman værktøjer til at undersøge virkningen af lp på enkelt-molekyle samt bulk skala. I modsætning til actin filamenter, de forbliver stabil i løbet af uger, uden bemærkelsesværdige degeneration, og deres håndtering er forholdsvis ligetil.

Introduction

På grund af de komplekse adfærd aktiveres med deres unikke mekaniske egenskaber, er semiflexible polymerer grundlæggende byggesten af levende materiale. I modsætning til fleksibel polymerer vedtage semiflexible polymerer en fremstrakt konfiguration på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed samtidig stadig underlagt stærke termisk udsving1. Således kan ikke rent stokastiske modeller anvendes på deres adfærd, som med ekstremer af fuldt fleksibelt eller stift polymerer. Den såkaldte ormelignende kæde model2,3,4 blev udviklet for at kvantificere denne stivhed via lp, som er konstanten henfald af tangent-tangent korrelation langs glødetrådens4. Hvis lp er sammenlignelig med den contour længde (lc) af glødetråden, betragtes polymeren semiflexible1. Svarende til polerne i et telt, deres ordninger i netværk eller bundter stabiliserer hele det kollektive system på lav volumenbrøkerne, fører til usædvanlige viskoelastiske egenskaber5,6,7, 8,9. Disse strukturer giver høj elasticiteter på store mesh størrelser10, opretholde mekaniske integritet stadig letter diffuserende og aktiv transport processer. Denne egenskab er især velegnet til biologiske systemer såsom cytoskelettet eller den ekstracellulære matrix, men det er også almindeligt anvendt i fødevarer engineering1,11,12.

Går ud over deres betydning til levende materiale, er det afgørende at grundigt undersøge de fysiske egenskaber af disse strukturer for at have værktøjer til at udvikle biomimetiske materialer eller roman hydrogels. Med hensyn til semiflexible polymerer indebærer dette systematisk bestemmelse af de kollektive egenskaber net som følge af single-filament egenskaber såsom lp og udviklingen af en beskrivende teoretisk ramme. I banebrydende undersøgelser, cellulære polymer actin blev etableret som et modelsystem for semiflexible polymerer og er stadig i vid udstrækning betragtes som guldstandarden5,13,14,15 , 16 , 17. men udtømmende undersøgelser er begrænset med dette system, da de er bundet til de iboende egenskaber af dette protein. Forskellige teoretiske tilgange har til formål at opbygge en beskrivelse af den ikke-trivielle mekaniske opførsel på single-filament niveau og ført til især forskellige skalering forudsigelser for afhængighed af lineære elastisk plateau shear modulus, G 0 (dvs. "elasticiteten" i netværket), koncentration (c) og lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mens koncentrationen skalering er let tilgængelige i eksperimenter med actin-baseret eller andre modelsystemer og mens teoretiske forudsigelser har været strengt kontrolleret13,16,24, 25, skalering med hensyn til lp er forblevet eksperimentelt utilgængelige. Dette, er imidlertid en stor begrænsning, da lp er også en uafhængig variabel, der er definerende mængden af semiflexible polymerer.

Dette centrale, naturlige begrænsning, der fast lp af actin eller andre biologisk afledt polymerer såsom kollagen er for nylig blevet løst ved at ansætte flise-baseret DNA rør, som er afstemmelige i deres mekaniske egenskaber 9 , 26 , 27 , 28. små variationer i arkitekturen af rør (f.eks. forskelligt antal konstituerende DNA strands inden for enhed ring) giver forskellige værdier for lp, som kan evalueres via Fluorescens mikroskopi, enten ved at analysere en svingende tube eller ved at evaluere de buede konfigurationer af flere overholdt rør, som beskrevet tidligere9,28. Disse analyser viste, at lp værdier af de forskellige rør befolkninger varierer over mere end én størrelsesorden og at forskellige evalueringsteknikker give ensartede resultater9,28.

Overraskende, er den samlede skalering af lineære elastisk plateau shear modulus G0 med hensyn til koncentration og lp blevet rapporteret at være i strid med alle tidligere teoretiske tilgange 9, navnlig demonstrerer en meget stærkere end forudsagt afhængighed lp. Disse resultater understreger værdien af en ny modelsystem at studere centrale egenskaberne for semiflexible polymerer. Ansætte n-helix DNA rør dramatisk udvider anvendelsesområdet for disse undersøgelser. Ikke alene kan lp varieres frit uden at ændre den grundlæggende materiale, men den iboende programmerbare karakter af DNA kan aktivere systematisk undersøgelse af yderligere elementer, såsom krydsbindinger eller kinetisk skifte processer. Derudover disse rør er opløseligt i vand, og i modsætning til de fleste proteiner, stabil i passende pH og ioniske betingelser i flere uger, uden påviselig forringelse9.

At samle disse rør, et diskret sæt af DNA oligonukleotider bruges, hvoraf hver indeholder to domæner, der deler komplementær base sekvenser til to tilstødende tråde (på grund af de specifikke sekvenser, en enkelt streng kan ikke danne strukturer såsom hår pins). De komplementære sekvenser krydse sig på et cyklisk måde, danner lukkede, halv-overlappende ringe n sammenkoblet dobbelt heliske segmenter (figur 1A og B). Disse ringe form på en diskret diameter (figur 1 c), og deres halv-overlappende konfiguration udsætter aksial sticky ender supplement til sticky enderne af en anden ring. Denne selektive tilsætning af matchende oligonukleotider udløser en stabling af ringe, fører til den effektive polymerisering af trådformede DNA helix rør af størrelse n (nHT). Deres contour længder typisk måle flere mikron i længden, og deres længde distribution er sammenlignelig med actin filamenter9,26,27,28. Det har vist for lignende DNA nanorør at de faktisk udviser polymerisering kinetik ligner dem af actin filamenter og mikrotubulip class = "xref" > 29. Afhængigt af det antal n af enkelte DNA-strenge, der udgør den grundlæggende ring struktur, kan nHT arkitektur, såvel som dens omkreds og diameter, controllably varieres. Ved hjælp af flere DNA-strenge øger omkredsen af ringe/rør, og den tilsvarende ændring af arkitektoniske skifter de mekaniske egenskaber til højere lp værdier (figur 1 c), svarende til en højere stivhed. På mesoskopisk skala, disse større lp værdier omsættes til mindre bøjet konformationer på grund af den større stivhed (fig. 1 d og E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af n HTs

NOTE: her, n angiver antallet af forskellige enkelt DNA-strenge, involveret i dannelsen af helix rør af en vis størrelse. For n = 8, otte forskellige enkelt DNA-strenge udgør en enhed ring.

  1. Køb DNA sekvenser (HPLC renhed renhed eller højere) fra en egnet DNA syntese service eller udfører høj kvalitet syntese og rensning (eksemplarisk sekvenser som vist i tabel 1).
  2. Resuspend frysetørret oligonukleotider i renset vand og følg yderligere ophvirvling trinene i den tilhørende manual fra virksomheden. Justere mængden af vand for at opnå en endelig koncentration på 200 µM.
  3. Bestem koncentrationer af enkelt DNA strenge for at kontrollere værdierne af forhandleren (f.eks. via UV-Vis spektroskopi på 260 nm) da den præcise støkiometrisk er afgørende for forsamling processen. Beregne koncentrationen af oligonukleotider, under hensyntagen til den specifikke molære vægt og udryddelse koefficient for hver enkelt-strenget DNA oligonukleotid.
    Bemærk: Extinction koefficient værdier i sagens natur variere for de forskellige sekvenser og fremgår af dokumentationen af kommercielt købt DNA. De kan også beregnes efter den nærmeste nabo model ved hjælp af en række frit tilgængelige online værktøjer. For at overholde det lineære område af spektrometret, overveje at fortynde prøver til brug for koncentration bestemmelse.
  4. Ved hjælp af en mikropipette blandes DNA strenge-hver på samme koncentration i en beholder, der er egnet til thermocycler (f.eks. et 200 µL PCR rør) til at danne den ønskede n HTs (endelige buffer betingelser: 1xTE (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8) og 12.5 mM MgCl 2).
    Bemærk: Endelige DNA n HT prøver består af n - 1 strands, U 1 − U n − 1 og én T n strand. Koncentration pr. strand kan variere fra sub-micromolar til mere end 10 µM, alt efter behov af brugeren (f.eks. < 1 µm per strand til den efterfølgende fortynding at observere enkelt filamenter eller højere koncentrationer for undersøgelse af tætte netværk mekanik).
  5. Krydse n HTs i en thermocycler (denaturering i 10 min. ved 90 ° C, med en efterfølgende hurtig drop til 65 ° C, langsom temperaturen falder fra 65 ° C til 55 ° C, med supplerende base parring i 20 temperatur trin -0,5 k i 30 min hver; og en hurtig nedgang fra 55 ° C til 20 ° C); Se figur 2A.
    Bemærk: De langsomme fald skridt fra 65 ° C kan blive forlænget for at øge den gennemsnitlige længde; den efterfølgende hurtig drop til 20 ° C er imidlertid afgørende at undgå en sammenlægning af polymeriseret rør.
  6. Gemme hybridiserede n HTs i op til 3 uger ved 4 ° C uden påviselig forringelse.
    Bemærk: Til fluorescens mikroskopi, mærket n HTs er hybridiseret (delvis) erstatte U1 med den modificerede U1-Cy3 (tabel 1). For længere observation gange, tilsætning af etablerede anti-blegning agenter er tilrådeligt.
  7. Forsigtigt fortyndes prøven til den ønskede slutkoncentration (f.eks. 4 µM til netværk eller 20 nM for single-filament observationer) ved hjælp af prøvebuffer, hvis nødvendigt. For at minimere mulige fejlkilder, samle prøver på den ønskede slutkoncentration.

2. Shear reologi

  1. Vælg en passende geometri (plade-plade eller kegle-plade) til dynamisk shear rheometer. For små mængder (dvs. under 200 µL), bruge den kegle-plade geometri.
  2. Indlæses prøvens på dynamisk shear rheometer.
  3. Passivering grænsefladen luft-vand af prøven og miljø ved hjælp af følgende trin til at forhindre potentielle fordampning virkninger.
    1. Surround prøve med 2,5 mL af prøven buffer bad.
    2. Tilføjer et overfladeaktivt stof lige under micelle koncentrationen.
    3. Bruge en Hamilton sprøjte til surround-eksemplet med en lipid at undgå direkte kontakt af prøven med air.
  4. Forsegle prøven kammer med en hætte, udstyret med våde svampe og, om muligt med en ekstra vandbad (ikke i kontakt med prøven) til yderligere undertrykke fordampning.
  5. Start måling ved hjælp af rheometer-specifikke software ved stuetemperatur; Alternativt, udføre målinger ved forskellige temperaturer, såsom 37 ° C (hvis fysiologiske forhold er nødvendige).
    Bemærk: Køling prøven er ofte ledsaget af kondensation af vanddamp fra den omgivende luft, mens opvarmning fører til øget fordampning. Begge effekter kan ukontrollabelt ændrer koncentrationen af prøven, så alle målinger i en serie skal udføres ved en konstant temperatur.
  6. Tillad prøven til blandingen henstår i 2 timer ved stuetemperatur. Tiden udviklingen kan overvåges med en tid feje (én pr. minut; stamme γ = 5%; frekvensen f = 1 Hz).
  7. Måle de mekaniske egenskaber med de ønskede testprotokoller. Start med en serie af frekvens fejer (f-fejer) fordi de forlader prøven intakt og giver mulighed for flere målinger.
    Bemærk: Derudover kort f-fejer bør udføres før og efter længere målinger (såsom lang f-fejer med en meget højere opløsning) til at kontrollere, at prøven er uændret i hele fuld måling protokollen.
    1. Udføre en kort f-sweep (f.eks γ = 5%; f = 0,01 Hz til 30 Hz; 5 datapunkter pr. årti).
    2. Udfører en lang f-sweep (f.eks γ = 5%; f = 0,001 Hz til 30 Hz; 21 datapunkter pr. årti); lavfrekvente regime kan udelades, hvis det er ikke nødvendigt at reducere måleperioden.
    3. Udføre en kort f-sweep.
    4. Udføre en γ-sweep (fx, f = 1 Hz; γ = 0.0125 100%; 20 datapunkter pr. årti).
      Bemærk: Brug den korte f - feje først, da det er normalt inkonsekvent med tidligere f - fejer fordi netværk normalt briste under γ-feje eller løsne sig fra pladerne. Alternativt kan du bruge γ-rampe (f.eks. = 0,025 s -1, t = 60 s); dog ramper kræver normalt ændre motor mode, så efterfølgende kort f-fejer ville blive forfalsket.
  8. Bin og/eller glat de rå data med en Gaussisk kerne.

3. fluorescens-assisteret analyse af udglødning DNA

  1. forberede 8 delprøver af 12 µL for hver prøve ved hjælp af 1-4 µM DNA pr. strand, 12,5 mM MgCl 2 i 1 x TE buffer og 1 x nukleinsyre gel pletten fra en 10.000 x DMSO Stock. Gøre en negativ kontrol med ingen DNA, men omfatter nukleinsyre gel pletten.
  2. Overføre delprøver til en real-time PCR-plade og forsegle med selvklæbende film (f.eks. en 96-brønd reaktion plade).
    Bemærk: De høje temperaturer bruges i den termiske udglødning protokoller vil fordampe prøver. Således, Sørg for, at brøndene tætsluttende lukket med selvklæbende film til at forhindre vand fordampning og koncentration stigning, især under langsigtet eksperimenter.
  3. Centrifugeres plade på 100 x g i 1 minut ved stuetemperatur til at fjerne gasbobler; hvis gasbobler udvide, brøndene kan ikke analyseres.
  4. Indlæse de forseglede plade i en real-time kvantitativ PCR system.
  5. Køre en udgloedning program. Denaturere DNA ved 90 ° C i 10 min. Drop temperaturen hurtigt til 72 ° C. Derefter, mindske temperaturen langsomt med 0,5 ° C hvert 30 min. Efter at signalet er henfaldet, fremskynde temperatur rampen.
    Bemærk: 72 ° C er tilstrækkeligt over den virkelige hybridisering temperatur; således, den er optaget over et bredt temperaturinterval egnet til bestemmelse af den nødvendige temperaturområde.
  6. Sørg for at låget af cycler varmer til mindst 100 ° C til at forhindre kondensation af fordampet prøve på den selvklæbende film.
  7. Under montagen skal vække prøverne med en argon-ion laser på 488 nm og opdage fluorescens på 550 nm ved brug af en nukleinsyre gel plet (eller spektralt lignende). For andre farvestoffer, vælge en passende excitation/emission kombination. Måle fluorescens signal så ofte som muligt at øge samlet signalkvalitet ved hjælp af den indbyggede kamera.
    Bemærk: Her, målinger blev taget hver 9 s.
  8. Hvis forudindstillede smeltning og udglødning programmer anvendes, bruge den medfølgende software til at analysere dataene. Hvis ikke, subtrahere tidligere gennemsnitsværdien fra middelværdien for hver temperatur skridt til at opnå den relative ændring af fluorescerende signal.

4. AFM Imaging

  1. spaltes glimmer (f.eks. glimmer " V1 ") ved tilknytning af kommercielt tilgængelige selvklæbende tape og flå; bør fjernes det øverste lag af glimmer.
  2. Ved hjælp af en mikropipette, deponere præformerede n HT i Mg 2 + indeholdende folde buffer på den frisk kløvet glimmer og lad det nøjes med 10 min.
  3. Spinde prøverne i korte 3-s intervaller på 2.000 x g på et lille bord centrifuge at fjerne de resterende væske. Flere n HTs bør stadig være knyttet til glimmer overflade.
  4. Bruger en cantilever spids med en høj stivhed (f.eks., 54 Nm -1) og bestemme dens resonansfrekvens med interne AFM softwaren.
  5. Registrere højde profil med AFM i luften i trykke tilstand på lav scanning satser (f.eks. 1 linje/s) at undgå at beskadige eller fortrænger n Copenhagen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Samling af DNA nanorør via en temperatur rampe (figur 2) er en meget pålidelig metode til at danne disse kunstige semiflexible polymerer. Disse polymerer har lignende egenskaber til deres naturligt forekommende modparter, såsom actin filamenter, men giver en langt bredere eksperimentelle ramme siden deres mekaniske egenskaber kan controllably ændret9,27 . Ligesom Biopolymerer, de kan arrangeres i net (figur 3) og, at specifikt man kan teste virkningen af glødetrådens stivhed på bulk strukturer og egenskaber. Som vist i figur 4, viser disse netværk en lineær stamme ordning for stammer, der op til 10%, som ligner Karakteristik af netværk af actin filamenter. Inden for denne ordning, kan lineære shear reologi let anvendes, for eksempel, for at bestemme den elastiske og tyktflydende svar af DNA nanorør netværk aftestede på forskellige frekvenser9. Disse tests viser, at disse netværk overvejende opfører gravitoner (figur 5). I modsætning til målinger med proteiner, disse rør ikke denaturere på grænsefladen luft-vand af prøven og derfor sofistikerede passivation strategier er påkrævet (figur 6). Derfor, håndtering af prøverne er temmelig ligetil og har vist sig for at være meget robust, giver ensartede resultater med lav prøve til prøve variationer.

Men spørgsmålet om hvorvidt den frie "sticky ender" af uparret enkeltstrenget DNA i begge ender af hvert rør kan fremkalde uønskede, stokastiske hybridisering begivenheder forblev. For at imødegå denne bekymring, blev supplerende "ende cap" sekvenser der dækker enderne af røret føjet til prøven efter hybridisering processen var afsluttet. Figur 7 illustrerer imidlertid, udjævningen enderne af glødetrådenes har nogen påviselig indflydelse og at røret ender ikke fremkalde forbigående crosslinking indflydelse i netværk9. Stikning begivenheder kun spille en væsentlig rolle, når prøven er håndteret for groft og rør bryde på grund af barske pipettering. Disse brud punkter synes faktisk at fremkalde crosslinking effekter, fører til ikke-lineære svar af systemet, f.eks stamme stiv (figur 8).

Hvis prøverne forberedes omhyggeligt, kan de bruges til at teste den indvirkning, som enten glødetrådens koncentrationen (figur 9A) eller glødetråden stivhed (figur 9B)9 har på de mekaniske egenskaber af netværk bestående af semiflexible polymerer. For første gang, blev kvantitative forbindelsen mellem glødetrådens stivhed og netværk elasticitet studeret eksperimentelt og systematisk, giver en lineær power lov adfærd, som strider mod dominerende teoretiske forudsigelser. Disse resultater illustrerer, at DNA nanorør er en ny, alsidigt værktøj at studere virkningerne af semiflexible polymerer, som var tidligere eksperimentelt utilgængelige9,27. Nu, forskellige teorier kan eksperimentelt testes, der involverer udtalelser om afhængigheder af persistens længde lp glødetrådenes. Derudover kan meget grundlæggende effekter, såsom reptation (figur 10), undersøges fra forskellige perspektiver ved at ansætte rør, der varierer i stivhed.

Navn Sekvens
U1: a1 *-b1 *-a2-b2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
U11: a11 *-b11 *-a12-b12 AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
T4: a4 *-b4 *-a1-b1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
endedæksel A1 CCTAATCGCC
endedæksel A2 CCTTTAGATCC
endedæksel A3 CCACTCTTCC
endedæksel A4 CCGTGAGAACC
endedæksel A5 CCGCACGACC
endedæksel A6 CCAACGATGCC
endedæksel A7 ATGCACCTCC
endedæksel A8 AACGGTAACTA
endedæksel B1 * ACGCTAAGCCA
endedæksel B2 * ACCAGATACA
endedæksel B3 * ACAAGATGTCA
endedæksel B4 * ACGCATTGCA
endedæksel B5 * ACTGTCGAACA
endedæksel B6 * ACTTCTATCA
endedæksel B7 * CATTCAAAGCT
endedæksel B8 * TCCCAAGTCA

Tabel 1: Eksempel på DNA sekvenser for hybridisering af nHTs vises i figur 1 c, som også blev brugt i tidligere undersøgelser på nHTs9, Class = "xref" > 26,27,28. Det angivne sæt af sekvenser giver mulighed for samling af syv forskellige tube arkitekturer (fx a1 hybridiserer med supplerende sekvens a1 *). Andre rør arkitekturer ikke givet her kan også dannes af addition eller subtraktion af tråde ledsaget af den ifølge cyclization af strand Nielsen med U1.

Figure 1
Figur 1: Tube forsamling og arkitektur. (A) skematisk af en 4HT forsamling dannet af fire forskellige 42-mers. Tilstødende enkeltstrenget DNA-strenge krydse sig gennem kontinuerlig skiftevis domæner af 10-11 baser, angivet med lange sorte flåter (de korte sorte flåter angiver unhybridized baser). Denne halv-forskudt motiv har klistret ender på begge sider langs aksen, angivet muliggør aksial vækst, med pilen. Grænsen tråde U1 og T4 også indslag supplerende domæner og dermed danne en lukket ring, som angivet af den højre pil. Bemærk, at denne skitse er en 2D repræsentation; i tilstanden hybridiserede grene danner dobbelt helices og alle baser er parret. (B) Quasi-3D skematisk af en 4HT tetramer med to dobbelt helices er omfattet i det skraverede fjerne lag. Dobbelt helices form for supplerende domæner og er knyttet til både tilstødende dobbelt helices af tube én gang pr. enhed længde element. En U2 linje tegnes tykkere for klarhed. (C) eksempler på syv forskellige tube arkitekturer er givet, med strand tal fra 4 HT til 14 HT og lp spænder fra 1,2 til 26 µm. (D og E) Epi-fluorescerende billeder af Cy3-mærket, adsorberet 5 HT og 10 HT illustrerer de forskellige stiffnesses via anderledes buet konturer. Det røde overlay er glødetrådens kontur fundet via billedanalyse, med til slut afstand R og kontur længde lC. Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: temperatur rampe og tilsvarende forsamling af DNA nanorør. (A) DNA nanorør er samlet i et thermocycler via en protokol indeholdende flere forskellige temperatur trin over ca 11 h. (B) i en real-time kvantitativ PCR system, den relative ændring af den fluorescerende signal af farvede tråde er en foranstaltning til nydannede dobbelt-strenget DNA mens gå igennem temperatur rampen. Afhængigt af DNA nanorør kan forsamling sats variere. De mere komplekse dannelse struktur, jo bredere forsamling, formentlig siden flere tråde (og derfor flere segmenter med forskellige sekvenser og lokale udgloedning temperaturer) skal krydse ved de relevante positioner, en proces, der er drevet af stokastiske termisk udsving. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant AFM billede af en sammenfiltrede net af 8HTs på 4 µM. En præfabrikerede netværk af 8HTs absorberes skal et glimmer overfladen højde profil blev indspillet ved hjælp af aflytning tilstand i luften. AFM billeder visualisere en 2D projektion af netværket, men tillader ikke for pålidelige udvinding af data (f.eks. maskestørrelse) for 3D-sagen, da rør samt netværkene er komprimeret i en 2D konfiguration. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: lineære område. Stamme målinger (G' = 1 Hz) afslører en bred lineær elastisk plateau, uden tegn på crosslinking effekter såsom ikke-lineære opførsel, manifesterer sig som stamme hærdning. Over en karakteristisk stamme (forskellige for hvert nHT) bryder elastisk plateau modulus ud uigenkaldeligt. Fejllinjer hver repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien af alle udførte målinger. Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: typisk frekvens afhængighed af et netværk, sammenfiltrede 6HT. Netværk af DNA rør vise en bred elasticitet plateau over fire størrelsesordener, afhængigt af den anvendte frekvens. Som forventet for en polymer netværk, den elastiske del (G') af den komplekse shear modulus er betydeligt højere end den tyktflydende del (G''). Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Ingen luft-flydende interface effekter. Frekvens fejer (f-fejer; γ = 5%) af 8HT prøver på 8 µM viste at indflydelse af fordampning og gellation indvirkning på luft-vand-grænseflade er ubetydelig. Forskellige ækvilibrering gange, samt to metoder kendt at drastisk reducere protein klynger på grænsefladen (overfladeaktive stoffer og lipider), blev anvendt. Uafhængig af metoden, ingen angivelse af drastiske påvirkninger af fordampning eller overflade elasticitet blev registreret. Her, G' repræsenterer elasticitetsmodul og G'' repræsenterer den tyktflydende modulus (stiplet linje). Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: ingen indflydelse af slutningen ændring. Elastisk plateau modulus forbliver konstant, når udjævningen sticky gratis enderne af 8HTs med deres respektive komplementære sekvenser. Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: indflydelse af håndteringsprocedurerne for præfabrikerede DNA netværk på målingen. Afhængigt af hvordan de prædannet net skal håndteres efter hybridisering, kan målingerne variere. I dette eksempel shear flow under Pipettering af DNA-nanorør har været drastisk varieret og rør brød hvis håndteres også nogenlunde. Brud medfører uønskede vekselvirkninger mellem udsat, supplerende single-tråde korrelerede til brudt eller bristet segmenter, som fører til en stigning i elasticiteten og inducerer ikke-lineære effekter, sUCH som stamme hærdning (stigning på elasticitet for store stammer, grøn kurve). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: DNA nanorør aktiverer studiet af lp afhængigheder. (A) studerer net af semiflexible polymerer med nHTs giver mulighed for undersøgelse af systemet med stigende koncentration (koncentration feje), svarer til undersøgelser baseret på Biopolymerer såsom actin mekanisk reaktion. (B) desuden, de forskellige arkitekturer for rørene lette bestemmelse af det mekaniske svar med hensyn til det varierende lp af den underliggende filamenter, hvilket er umuligt med naturligt forekommende semiflexible polymerer. Til dette formål, er data fra A replotted til skalering af elastisk plateau modulus med hensyn til lp. Fejllinjer hver repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien af alle udførte målinger. Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Reptation og mesh størrelse. Optagelse fluorescens billeder af reptating filamenter (single-mærket DNA 8HT indlejret i et ikke-navngivet netværk; c = 14 µM) kan bruges til at kontrollere de sammenfiltrede karakter af filamenter i netværket. Enhver crosslinking effekter vil hæmme dette endimensionale diffusion. Indsatser: Reptation analyse kan bruges til at bestemme maskestørrelse skalering med koncentrationer, som sammenligner godt til aktin målinger og er enig med teoretiske forudsigelser30. Fejllinjer hver repræsenterer standardafvigelsen for middelværdien af alle udførte målinger. Figur tilpasset fra Schuldt mfl9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at opnå korrekt udformet netværk, er samle DNA nanorør et afgørende skridt. Fejl under syntese processen indflydelse negativ på tube kvalitet; Det anbefales derfor, at HPLC eller en strengere processen bruges til at rense oligonukleotider. Siden dannelsen af diskret frem for aggregerede DNA nanorør, samt deres længde distribution, afhænger af den equimolar støkiometrisk af n konstituerende oligonukleotider inden for sæt, er det nødvendigt at remeasure koncentrationerne af indkøbte dele, siden givet værdier kan variere betydeligt fra den faktiske koncentration. Dette kan for eksempel udføres af UV-Vis spektroskopi ved en absorbans bølgelængde på 260 nm. Vi vil gerne bemærke, at uddø koefficienter og Molekylær vægt varierer mellem de forskellige sekvenser; værdier til at oversætte absorbans i koncentration bør derfor fastsættes for hver DNA oligonukleotid. Når du bruger udstyr, der er optimeret til små prøve diskenheder, som en NanoDrop, skal hvert målepunkt taget flere gange og i gennemsnit. I overensstemmelse med det lineære område af påvisning af spektrometret. Fortynd den brøk, der anvendes til bestemmelse af koncentrationen, hvis nødvendigt. Mindre unøjagtigheder kan have en stor indvirkning på den korrekte støkiometrisk og kvaliteten af røret dannelse; Derfor skal Pipettering af de enkelte dele være så præcist som muligt. Efterfølgende, bør den endelige prøveopløsning blandes grundigt ved langsomt pipettering prøven op og ned før du placerer det i thermocycler. Hvis tråde er blevet ændret med fluorescerende farvestoffer til visualisering, skal alle trin udføres i et miljø, skærmet mod direkte lys, og senere tilsætning af etablerede anti-blegning agenter (dvs. ilt scavenging systemer, såsom glucose stavbakterier/katalase) anbefales. Når de enkelte indsatsområder har været blandede i de rigtige buffer betingelser, anvendes en temperatur rampe for at krydse strukturerne (figur 2A). Denne temperatur mønster følger den tidligere beregnede kritiske hybridisering temperatur, hvor DNA dobbelt helices form. Flere metoder er blevet udviklet for at analysere DNA hybridisering kinetik (dvs., native DNA UV-absorbans31, kalorimetri32eller fluorescerende farvestoffer33). I den sidstnævnte metode intercalate farvestoffer i DNA dobbelt helices, danner stærkt fluorescerende komplekser lysere end de ubundne farvestoffer. De binder delvist dobbelt-strenget men ikke enkeltstrenget DNA34. Derfor, disse farvestoffer er blevet anvendt til at overvåge DNA nanostrukturer samlesæt i systemet35 og kan bruges til at identificere ideelle forsamling betingelser.

I første omgang, en dobbelt-strenget DNA i stikprøven, såsom foruddefinerede og uforudsete dobbelthuse, er denatureret ved en høj temperatur (90 ° C) til at undgå utilsigtet base parring. En efterfølgende gradvis nedsættelse temperaturændringer (svarende til figur 2A) reducerer den termiske bevægelse af DNA-strenge, aktivering af base skrælle events. På grund af minimering af den fri energien, DNA-strenge fortrinsvis krydse sig på deres komplementære sekvenser. Når en dsDNA-specifikke intercalating farvestoffet anvendes, øges lysstyrken med dannelsen af stærkt fluorescerende komplekser, som er til gengæld et kvantitativt mål for nydannede dobbelt-strenget DNA34. Den relative ændring af fluorescens signal for dannelsen af 4HTs og 8HTs er afbildet i figur 2B. Denne relative ændring beregnes gennemsnit fluorescens-intensiteten for hver temperatur og efterfølgende subtraktion af den gennemsnitlige værdi af de tidligere temperatur. Med faldende temperatur, kan være i en ophøjet fluorescens opdaget (figur 2B), og toppen af denne kurve fremhæver den temperatur, hvor massive hybridisering hændelser indtræffer. Drop af kurver refererer til intensitetsværdierne at nå et plateau. Afhængigt af DNA konstruktion og dens kompleksitet (f.eks. et lille eller stort sæt af DNA strenge), kan peak være skarp (figur 2B, blå kurve) eller bredt (figur 2B, grøn kurve). Når det er muligt, bør dette testes for hver nydesignede struktur til at sikre, at den gradvis faldende del af temperatur rampen indeholder det område, hvor dannelsen af rør via dannelsen af hybridiserede dsDNA segmenter forekommer. Efter passende temperatur bestemmes regime, nanostrukturer med succes kan samles i meget smalle temperaturområder (figur 2B, blå kurve), eller endda isothermally35. Bemærk, at hybridisering af flere DNA strenge i periodiske lattices inducerer kooperative udgloedning effekter35,36, som støtter yderligere DNA udglødning. Det bør overvejes at intercalating farvestoffer strække DNA helices ud over deres standard 10,5 basepar pr. spiralformet turn konfiguration, således at ændre det samlede geometri af rørene. Derfor er det ikke tilrådeligt at hæve farvestof koncentration over ét molekyle pr. 900 DNA basepar35. Desuden kan peak forsamling temperatur afvige fra den faktiske optimal udgloedning temperatur. At opnå høj præcision og bestemme den bedste betingelse for tube dannelse bør DNA hybridisering undersøges under mange langsomt skiftende temperatur skridt, som bør være batchdokumentation med Agarosen gelelektroforese. I tilfælde af DNA-nanorør oprettede vi en tre-trins protokol. Først, prøven opvarmes til 90 ° C til at denaturere DNA i enkelt hårstrå. Efterfølgende er et bredt Temperaturområde (omkring forsamling toppen af fluorescens signal) dækket. I vores tilfælde, er en række 10 ° C dækket, lige fra 65 ° C til 55 ° C, med en trin -0,5 ° c hvert 30 min. I det sidste trin, skal temperaturen hurtigt falde til stuetemperatur - eller som i vores tilfælde, 20 ° C - for at forhindre eventuelle ugunstige interaktioner ved mellemliggende temperaturer (figur 2A). Normalt, varme termocyklere prøver fra koldere temperaturer. Derfor er det vigtigt at justere temperaturen i låget i overensstemmelse hermed for at begrænse fordampningen af væske i prøven under montage, hvilket øger den endelige prøve koncentration.

Hvis nHTs er dannet korrekt, arrangere de i rent sammenfiltrede net (figur 3), uden samspil forårsager crosslinking virkninger mellem forskellige rør. Krydsbindinger vil formentlig følge af uparret DNA segmenter strækker sig fra defekter langs et rør eller i klæbrig ender, som ville være gratis at parre med supplerende enkeltstrenget segmenter på nærliggende rør. Disse virkninger vil fremkalde ikke-lineære egenskaber, såsom stamme hærdning (stigende G' for større stammer), men de er fraværende i indfiltret net (figur 4). Den viste γ-fejer også afsløre passende lineære stamme regimer til rheologiske målinger i almindelighed. Over en vis grænse, netværket brister eller mister kontakt med plader af rheometer, der uigenkaldeligt ødelægger systemet. Anvendt stammer bør derfor i den lineære ordning at få pålidelige data. Typisk, en stamme af 5% er tilstrækkelig til at give data langt over støj regimet. Højere stammer kan anvendes; men de nærmer let sig tærsklen brud, og resultaterne kan være falsified på grund af måling i den ikke-lineære ordning.

Rheologiske målinger kræver en omhyggelig og konsekvent forberedelse af prøven og nøje overvejes måling protokoller at opnå reproducerbare og fortolkelige resultater. Det centrale punkt er at etablere en helt tilfældig, isotropic netværk mellem rheometer pladerne, da disse net er for det meste kun reproducerbare struktur. Således temmelig lang ækvilibrering gange (typisk omkring 2 h, nogle gange endda mere) er nødvendige for at sprede nogen bestilling virkninger, der opstår på grund af shear-induceret tilpasning under den Pipettering af prøven. Pre-test eksperimenter er anbefalet til optagelse gang evolution (tid feje) af systemet under ækvilibrering for at bestemme den nødvendige tidsramme. Når signalerne når plateauer uden yderligere ændringer, ekvilibreres systemet. Når ækvilibrering betingelser er blevet bestemt, de ønskede test, såsom en stamme rampe eller f - eller γ-fejer, kan udføres. Test et bredt spektrum af stammer kan i sidste ende ødelægge netværket, eller forbindelsen til pladerne. Men hvis prøverne er begrænset til stammer tærsklen på ruptur, stamme ramper og fejer kan iterativt gentages for at undersøge potentielle ældning eller hysterese virkninger. For f-fejer, måling gange kan variere betydeligt. Test lave frekvenser dramatisk forlænger eksperimenter, da én svingning kan tage flere minutter. Bemærk, at hvis nHTs, f-fejer afsløre at elasticitetsmodul G' overskrider den tyktflydende modulus G'' af cirka én størrelsesorden, hvilket illustrerer den fremherskende elastisk svar af disse systemer ( Figur 5). Generelt, de forskellige typer af eksperimenter kan være ledsaget af korte f-fejer før og efter de vigtigste eksperiment for at kontrollere, at systemet fortsat uforstyrret af målingen, selv. Men nogle maskiner nødt til at ændre den underliggende motor tilstand af de forskellige former for målinger, især når du skifter fra dynamiske eksperimenter (f.eks. svingninger for f-fejer) til en statisk belastning rampe. Denne ændring er ofte ledsaget af spontan store stammer ødelægge netværket og temperering efterfølgende målinger. Således, det anbefales at tjekke specifikationerne af rheometer anvendes.

Reologi eksperimenter på actin-baserede systemer afslører et dramatisk effekt af protein denaturering forekommende på luft-vand-grænseflade på systemet. Denaturerede proteiner overholde unspecifically til hinanden, derved danner en tæt gel, der kan meget dominerer de mekaniske egenskaber af hele systemet. For at undgå direkte kontakt af prøven med den omgivende luft, kan passivation teknikker, der også undertrykker fordampning af vandindholdet i prøven bruges. Tre potentielle metoder er: (i) omkring prøven kammer med samme buffer som i eksemplet; (ii) ved hjælp af overfladeaktive stoffer til at dække grænsefladen på grund af deres hydrofobe og hydrofile domæner (skal udvises forsigtighed, da nogle overfladeaktive stoffer forstyrrer polymer konformationer); eller (iii) beskæftiger mere biologisk kompatibel lipider, med lignende virkninger som overfladeaktive stoffer. Det skal bemærkes, at nHTs fandtes ikke for at være udsat for denaturering virkninger på grænsefladen, og resultaterne er uafhængige af den passivation metode (figur 6), som fjerner en væsentlig potentiel kilde til fejl. Generelt, i prøve salen bør altid være forseglet med en hætte, der kan udstyres med fugtige svampe til at øge fugtigheden i kammeret, undertrykke fordampning.

Som kort beskrevet tidligere, en potentiel kilde til fejl i DNA-baserede systemer er unhybridized DNA, såsom uparret enkeltstrenget DNA hænger ud på defekter eller på enderne af nanorør, der kan forårsage yderligere crosslinking virkninger. For at undersøge og/eller fjerne denne mulighed, kan supplerende korte tråde bruges til cap disse klistret ender. Men vores egne undersøgelser viste, at tilsætning af udjævningen tråde havde ingen effekt på den indførte nHTs og opførsel af de sammenfiltrede net forblev uændret (figur 7). Dog kan udjævningen sticky ender med komplementære sekvenser være nyttige for andre DNA-baseret (og mere komplekse) systemer til at undertrykke uønskede vekselvirkninger. Derudover prøver af nHTs bør være pipetted omhyggeligt (f.eks. for fortynding trin og prøveforberedelse) at forebygge breaking eller andre skader til rør. Hvis løsningen er pipetted for groft, rør bryde ukontrollabelt, udsætter stort antal sticky ender på defekt point, fører til uønskede vekselvirkninger mellem rør og potentielle crosslinking i systemet. Dette forstyrrer signalet og fører til stiv effekter, samt til ikke-lineære effekter såsom stamme hærdning, som bliver synlige i γ-fejer (figur 8). Således pipettering indfiltrede løsningen bør kun ske langsomt og ved hjælp af pipette tips med en temmelig stor diameter (skæring i slutningen af en pipette tip er tilrådeligt) til at reducere shear styrker på rørene.

Afslutningsvis er DNA nHTs et velegnet og meget fleksibel modelsystem til at studere de semiflexible polymerer og bulk netværk dannes fra disse filamenter, der repræsenterer en ny klasse af mekanisk afstemmelige hydrogels. Hvis rørene tilberedes omhyggeligt, kan de bruges til at teste virkningen af lp af glødetrådenes i forskellige tilfælde. Bulk rheologiske målinger af indfiltret net, for eksempel, afslører at de teoretisk forudsagte afhængigheder af elasticitetsmodul med koncentration og lp er uforenelige med den eksperimentelt afledte skalering Love (figur 9)9. Denne undersøgelse fremhæver, at elasticiteten i et netværk kan øges ved at øge stivheden af de underliggende polymerer. Traditionelt, blev øge stivheden af en hydrogel opnået ved at tilføje flere polymerer til løsningen eller ved at inducere krydsbindinger (fysiske eller kemiske) mellem tilstødende polymerer37,38. Dog er en højere molekylære indhold også forbundet med en reduceret maskestørrelse, der kan begrænse applikationer såsom 3D cellekultur. Krydsbindinger, på den anden side kan fremkalde komplekse morfologiske ændringer inden for det underliggende netværksarkitektur, hvilket yderligere komplicerer præcis tuning af mekaniske egenskaber39. Bruger netværk af nHTs, dog giver mulighed for en fuldstændig afkobling af disse parametre, hvorved afstivende effekter kan være fremkaldt af udelukkende ændrer stivhed af den underliggende filamenter, mens forlader maskestørrelse uændret. Derudover kan tube arkitekturer specifikt ændres for at selektivt integrere yderligere effekter såsom crosslinking, som ligeledes i sammenfiltrede net, skaber yderligere muligheder for at teste eksperimentelt teoretiske forudsigelser for parametre såsoml p eller bitmapgenkendelse størrelse og styrke for netværk. Generelt, den programmerbare arkitektur udvider omfanget af programmer, giver mulighed for undersøgelse af lp-afhængige effekter ikke kun i løs vægt, men også på enkelt-molekyle niveau. Mærket rør kan være indlejret i netværk til at studere f.eks afhængighed af lp på den endimensionale bevægelse af en glødetråd i tube-lignende indespærring, almindeligvis reptation (figur 10)9. Hvis denne diffuserende bevægelse er synlige, kontrollerer det også indfiltrede karakteren af netværket, da det ville være undertrykt af crosslinking effekter. Analysere den underliggende dynamik afslører også maskestørrelse på netværket. Desuden, disse rør kan bruges til at undersøge afhængighed af stivhed og chiralitet af de underliggende rør på dannelsen af bundter40,41,42,43, 44 , 45 eller højere-ordens strukturer, såsom stjerne-lignende asters46,47,48,49,50, som kan være fremkaldt af crosslinking effekter eller via molekylemæssigt overfyldt miljøer27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi anerkender, at finansiering af DFG (1116/17-1) og Leipzig skole af Natural Sciences "BuildMoNa" (GSR 185). Dette arbejde er blevet støttet gennem projektets Fraunhofer tiltrække 601 683. T. Hansen erkender, at midler fra den Europæiske Socialfond (ESF-100077106).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 128 reologi semiflexible polymerer persistens længde DNA rør Biopolymerer actin hydrogel netværk
DNA nanorør som et alsidigt værktøj til at studere Semiflexible polymerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter