Summary
Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.
Abstract
Mechanische Eigenschaften von komplexen, Polymer-basierten weiche Materie, wie Zellen oder Biopolymer Netzwerke können im weder klassische Rahmen von flexiblen Polymeren noch starre Stäbe verstanden werden. Zugrunde liegenden Fäden bleiben ausgestreckten aufgrund ihrer nicht-verschwindende Rückgrat Steifigkeit, die über die Persistenz-Länge (lp) quantifiziert wird, aber sie sind auch starken thermischen Schwankungen unterworfen. Ihre endlicher Biegesteifigkeit führt zu einzigartigen, nicht-triviale kollektive Mechanik lose Netzwerke, ermöglicht die Bildung von stabilen Gerüste bei geringer Lautstärke Fraktionen gleichzeitig große Maschenweiten. Dieses Prinzip ist weit verbreitet in der Natur (z. B. in Zellen oder Gewebe), hohen Gehalt an molekularen und wodurch diffusive oder aktiven Transport zu minimieren. Aufgrund ihrer biologischen Auswirkungen und mögliche technologische Anwendungen in biokompatible Hydrogele wurden semiflexiblen Polymere beträchtliche Studie unterzogen. Nachvollziehbare Untersuchungen blieb jedoch herausfordernd, da sie auf natürlichen Polymeren, z. B. Actinfilamente, gestützt, die nicht frei einstellbaren sind. Trotz dieser Einschränkungen und aufgrund des Fehlens von synthetischen, mechanisch einstellbaren und semiflexiblen Polymere wurden Actinfilamente als gemeinsame Modellsystem etabliert. Eine große Einschränkung ist, dass die zentrale Menge lp frei optimiert werden kann, um ihre Auswirkungen auf die makroskopischen Massen Strukturen zu untersuchen. Diese Einschränkung wurde behoben, durch den Einsatz von strukturell programmierbarer DNA-Nanoröhren, ermöglicht kontrollierte Veränderung der Filament-Steifigkeit. Sie entstehen durch Kachel-basierte Designs, wo eine diskrete Menge von teilweise komplementäre Stränge in eine Ringstruktur mit einem diskreten Umfang hybridisieren. Diese Ringe sind mit klebrige enden, ermöglichen der effektive Polymerisation in Filamente mehreren Mikrometern in der Länge, und ähnliche Polymerisation Kinetik als natürliche Biopolymere anzuzeigen. Diese Rohre sind aufgrund ihrer programmierbaren Mechanik vielseitig, neuartige Instrumente zur Untersuchung der Auswirkungen von lp auf der Einzelmolekül-sowie der Bulk-Skala. Im Gegensatz zu Actinfilamente sie über Wochen ohne nennenswerte Degeneration, stabil bleiben und ihre Handhabung ist vergleichsweise einfach.
Introduction
Aufgrund der komplexen Verhaltensweisen ermöglicht durch ihre einzigartigen mechanischen Eigenschaften sind semiflexiblen Polymere Grundbausteine der lebenden Materie. Im Gegensatz zu flexiblen Polymeren verabschieden semiflexiblen Polymere eine ausgestreckte Konfiguration aufgrund ihrer nicht-verschwindende Rückgrat Steifigkeit zwar noch immer unter starken thermischen Schwankungen1. Somit können nicht rein stochastische Modelle auf ihr Verhalten, wie bei den extremen voll flexible oder starre Polymere angewendet werden. Das so genannte Endlosschraube-wie Kette Modell2,3,4 wurde entwickelt, um diese Steifheit über die lp, zu quantifizieren, ist die konstante Zerfall der Tangente Tangente Korrelation entlang der Filament-4. Wenn lp die Kontur Länge (lc) des Fadens vergleichbar ist, wird das Polymer semiflexiblen1betrachtet. Analog zu den Polen eines Zeltes, ihre Arrangements in Netzwerken oder Bündel stabilisiert das gesamte kollektive System bei geringer Lautstärke Brüche, führt zu ungewöhnlichen viskoelastischen Eigenschaften5,6,7, 8,9. Diese Strukturen bieten hohe Elastizitäten in großen Größen10, mechanische Integrität während noch diffusive zu erleichtern und aktiven Transportprozesse ineinander greifen. Diese Eigenschaft eignet sich besonders für biologische Systeme wie das Zytoskelett oder die extrazelluläre Matrix, aber es ist auch weit verbreitet in Essen engineering1,11,12.
Ihre Bedeutung für lebende Materie hinausgehen, ist es entscheidend, die physikalischen Eigenschaften dieser Strukturen umfassend zu untersuchen, um die Werkzeuge, um biomimetischer Materialien oder neuartige Hydrogele zu entwickeln. In Bezug auf die semiflexiblen Polymere bedeutet dies die systematische Ermittlung der kollektive Eigenschaften von Netzwerken aus Single-Filament Eigenschaften wie l-p und die Entwicklung eines beschreibenden theoretischen Rahmens. In bahnbrechenden Studien der zellulären Biopolymer-Aktin entstand als Modellsystem für semiflexiblen Polymere und ist immer noch weithin als der Goldstandard5,13,14,15 , 16 , 17. gründlichen Studien sind jedoch mit diesem System beschränkt, da sie die inhärenten Eigenschaften dieses Proteins gebunden sind. Verschiedene theoretische Ansätze zielten auf eine Baubeschreibung der nicht-triviale mechanischen Verhaltensweisen auf der Single-Filament-Ebene und führten zu insbesondere unterschiedliche Skalierung Prognosen für die Abhängigkeit von der linearen elastischen Plateau Schubmodul, G 0 (d. h. die "Elastizität" des Netzes), in Bezug auf die Konzentration (c) und lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Während die Konzentration Skalierung leicht zugänglich in Experimenten mit Actin-basierte oder andere Modellsysteme ist und theoretische Vorhersagen rigoros wurden überprüft13,16,24, 25, die Skalierung in Bezug auf lp experimentell unzugänglich geblieben. Dies ist jedoch eine wichtige Einschränkung, da lp auch eine unabhängige Variable ist, die definierende Menge semiflexiblen Polymere.
Diese zentrale, natürliche Limitierung durch die festen lp von Aktin oder andere biologisch abgeleitet Polymere wie Kollagen wurde vor kurzem behoben, durch den Einsatz von Kachel-basierte DNA-Röhren, die einstellbaren in ihren mechanischen Eigenschaften sind 9 , 26 , 27 , 28. geringfügige Abweichungen in den Architekturen der Rohre (z. B. unterschiedliche Anzahl von einzelnen DNA-Stränge innerhalb der Einheit Ring) ergeben unterschiedliche Werte für lp, welches per Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewertet werden kann, durch die Analyse einer schwankender Röhre oder durch die Auswertung der gebogenen Konfigurationen von mehreren Rohren eingehalten als zuvor beschriebenen9,28. Diese Analysen ergaben, dass l-p -Werte der verschiedenen Rohr Bevölkerungen über mehr als eine Größenordnung variieren und unterschiedliche Bewertungstechniken konsistente Ergebnisse9,28ergeben.
Überraschenderweise wurde die allgemeine Skalierung des linear elastischen Plateau Shear Modulus G0 in Bezug auf die Konzentration und lp berichtet, dass mit allen bisherigen Theorieansätze inkonsistent 9, insbesondere zeigen eine viel stärker als vorhergesagt Abhängigkeit von lp. Diese Ergebnisse unterstreichen den Wert eines neuen Modell-Systems, die zentralen Eigenschaften von semiflexiblen Polymeren zu studieren. Einsatz von n-Helix DNA Röhren drastisch erweitert den Anwendungsbereich dieser Untersuchungen. Nicht nur lp frei variiert werden ohne das Grundmaterial zu ändern, sondern die inhärente programmierbare Natur der DNA kann die systematische Untersuchung von Zusatzelementen, wie Querverbindungen oder kinetische Schaltvorgänge ermöglichen. Darüber hinaus diese Rohre sind in Wasser löslich und im Gegensatz zu den meisten Proteine stabil in angemessenen pH-Wert und ionischen Bedingungen für mehrere Wochen, ohne erkennbare Verschlechterung9.
Diese Rohre montieren eine diskrete Menge von DNA-Oligonukleotide verwendet wird, von denen jede enthält zwei Domänen, die komplementäre Basensequenzen zu zwei benachbarten Stränge Teilen (aufgrund der spezifischen Reihenfolgen kann kein einzigen Strang Strukturen wie Haarnadeln bilden). Die komplementäre Sequenzen hybridisieren zyklisch, geschlossene, halb-überlappende Ringe der doppelt-schraubenartigen Segmente n miteinander verbunden bilden (Abbildung 1A und B). Diese Ringe bilden bei einem diskreten Durchmesser (Abbildung 1) und deren Hälfte-überlappende Konfiguration stellt axiale klebrige enden, die komplementär zu den klebrigen Enden von einem anderen Ring. Diese selektive Ergänzung passender Oligonukleotide löst eine Stapelung der Ringe, führt zu der effektiven Polymerisation filamentöse DNA Helix Schläuche der Größe n (nHT). Ihre Konturen Längen messen in der Regel einige Mikrometer in der Länge, und ihre Längenverteilung ist vergleichbar mit der von Aktin Filamente9,26,27,28. Es wurde für ähnliche DNA Nanoröhrchen gezeigt, dass sie in der Tat Polymerisation Kinetik ähnlich denen von Aktin-Filamenten und Mikrotubuli aufweisen
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Protocol
1. Vorbereitung der n HTs
Hinweis: hier n bezeichnet die Anzahl der verschiedenen DNA-Einzelstränge beteiligt an der Gründung der Helix Rohre einer bestimmten Größe. Für n = 8, acht verschiedene DNA-Einzelstränge bilden eine Einheit-Ring.
- Kauf DNA-Sequenzen (HPLC Reinheitsgrad oder höher) aus einer geeigneten DNA-Synthese-service oder führen qualitativ hochwertige Synthese und Reinigung (beispielhaft in Tabelle 1 angegebenen Sequenzen).
- Aufschwemmen lyophilisiert Oligonukleotide in gereinigtem Wasser und folgen Sie den weiteren Wiederfreisetzung Schritte in den entsprechenden Handbüchern von der Firma gegeben. Passen Sie die Menge des Wassers, eine Endkonzentration von 200 µM zu erhalten.
- Bestimmen-Konzentrationen der einzelnen DNA-Stränge um zu überprüfen, die vom Verteiler angegebenen Werte (z. B. über UV-Vis-Spektroskopie bei 260 nm) da die genaue Stöchiometrie für den Montageprozess entscheidend ist. Berechnen Sie die Konzentration der Oligonukleotide, unter Berücksichtigung der spezifischen molare Gewicht und vom Aussterben bedroht-Koeffizient für jedes einzelsträngigen DNA-Oligonukleotid.
Hinweis: Die Werte der Koeffizienten der Auslöschung von Natur aus variieren für die verschiedenen Sequenzen und sind in der Dokumentation von im Handel erworbenen DNA angegeben. Sie können auch nach dem nächster-Nachbar-Modell mit einer Reihe von frei verfügbaren Online-Tools berechnet werden. Zur Einhaltung des linearen Bereichs des Spektrometers überlegen Verdünnen der Probe zur Konzentrationsbestimmung. - Mit einer Mikropipette mischen der DNA-Stränge-alle gleichzeitig Konzentration in einen Container für die Thermocycler (z. B. ein 200 µL PCR-Röhrchen) um die gewünschte n HTs zu bilden (endgültige Pufferbedingungen: 1xTE (10 mM Tris und 1 mM EDTA, pH 8) und 12,5 mM MgCl 2).
Hinweis: Letzte DNA-n HT Proben bestehen aus n - 1 Stränge, U 1 − U n − 1 und ein T-n-Strang. Die Konzentration pro Strang kann variieren von Sub-mikromolaren von mehr als 10 µM, je nach den Bedürfnissen des Benutzers (z. B. < 1 µm pro Strang für die anschließende Verdünnung Einzelfilamenten beobachten oder höheren Konzentrationen für die Prüfung der dichtes Netz Mechanik). - Hybridisieren n HTs in einem Thermocycler (Denaturierung für 10 min bei 90 ° C, mit einer anschließenden schnellen Rückgang auf 65 ° C; langsame Temperatur von 65 ° C auf 55 ° C, mit komplementäre Basenpaarung in 20 Temperaturstufen des-0,50 K für 30 min sinken jede; und einen schnellen Abfall von 55 ° C bis 20 ° C); siehe Abbildung 2A.
Hinweis: Die langsame Abnahme Schritte von 65 ° C können verlängert werden, um die durchschnittliche Rohrlänge zu erhöhen; die anschließenden schnellen Rückgang auf 20 ° C ist jedoch entscheidend für die Aggregation von polymerisierten Rohren zu vermeiden. - Speichern der hybridisierten n HTs für bis zu 3 Wochen bei 4 ° C ohne Beeinträchtigung der nachweisbar.
Hinweis: Für Fluoreszenz Mikroskopie, beschriftet n HTs sind hybridisiert mit der (teilweise) Substitution von U1 mit der modifizierten U1-Cy3 (Tabelle 1). Für längere Beobachtungszeiten empfiehlt sich der Zusatz von etablierten Anti-bleichen. - Sorgfältig die Probe auf die gewünschte Endkonzentration verdünnen (z. B. 4 µM für Netzwerke oder 20 nM für Single-Filament Beobachtungen) mit der Probenpuffer, wenn nötig. Um mögliche Fehlerquellen zu minimieren, montieren Proben auf die gewünschte Endkonzentration.
2. Scher Rheologie
- Wählen Sie eine geeignete Geometrie (Platte-Platte oder Kegel-Platte) für die dynamische scher-Rheometer. Für kleine Mengen (d. h. unterhalb 200 µL), verwenden Sie die Kegel / Platte Geometrie.
- Laden Sie die Probe auf die dynamische scher-Rheometer.
- Passiviert die Luft-Wasser-Grenzfläche der Probe und Umgebung mit den folgenden Schritten um potentielle Verdunstung Auswirkungen zu verhindern.
- Die Probe mit 2,5 mL der Probe Puffer Badewanne umgeben.
- Fügen Sie ein Tensid knapp unterhalb der Micelle Konzentration.
- Verwenden eine Hamilton-Spritze, umgeben von der Probe mit einem Lipid, direkten Kontakt der Probe mit Luft zu vermeiden.
- Versiegeln die Probenkammer mit einer Kappe ausgestattet mit nassen Schwämmen und, wenn möglich, mit einem zusätzlichen Wasserbad (nicht in Kontakt mit der Probe) weiter unterdrücken Verdunstung.
- Starten Sie die Messung mit dem Rheometer-spezifische Software bei Raumtemperatur; Alternativ führen Sie die Messung bei verschiedenen Temperaturen, wie z. B. 37 ° C (wenn physiologische Bedingungen benötigt werden).
Hinweis: Kühlung der Probenmaterials ist oft begleitet von der Kondensation von Wasserdampf aus der Umgebungsluft Heizung führt zu verstärkten Verdunstung. Beide Effekte können die Konzentration der Probe, unkontrolliert ändern, sodass alle Messungen in einer Reihe auf einer konstanten Temperatur durchgeführt werden sollten. - Ermöglichen die Probe für 2 h bei Raumtemperatur equilibrate. Die zeitliche Entwicklung kann mit einem Sweep Zeit überwacht werden (eine Daten pro Minute; Stamm γ = 5 %; Frequenz f = 1 Hz).
- Messen die mechanischen Eigenschaften mit den gewünschten Test-Protokolle. Beginnen Sie mit einer Reihe von Frequenz-Sweeps (f-fegt) weil sie die Probe intakt lassen und für weitere Messungen.
Hinweis: Darüber hinaus kurz f-Sweeps sollte vor und nach längeren Messungen durchgeführt werden (wie zum Beispiel lange f-fegt mit einer viel höheren Auflösung) um sicherzustellen, dass die Probe während der vollständigen Messprotokoll unverändert blieb.- Führen eine kurze f-Sweep (z. B. γ = 5 %; f = 0,01 Hz auf 30 Hz; 5 Datenpunkte pro Jahrzehnt).
- Führen eine lange f-Sweep (z. B. γ = 5 %; f = 0,001 Hz auf 30 Hz; 21 Datenpunkte pro Jahrzehnt); die Niederfrequenz-Regime kann verzichtet werden, wenn nicht notwendig, Messzeit reduzieren.
- Führen Sie eine kurze f-Sweep.
- Führen Sie einen γ-Sweep (z. B. f = 1 Hz; γ = 0,0125 % bis 100 %; 20 Datenpunkten pro Jahrzehnt).
Hinweis: Verwenden der kurzen f - sweep zuerst, wie es in der Regel nicht mit früheren f - fegt, weil Netzwerke in der Regel während γ-Sweep platzen oder trennen Sie die Platten. Verwenden Sie alternativ γ-Rampe (z. B. = 0,025 s -1, t = 60 s); die Rampen in der Regel erfordern jedoch ändern den Motorbetrieb, also nachfolgende kurze f-Sweeps würde verfälscht werden.
- Bin und/oder glatt die raw-Daten mit einem "glockenförmig" Kernel.
3. Fluoreszenz-gestützte Analyse der DNA Glühen
- vorbereiten 8 Aliquote 12 µL für jede Probe mit 1-4 µM DNA pro Strang, 12,5 mM MgCl 2 in 1 x TE-Puffer und 1 x Nukleinsäure-Gel Fleck von einem 10.000 X DMSO Lager. Machen eine Negativkontrolle mit keine DNA, aber einschließen Nukleinsäure-Gel Fleck.
- Übertragen die Aliquote auf einer Echtzeit-PCR-Platte und Dichtung mit Klebefolie (z. B. eine Reaktion der 96-Well-Platte).
Hinweis: Die hohen Temperaturen in der thermischen Tempern Protokolle verwendet werden Proben verdunsten. So stellen Sie sicher, dass die Brunnen mit Klebefilm Wasser verdampfen und Konzentration erhöht, besonders bei langfristigen Experimente zu verhindern dicht verschlossen sind. - Zentrifugieren der Platte 100 X g für 1 min bei Raumtemperatur, die Gasblasen zu entfernen, wenn die Gasblasen erweitern, der Brunnen können nicht analysiert werden.
- Die versiegelte Platte in eine Real-time quantitative PCR-System laden.
- Ein Glühen-Programm ausführen. Denaturieren Sie die DNA bei 90 ° C für 10 min. die Temperatur schnell auf 72 ° c Tropfen Dann senken Sie die Temperatur langsam um 0,5 ° C alle 30 Minuten. Nachdem das Signal abgeklungen ist, beschleunigen die Temperaturrampe.
Hinweis: 72 ° C ist ausreichend über die realen Hybridisierung Temperatur; so wird das Signal über einen breiten Temperaturbereich geeignet für die Bestimmung des notwendigen Temperaturbereichs aufgezeichnet. - Stellen Sie sicher, dass der Deckel der Cycler auf mindestens 100 ° C heizt, die Kondensation der verdampften Probe auf die Klebefolie zu verhindern.
- Bei der Montage begeistern die Proben mit einem Argon-Ionen-Laser bei 488 nm und erkennen die Fluoreszenz bei 550 nm bei Verwendung eines Nukleinsäure-Gel Fleckes (o.ä. spektral). Wählen Sie für andere Farbstoffe eine entsprechende Anregung/Emission-Kombination. Messung der Fluoreszenzsignal so oft wie möglich, die insgesamt zu erhöhen mit der integrierten Kamera Signalqualität.
Hinweis: Hier wurden Messungen alle 9 s. - Wenn voreingestellte schmelzen und Glühen Programme angewendet werden, verwenden Sie die mitgelieferte Software zum Analysieren der Daten. Wenn nicht, subtrahieren den früheren Mittelwert aus dem Mittelwert für jeden Schritt der Temperatur, die relative Änderung des fluoreszierenden Signals zu erhalten.
4. AFM Imaging
- Glimmer zu Spalten (z. B. Glimmer " V1 ") von handelsüblichen Klebeband anbringen und abreißen; sollte die oberste Schicht des Glimmers entfernt werden.
- Mit einer Mikropipette einzahlen vorgeformte n HT in Mg 2 + mit klappbaren Puffer auf dem frisch gespalten Glimmer und lassen Sie es 10 min. zufrieden geben
- Spinnen die Proben in kurzer 3-s-Intervallen bei 2.000 x g auf einen kleinen Tisch-Zentrifuge, die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Mehrere n HTs sollte noch an die Glimmer-Oberfläche befestigt werden.
- Eine hohe Steifigkeit (z. B. 54 Nm -1) ein Freischwinger-Tipp mit und bestimmen seine Resonanzfrequenz mit der internen AFM-Software.
- Aufzeichnung des Höhenprofils mit dem AFM in Luft bei der Erschließung von Modus bei niedrigen Abtastraten (z. B. 1 Zeile/s), vermeiden Beschädigungen und verdrängen die n HTS.
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Representative Results
Die Montage der DNA-Nanoröhren über eine Temperaturrampe (Abbildung 2) ist eine sehr zuverlässige Methode, um diese künstlichen semiflexiblen Polymere bilden. Diese Polymere haben vergleichbare Eigenschaften natürlich vorkommenden Pendants, z. B. Actinfilamente, aber bieten ein viel breiter experimentellen Rahmen da ihre mechanischen Eigenschaften kontrollierbar sein können9,27 geändert . Wie Biopolymere sie in Netzwerken (Abbildung 3) angeordnet werden können und insbesondere erlauben es, die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit auf Masse Strukturen und Eigenschaften zu testen. Wie in Abbildung 4gezeigt, anzeigen diese Netzwerke eine lineare Belastung Regelung für Stämme bis zu 10 %, die die Eigenschaften von Netzwerken der Actinfilamente ähnelt. Innerhalb dieses Regime kann lineare Scherung Rheologie leicht zum Beispiel angewendet werden, um festzustellen, die elastische und zähe Reaktion der DNA Nanotube Netze bei unterschiedlichen Frequenzen9sondiert. Diese Tests zeigen, dass diese Netzwerke überwiegend elastisch Verhalten (Abbildung 5). Im Gegensatz zu Messungen mit Proteinen, diese Rohre nicht in der Luft-Wasser-Grenzfläche der Probe denaturieren und daher anspruchsvoll Passivierung Strategien sind erforderlich (Abbildung 6). Daher die Handhabung der Proben ist eher unkompliziert und erweist sich als sehr robust, konsistente Ergebnisse mit geringen Variationen von Probe zu Probe nachgeben werden.
Jedoch kann die Frage, ob die freien "klebrige enden" der ungepaarten DNA an beiden Enden jedes Rohr einsträngige induzieren unerwünschte, stochastische Hybridisierung Ereignisse blieben. Um dieses Problem zu beheben, wurden ergänzende "Endkappe" Sequenzen für die Enden des Schlauches zur Probe hinzugefügt, nach der Hybridisierung-Prozess abgeschlossen war. Allerdings zeigt Abbildung 7 Deckelung der Enden der Fäden hat keinen nachweisbaren Einfluss und die Rohrenden nicht dazu veranlassen, keine vorübergehende Vernetzung Wirkung in der Netzwerk-9zu tun. Kleben Veranstaltungen nur eine bedeutende Rolle bei die Probe zu grob behandelt wird und die Rohre brechen durch harte pipettieren. In der Tat scheinen diesen Bruch Punkten Vernetzung Wirkungen, führt zu nichtlinearen Reaktionen des Systems, wie z. B. Stamm Versteifung (Abbildung 8) induzieren.
Wenn die Proben sorgfältig vorbereitet sind, können sie verwendet werden, testen Sie die Auswirkungen, die entweder die Filament-Konzentration (Abbildung 9A) oder das Filament Steifigkeit (Abbildung 9 b)9 auf die mechanischen Eigenschaften von Netzwerken bestehend aus semiflexiblen Polymere. Zum ersten Mal wurde die quantitative Verbindung zwischen dem Filament Steifigkeit und Elastizität Netzwerk experimentell und systematisch untersucht nachgeben eine lineare Kraft Gesetz Verhalten, die vorherrschende theoretische Vorhersagen widerspricht. Diese Ergebnisse zeigen, dass DNA-Nanoröhren sind ein neues, vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen von semiflexiblen Polymeren, die ehemals experimentell unzugänglich9,27waren. Nun können verschiedene Theorien experimentell getestet werden mit Aussagen über Abhängigkeiten von der Persistenz Länge lp der Filamente. Darüber hinaus können sehr grundlegende Effekte wie Reptation (Abbildung 10), aus verschiedenen Perspektiven untersucht werden, durch den Einsatz von Rohren, die Steifigkeit zu variieren.
| Name | Sequenz | ||
| U1: * a1-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: * a1-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: * a2-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-* b5-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| Endkappe A1 | CCTAATCGCC | ||
| Endkappe A2 | CCTTTAGATCC | ||
| Endkappe A3 | CCACTCTTCC | ||
| Endkappe A4 | CCGTGAGAACC | ||
| Endkappe A5 | CCGCACGACC | ||
| Endkappe A6 | CCAACGATGCC | ||
| Endkappe A7 | ATGCACCTCC | ||
| Endkappe A8 | AACGGTAACTA | ||
| Endkappe B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| Endkappe B2 * | ACCAGATACA | ||
| Endkappe B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| Endkappe B4 * | ACGCATTGCA | ||
| Endkappe B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| Endkappe B6 * | ACTTCTATCA | ||
| Endkappe B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| Endkappe B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabelle 1: Beispiel für DNA-Sequenzen für die Hybridisierung der nHTs angezeigt Abbildung 1, die verwendet wurden auch in früheren Studien auf nHTs9, Klasse = "Xref" > 26,27,28. Der gegebenen Menge von Sequenzen ermöglicht die Montage von sieben verschiedene Rohr-Architekturen (z. B. a1 hybridisiert mit komplementären Sequenz a1 *). Andere Rohr-Architekturen, die hier nicht gegeben können auch durch die Addition oder Subtraktion der Stränge, begleitet von den entsprechenden Biosyntheseschritt der Strang n mit U1gebildet werden.
Abbildung 1: Tube Assembly und Architektur. (A) schematische Darstellung der Montage von einem 4HT gebildet von vier unterschiedlichen 42-Mers. Angrenzenden einzelsträngigen DNA-Stränge hybridisieren durch ständige wechselnde Domänen 10-11 Basen, von langen schwarzen Zecken (die kurzen schwarzen Zecken geben unhybridized Basen) angegeben. Diese Hälfte gestaffelt Motiv verfügt über klebrige enden auf beiden Seiten entlang der Achse, axiale Wachstum, ermöglicht durch den Pfeil angezeigt. Die Grenze-Stränge U1 und T4 verfügen über ergänzende Domänen und somit einen geschlossenen Ring bilden, wie durch den Pfeil nach rechts angezeigt. Beachten Sie, dass diese Skizze eine 2D-Darstellung; im hybridisierten Zustand die Stränge bilden zwei Helices und alle Basen sind gekoppelt. (B) Quasi-3D-schematische Darstellung einer 4HT Tetramer mit zwei Doppel-Helices in der schattigen entfernten Schicht bedeckt. Doppel-Helices bilden für zusätzliche Domains und mit beiden angrenzenden Double Helices der Röhre einmal pro Maßeinheit Länge Element verknüpft sind. Ein U2-Strang wird aus Gründen der Übersichtlichkeit dicker gezeichnet. (C) Beispiele für sieben verschiedene Rohr-Architekturen werden gegeben, mit Litze Zahlen im Bereich von 4 bis 14 HT und lp von 1,2 bis hin zu 26 µm. HT (D und E) Epi-fluoreszierende Bilder Cy3 beschriftet, adsorbiert 5 HT und 10 HT illustrieren die verschiedenen Steifigkeiten über unterschiedlich geschwungene Konturen. Die roten Überlagerung ist die Filament-Kontur über Bildanalyse mit End-to-End Abstand R und Kontur Länge lCgefunden. Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Temperatur-Rampe und entsprechende Assembly von DNA Nanoröhren. (A) DNA-Nanoröhren sind über ein Protokoll enthält mehrere unterschiedliche Temperatur über etwa 11 h. (B) In einem Echtzeit-quantitative PCR-System, die relative Änderung der das Fluoreszenzsignal gefärbten Stränge Schritte in einem Thermocycler montiert ist ein Maß für die neu gebildete doppelsträngige DNA beim Durchlaufen der Temperaturrampe. Je nach Art der DNA-Nanoröhren kann die Montage Rate abweichen. Je komplexer die Umformung zu strukturieren, je breitere die Versammlung, vermutlich seit mehr Stränge (und daher mehr Segmente mit unterschiedlichen Sequenzen und lokalen annealing Temperaturen) müssen an den entsprechenden Stellen ein Prozess hybridisieren die von getrieben stochastische thermischen Schwankungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter AFM-Bild eines verschränkten Netzwerks von 8HTs bei 4 µM. Das Höhenprofil eines vorgeformten Netzes von 8HTs zu einer Glimmer-Oberfläche absorbiert wurde mit Tippen-Modus in Luft aufgenommen. AFM Bilder visualisieren eine 2D-Projektion des Netzwerks erlauben jedoch nicht für die zuverlässige Extraktion von Daten (z. B. Maschenweite) für den 3D Fall da die Rohre sowie die Netzwerke in einer 2D Konfiguration komprimiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: linearen Bereich. Stamm Messungen (G' = 1 Hz) zeigen eine breite linear elastischen Plateau, ohne Anzeichen von Vernetzung Effekte wie das nichtlineare Verhalten manifestiert wie Härten zu belasten. Über eine charakteristische Dehnung (unterschiedlich für jedes nHT) bricht der elastischen Plateau Modulus irreversibel. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwertes aller durchgeführten Messungen. Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: typische Frequenzabhängigkeit eines Netzwerks verschränkte 6HT. Netzwerke von DNA-Röhren zeigen eine breite Elastizität Plateau über vier Größenordnungen, abhängig von der angelegten Frequenz. Erwartungsgemäß für ein Polymer-Netz der elastische Teil (G') der komplexen Scherung Modul ist deutlich höher als der viskosen Teil (G''). Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Keine Luft-Flüssigkeit Schnittstelle Effekte. Frequenz-Sweeps (f-Sweeps; γ = 5 %) der 8HT Proben bei 8 µM ergab, dass der Einfluss der Verdunstung und Gelierung Effekte an der Luft-Wasser-Grenzfläche sind vernachlässigbar. Verschiedenen Gleichgewichtherstellung Zeiten sowie zwei Methoden bekannt, um Protein clustering an der Schnittstelle (Tenside und Lipide), drastisch zu reduzieren wurden verwendet. Unabhängig von der Methode, kein Hinweis auf drastische Einflüsse durch Verdunstung oder Oberfläche Elastizität wurden aufgezeichnet. Hier, G' stellt das Elastizitätsmodul und G'' vertritt zähflüssigen Elastizitätsmodul (gestrichelte Linien). Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: kein Einfluss der Ende Veränderung. Das elastische Plateau-Modul bleibt konstant, wenn die klebrigen freien Enden der 8HTs mit ihren jeweiligen komplementäre Sequenzen Deckelung. Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Einfluss von der Handhabung der vorgeformten DNA Netzwerke auf die Messung. Je nachdem, wie die vorgeformten Netze nach Hybridisierung behandelt werden können die Maße abweichen. In diesem Beispiel der Schubfluss beim Pipettieren von DNA-Nanoröhren drastisch variiert worden und Röhren brach, wenn auch grob behandelt. Bruch führt zu unerwünschten Wechselwirkungen ausgesetzt, komplementäre Single-Stränge korrelieren, gebrochene oder gerissene Segmente, die führt zu einer Erhöhung der Elastizität und nichtlineare Effekte induziert, sUch als Stamm Härten (Erhöhung der Elastizität für große Stämme, grüne Kurve). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: DNA-Nanoröhren ermöglichen die Untersuchung der lp Abhängigkeiten. (A) studieren Netzwerke von semiflexiblen Polymere mit nHTs ermöglicht die Untersuchung der das mechanische Verhalten des Systems bei steigender Konzentration (Konzentration Sweep), analog zu Studien mit Biopolymeren wie Aktin. (B) daneben die verschiedenen Architekturen der Rohre die Bestimmung der mechanischen Antwort in Bezug auf die unterschiedlichen lp der zugrunde liegenden Fäden, das ist nicht machbar, mit natürlich vorkommenden semiflexiblen Polymere. Zu diesem Zweck ist die Daten von A replotted anzusprechen die Skalierung des Elastizitätsmoduls elastische Plateau in Bezug auf lp. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwertes aller durchgeführten Messungen. Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: Reptation und Netz Größe. Aufnahme Fluoreszenzbilder der Reptating Filamente (Single beschrifteten DNA 8HT eingebettet in einem unbeschrifteten Netzwerk; c = 14 µM) kann verwendet werden, um den verschränkten Charakter der Filamente im Netzwerk zu überprüfen. Vernetzung von Nebenwirkungen würde dieser eindimensionale Diffusion behindern. Einschub: Reptation Analyse lässt sich die Skalierung mit Konzentrationen, Maschenweite zu bestimmen, welche vergleicht gut mit Actin-Messungen und stimmt mit theoretischen Vorhersagen30. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung des Mittelwertes aller durchgeführten Messungen. Abbildung von Schuldt Et Al9angepasst. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Um richtig geformte Netze zu erhalten, ist die Montage der DNA-Nanoröhren ein entscheidender Schritt. Fehler während der Syntheseprozess beeinträchtigen die Rohrqualität; Daher wird es empfohlen, HPLC oder ein strenger Prozess verwendet werden, um die Oligonukleotide zu reinigen. Da die Bildung von diskreten anstatt aggregierten DNA-Nanoröhren sowie ihre Längenverteilung der äquimolaren Stöchiometrie der n konstituierende Oligonukleotide innerhalb des Satzes abhängt, ist es notwendig, die Konzentrationen nachzumessen gekauften Stränge seit gegebenen Werte erheblich von der tatsächlichen Konzentration variiert. Dies kann durchgeführt werden, zum Beispiel durch UV-Vis-Spektroskopie bei einer Absorption Wellenlänge von 260 nm. Wir möchten beachten, dass die Molekulargewichte und Aussterben Koeffizienten zwischen den verschiedenen Sequenzen variieren; Daher sollten die Werte, die Extinktion in Konzentration zu übersetzen für jede DNA-Oligonukleotid bestimmt werden. Bei der Verwendung Geräte optimiert für kleine Probenmengen, wie ein NanoDrop sollte jedem Messpunkt mehrmals getroffen und gemittelt. Einhaltung des linearen Bereichs der Erkennung des Spektrometers. Verdünnen Sie den Bruch für die Konzentrationsbestimmung verwendet, falls erforderlich. Leichte Ungenauigkeiten können einen großen Einfluss auf die richtige Stöchiometrie und die Qualität der Röhre Bildung haben; Daher muss das Pipettieren der einzelnen Stränge so präzise wie möglich sein. Anschließend sollte die letzte Probenlösung gründlich gemischt werden, durch langsam Pipettieren der Probenmaterials nach oben und unten vor der Platzierung in den Thermocycler. Wenn Stränge mit Fluoreszenzfarbstoffen zur Visualisierung geändert wurden, sollten alle Schritte in einer Umgebung, geschützt vor direktem Licht und die spätere Ergänzung der etablierten Anti-bleichen Agenten (d. h. Sauerstoff Aufräumvorgang Systeme, wie z. B. durchgeführt werden Glukose-Oxidase/Katalase) wird empfohlen. Nachdem die einzelnen Stränge in der richtigen Pufferbedingungen gemischt worden sind, wird eine Temperaturrampe angewendet, um die Strukturen (Abbildung 2A) hybridisieren. Dieser Temperaturverlauf folgt die zuvor festgelegten kritischen Hybridisierung Temperatur, wo die DNA verdoppelt Helices Form. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um DNA-Hybridisierung Kinetik (z. B. native DNA UV Absorption31, Kalorimetrie32oder Fluoreszenzfarbstoffen33) zu analysieren. Bei der letzteren Methode einzulagern Farbstoffe in DNA Double Helices bilden stark fluoreszierende komplexe heller als die ungebundene Farbstoffe. Sie binden teilweise doppelsträngigen aber nicht einzelsträngigen DNA-34. Daher solche Farbstoffe sind angewendet worden, um DNA Nanostructure Selbstmontage in der System-35 zu überwachen und können verwendet werden, um optimale Montagebedingungen zu identifizieren.
Zunächst sind doppelsträngige DNA innerhalb der Probe, z.B. vordefinierte und unvorhergesehene Maisonetten, bei hohen Temperaturen (90 ° C) zur Vermeidung von unbeabsichtigten Basenpaarung denaturiert. Eine anschließende allmähliche Abnahme der Temperatur (ähnlich wie Abbildung 2A) reduziert die thermische Bewegung der DNA-Stränge, base Pairing Veranstaltungen ermöglichen. Durch die Minimierung der freien Energie hybridisieren DNA-Stränge bevorzugt an ihre komplementären Sequenzen. Wenn ein DsDNA-spezifische intercalating Farbstoff angewendet wird, erhöht die Helligkeit mit der Bildung von stark fluoreszierende komplexe, die wiederum ist ein quantitatives Maß für die neu gebildete doppelsträngige DNA-34. Die relative Änderung der Fluoreszenz-Signal für die Bildung von 4HTs und 8HTs ist in Abbildung 2 bdargestellt. Diese relative Änderung wird durch Mittelung der Fluoreszenzintensität für jede Temperatur und anschließend Subtraktion den durchschnittlichen Wert der vorherigen Temperatur berechnet. Mit abnehmender Temperatur, kann eine erhöhte Fluoreszenz werden erkannt (Abb. 2 b) und die Spitze dieser Kurve zeigt die Temperatur, wo massive Hybridisierung Ereignisse eintreten. Der Rückgang der Kurven bezieht sich auf Intensitätswerte ein Plateau zu erreichen. Abhängig von der DNA-Konstrukt und seiner Komplexität (z. B. , die eine kleine oder große Gruppe von DNA Stränge), kann die Spitze scharf (Abb. 2 b, blaue Kurve) oder breit (Abb. 2 b, grüne Kurve). Wenn möglich, sollte dies für jeden neu gestaltete Struktur um sicherzustellen, dass die allmählich abnehmende Teil der Temperaturrampe Bereich enthält wo die Bildung von Rohren über die Bildung von hybridisierten DsDNA Segmente Auftritt getestet werden. Nach der entsprechenden Temperatur Regime richtet, Nanostrukturen erfolgreich in sehr engen Temperaturbereichen (Abb. 2 b, blaue Kurve), oder sogar jeweils35montiert werden können. Anmerkung, die in periodischen Gitter die Hybridisierung von mehreren DNA Stränge induziert kooperative Glühen Effekte35,36, die weitere DNA-Glühen unterstützen. Dabei ist zu berücksichtigen, dass verschuppen Farbstoffen DNA-Helices über ihre standard 10,5 Basenpaare pro helikale Wende Konfiguration, damit verändern die Gesamtgeometrie der Rohre dehnen. Daher ist es nicht ratsam, die Farbstoff-Konzentration über ein Molekül pro 900 DNA-Basenpaare35zu erhöhen. Darüber hinaus kann die tatsächliche optimalen Anlasstemperatur Montage Spitzentemperatur abweichen. Hohe Präzision zu erreichen und die beste Voraussetzung für Rohr Bildung bestimmen, sollte DNA-Hybridisierung während viele langsam veränderliche Temperaturstufen, untersucht die mit Agarose-Gelelektrophorese überprüft werden sollte. Für den Fall von der DNA-Nanoröhren gründeten wir ein drei-Stufen-Protokoll. Zunächst ist die Probe auf 90 ° C zu denaturieren die DNA in Einzelstränge erhitzt. Danach fällt ein weiten Temperaturbereich (rund um den Montage-Gipfel des Fluoreszenzsignals). In unserem Fall fällt eine Reihe von 10 ° C, von 65 ° C bis 55 ° C, mit einem Schritt von-0,50 ° C alle 30 Minuten. Im letzten Schritt sollte die Temperatur schnell auf Raumtemperatur - oder wie in unserem Fall, 20 ° C - ablegen, um ungünstigeren Wechselwirkungen bei mittleren Temperaturen (Abb. 2A) zu verhindern. In der Regel erwärmen Thermocycler die Proben aus kälteren Temperaturen. Daher ist es wichtig, die Temperatur des Deckels entsprechend anzupassen, um die Verdunstung der Flüssigkeit in der Probe bei der Montage zu beschränken, die die letzte Probenkonzentration steigt.
Wenn nHTs entsprechend ausgebildet sind, ordnen sie in rein verschränkten Netzwerke (Abbildung 3), ohne Wechselwirkungen verursachen Auswirkungen der Vernetzung zwischen verschiedenen Röhren. Vermutlich würde Querverbindungen ergeben sich aus ungepaarten DNA-Abschnitte erstreckt sich von Mängeln an einem Rohr oder an klebrige enden, die paar mit komplementären einzelsträngigen Segmente auf benachbarten Rohre frei sein würde. Diese Effekte würden nichtlinearen Eigenschaften, z. B. Kaltverfestigung induzieren (Erhöhung der G' für größere Stämme), aber fehlen sie verstrickt in Netzwerken (Abbildung 4). Die angezeigten γ-Sweeps zeigen auch die entsprechenden linearen Belastung Regime für rheologische Messungen im Allgemeinen. Ab einem bestimmten Schwellenwert das Netzwerk Brüche oder verliert den Kontakt mit dem Rheometer, die irreversibel die System schädigt-Platten. Angewandte Stämme sollte daher in der linearen Regime um verlässliche Daten zu erhalten. In der Regel genügt eine Belastung von 5 % Daten weit über das Lärm-Regime liefern. Höhere Belastungen können angewendet werden; jedoch leicht nähern sie sich die Ruptur Schwelle und Ergebnisse sind umsoEd durch Messung in der nicht-linearen Regime.
Rheologische Messungen erfordern eine sorgfältige und konsequente Vorbereitung der Probe und gut überlegt Messprotokolle, reproduzierbar und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. Im Mittelpunkt steht, ein völlig zufällig, isotrope Netzwerk zwischen den Rheometer-Platten, da diese Netzwerke meist nur reproduzierbare Struktur sind zu etablieren. Daher sind ziemlich lange Gleichgewichtherstellung Zeiten (in der Regel ca. 2 h, manchmal sogar mehr) erforderlich, um die Bestellungen von Nebenwirkungen zu zerstreuen, die durch Scherung-induzierte Ausrichtung während der Pipettieren der Probe auftreten. Pretest Experimente sind für die Aufnahme der Zeitentwicklung (Zeit Sweep) des Systems während Gleichgewichtherstellung Ermittlung des erforderlichen Zeitrahmens empfohlen. Sobald die Signale Hochebenen ohne weitere Änderungen zu erreichen, ist das System equilibriert. Einmal Gleichgewichtherstellung Bedingungen festgestellt worden, die gewünschten Tests wie eine Belastung Rampe oder f oder γ-Sweeps, ausgeführt werden kann. Ein breites Spektrum an Sorten testen kann letztlich das Netzwerk oder die Verbindung zu den Platten zerstören. Jedoch wenn Tests auf Belastungen unterhalb der Schwelle der Bruch beschränkt sind, können Belastung Rampen und fegt iterativ wiederholt werden, um mögliche Hysterese oder Alterung Auswirkungen zu untersuchen. Bei f-Sweeps, Messzeiten können stark variieren. Testen von niedrigen Frequenzen drastisch verlängert die Experimente, da einer Schwingung kann mehrere Minuten dauern. Beachten Sie, dass, im Falle von nHTs, f-fegt zeigen, dass der Elastizitätsmodul G' übersteigt der viskosen Modulus G'' um etwa eine Größenordnung, die veranschaulicht die vorherrschende elastischen Reaktion dieser Systeme ( Abbildung 5). Im Allgemeinen können die verschiedenen Arten von Experimenten mit kurze feinhergehen-Sweeps vor und nach dem wichtigsten Experiment zu überprüfen, ob das System durch die Messung selbst ungestört blieb. Jedoch haben einige Maschinen, die zugrunde liegenden motor-Modus für die verschiedenen Arten von Messungen, zu ändern, vor allem beim Wechsel von dynamische Versuche (z. B. Schwingungen für f-fegt) zu einer statischen Belastung Rampe. Diese Änderung wird oft durch spontane große Stämme das Netz zerstören und Anlassen nachfolgende Messungen begleitet. Daher empfiehlt es sich, überprüfen die Spezifikationen des dem Rheometer verwendet.
Rheologie Experimente auf Actin-basierten Systemen zeigen einen dramatischen Effekt der Protein-Denaturierung in der Luft-Wasser-Grenzfläche des Systems auftreten. Denaturierte Proteine halten unspezifisch zueinander, wodurch bilden eine dichtere Gel, die die mechanischen Eigenschaften des Gesamtsystems stark dominieren kann. Um den direkten Kontakt der Probe mit der Umgebungsluft zu verhindern, können Passivierung-Techniken, die auch zu, die Verdunstung des Wasseranteils der Probe unterdrücken verwendet werden. Drei mögliche Methoden sind: (i) rund um die Probenkammer mit dem gleichen Puffer wie im Beispiel; (Ii) Verwendung von Tensiden die Schnittstelle durch ihre hydrophoben und hydrophilen Domänen abdecken (darauf muss geachtet werden, da einige Tenside mit Polymer Konformationen stören,); oder (Iii) beschäftigt mehr biologisch kompatiblen Lipide mit ähnlicher Wirkung wie Tenside. Es sei darauf hingewiesen, dass nHTs sich nicht fanden zu unterwerfen Denaturierung Effekte an der Schnittstelle, und Ergebnisse sind unabhängig von der Passivierung (Abbildung 6), die eine große potenzielle Fehlerquelle beseitigt. Im Allgemeinen sollte die Probenkammer immer mit einer Kappe versiegelt werden, die mit feuchten Schwämmen ausgestattet werden können, um die Feuchtigkeit in der Kammer zu erhöhen, Verdunstung zu unterdrücken.
Wie kurz beschrieben ist eine potentielle Fehlerquelle in DNA-basierten Systemen bisher unhybridized DNA, wie ungepaarte einzelsträngiger DNA Überhänge bei Mängeln oder an den Enden von Nanoröhren, die weitere Vernetzung Effekte verursachen könnten. Komplementäre kurzen Stränge ist zu untersuchen bzw. zu beseitigen diese Möglichkeit, lässt sich diese klebrige enden. Unsere eigenen Untersuchungen ergab jedoch, dass die Zugabe von Kappung Stränge keinen Einfluss auf die eingeführte nHTs und das Verhalten der verstrickten Netze blieb unverändert (Abbildung 7). Jedoch kann die Deckelung klebriger Ends mit komplementären Sequenzen für andere DNA-basierte (und komplexere) Systeme, unerwünschte Wechselwirkungen zu unterdrücken nützlich sein. Darüber hinaus sollten Proben von nHTs sorgfältig pipettiert werden (z. B. für Verdünnung Schritte und Probenvorbereitung), brechen oder anderen Schäden an den Rohren zu verhindern. Wenn die Lösung pipettiert ist zu grob, die Rohre brechen unkontrolliert, auszusetzen zahlreicher klebrige enden an Defektstellen, führt zu unerwünschten Wechselwirkungen zwischen den Rohren und mögliche Vernetzung im System. Dies stört das Signal und führt versteifende Wirkung sowie nichtlineare Effekte wie z. B. Kaltverfestigung, die in γ-Sweeps (Abbildung 8) sichtbar wird. So pipettieren die verschränkte Lösung sollte nur langsam erfolgen und Pipettenspitzen mit einem ziemlich großen Durchmesser verwenden (schneiden das Ende einer Pipettenspitze ist ratsam) Kräfte an den Rohren, die Schere zu reduzieren.
Im Ergebnis sind DNA nHTs geeignet und sehr anpassungsfähig Modellsystem zu studieren die semiflexiblen Polymere und bulk-Netzwerke aus diese Filamente, Vertreter einer neuen Klasse von mechanisch einstellbaren Hydrogele gebildet. Wenn die Rohre sorgfältig vorbereitet sind, können sie verwendet werden, testen Sie die Wirkung von l-p der Filamente in verschiedenen Fällen. Die Masse rheologische Messung von Netzwerken, zum Beispiel verstrickt, zeigt, dass die theoretisch vorhergesagten Abhängigkeiten von der Elastizitätsmodul mit Konzentration und lp die experimentell abgeleitete Skalierung widersprechen Gesetze (Abbildung 9)9. Die Studie betont, dass die Elastizität eines Netzwerks erhöht werden kann, durch die Erhöhung der Steifigkeit der zugrunde liegenden Polymere. Erhöht die Steifigkeit der ein Hydrogel wurde traditionell durch Zugabe von mehr Polymere zur Lösung oder durch Induktion Querverbindungen zwischen benachbarten Polymere37,38(physikalische oder chemische) erreicht. Ein höherer molekularen Gehalt ist jedoch auch mit einer reduzierten Maschenweite, die Anwendungen wie 3D Zellkultur einschränken kann. Querverbindungen, auf der anderen Seite können auslösen komplexe morphologische Veränderungen innerhalb der zugrunde liegenden Netzwerk-Architektur, die weiter erschwert die präzise Abstimmung der mechanischen Eigenschaften39. Über Netzwerke von nHTs, ermöglicht jedoch eine vollständige Entkopplung von diesen Parametern, wobei die versteifende Wirkung induziert werden kann, durch ausschließlich ändern die Steifigkeit der zugrunde liegenden Fäden, ohne die Maschenweite zu ändern. Darüber hinaus können die Röhre Architekturen speziell geändert werden, um zusätzliche Effekte wie Vernetzung, selektiv zu integrieren, die ebenso in verschränkter Netzwerken schafft weitere Möglichkeiten theoretische Vorhersagen für experimentell zu testen Parameter wiel p oder Crosslink Größe und Stärke für Netzwerke. In der Regel die programmierbare Architektur erweitert die Bandbreite der Anwendungen, so dass für das Studium der lp-abhängige Effekte nicht nur in der Masse, sondern auch auf der Einzel-Molekül-Ebene. Beschriftete Rohre können im Netzwerk zu studieren, zum Beispiel die Abhängigkeit von l-p auf die eindimensionale Bewegung von einem Filament schlauchartige Entbindung, gemeinhin Reptation (Abbildung 10)9eingebettet werden. Wenn diese diffusiven Bewegung sichtbar ist, es wird auch überprüft, die verwickelte Natur des Netzes, da es durch Vernetzung Effekte unterdrückt werden würde. Analysieren die zugrunde liegende Dynamik zeigt auch die Maschenweite des Netzes. Darüber hinaus können diese Rohre verwendet werden, um die Abhängigkeit von der Steifigkeit und Chiralität der zugrunde liegenden Rohre auf die Bildung von Paketen40,41,42,43, zu untersuchen 44 , 45 oder übergeordnete Strukturen, z. B. sternförmige Astern46,47,48,49,50, die durch Vernetzung Effekte oder über induziert werden kann Molekular überfüllten Umgebungen27.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir anerkennen die Finanzierung durch die DFG (1116/17-1) und der Leipzig School of Natural Sciences "BuildMoNa" (GSC-185). Diese Arbeit wurde durch das Fraunhofer-Attract-Projekt 601 683 unterstützt. T. H. nimmt zur Kenntnis, Mittel aus dem Europäischen Sozialfonds (ESF-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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