Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Semiflexible polymerer vise unike mekaniske egenskaper som brukes mye av leve systemer. Systematiske studier på biopolymers er imidlertid begrenset siden egenskaper som polymer stivhet er utilgjengelig. Denne oppgaven beskriver hvordan denne begrensningen er circumvented ved programmerbare DNA nanorør, aktivere eksperimentelle studier av effekten av filament stivhet.

Abstract

Mekaniske egenskaper i komplekse, polymer-baserte myk saken, for eksempel celler eller Research nettverk, kan forstås i verken klassiske rammen av fleksible polymerer eller av stive stenger. Underliggende filamenter forblir utstrakt på grunn av deres ikke-forsvinnende ryggraden stivhet, som er kvantifisert via utholdenhet lengden (lp), men de er også sterke termisk store. Deres endelig bøying stivhet fører til unike og ikke-triviell kollektive mekanikken i bulk nettverk, slik at dannelsen av stabil stillaser på lavt volum fraksjoner samtidig som stor maske størrelsene. Dette underliggende prinsippet er utbredt i naturen (f.eks i celler og vev) minimere høy molekylær innholdet og dermed tilrettelegge diffusive eller aktiv transport. Deres biologiske virkningene og teknologiske bruksmuligheter i biokompatible hydrogels, har semiflexible polymerer vært gjenstand for betydelig studier. Imidlertid forble forståelig undersøkelser utfordrende siden de stolte på naturlige polymerer, som begrepsordbok filamenter, som ikke er fritt tunable. Til tross for disse begrensningene og mangel på syntetisk, mekanisk tunable og semiflexible polymerer, ble begrepsordbok filamenter etablert som den vanlige modellen. En stor begrensning er at sentrale antallet lp ikke kan stilles fritt for å studere virkningen på makroskopisk bulk strukturer. Denne begrensningen ble løst ved hjelp av strukturelt programmerbare DNA nanorør, aktivere kontrollert endring av filament stivhet. De er dannet gjennom filbasert design, der et atskilt sett med delvis komplementære tråder hybridize i en ring struktur med en diskret. Disse ringene funksjonen Trege ender, muliggjør effektiv polymerisasjon i filamenter flere mikrometer i lengde, og vise lignende polymerisasjon kinetics som naturlig biopolymers. På grunn av deres programmerbare mekanikere er disse rørene svært allsidig, romanen verktøy for å studere virkningen av lp på enkelt-molekylet samt bulk skalaen. I motsetning til utgangen filamenter, de forblir stabil over uker, uten nevneverdige degenerasjon, og deres er relativt enkel.

Introduction

På grunn av de komplekse atferd aktivert etter unike mekaniske egenskaper, er semiflexible polymerer grunnleggende byggeklossene i levende materie. I motsetning til fleksible polymerer vedta semiflexible polymerer en utstrakt konfigurasjon på grunn av deres ikke-forsvinnende ryggraden stivhet og fortsatt underlagt sterk termiske fluktuasjoner1. Dermed kan ikke rent stokastiske modeller brukes på deres atferd, som med ekstreme fullt fleksible eller rigide polymerer. Såkalte ormen som kjeden modell2,3,4 ble utviklet for å kvantifisere dette stivhet via lp, som er decay konstant tangent-tangens korrelasjon langs filament4. Hvis lp kan sammenlignes med omkrets (lc) av filament, regnes polymer semiflexible1. Analoge til polakkene i et telt, deres arrangementer i nettverk eller bunter stabiliserer hele kollektive systemet på lavt volum fraksjoner, fører til uvanlig viskoelastiske egenskaper5,6,7, 8,9. Disse strukturene gir høy elastisiteter store mesh størrelser10, opprettholde mekanisk integritet mens fortsatt tilrettelegging diffusive og aktiv transport prosesser. Denne egenskapen er spesielt egnet for biologiske systemer som cytoskeleton eller ekstracellulær matrix, men det er også mye brukt i mat ingeniør1,11,12.

Går utover deres betydning til levende materie, er det avgjørende omfattende undersøke de fysiske egenskapene til disse strukturene for å få verktøy for å utvikle biomimetic materialer eller roman hydrogels. I semiflexible polymerer innebærer dette systematisk fastsettelse av kollektive egenskapene til nettverk som følge av enkelt-filament egenskaper som lp og utviklingen av en beskrivende teoretisk ramme. I banebrytende studier, mobilnettet Research begrepsordbok ble etablert som et modellsystem for semiflexible polymerer og regnes fortsatt mye gull standard5,13,14,15 , 16 , 17. men omfattende studier er begrenset med dette systemet siden de er bundet til de iboende egenskapene av dette proteinet. Ulike teoretiske tilnærminger har å bygge en beskrivelse av ikke-triviell mekanisk på enkelt-filament nivå og har ført til spesielt forskjellige skalering spådommer for avhengigheten av lineære elastiske platå skjær modulus, G 0 (dvs. "elastisitet" av nettverket) med hensyn til konsentrasjon (c) og lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mens konsentrasjon skaleringen er lett tilgjengelig i eksperimenter med utgangen-basert eller andre modellsystemer og mens teoretisk spådommer er blitt bekreftet13,16,24, 25, skaleringen med hensyn til lp har vært eksperimentelt utilgjengelig. Dette er imidlertid en stor begrensning siden lp er også en uavhengig variabel som definere antall semiflexible polymerer.

Dette sentrale, naturlige begrensning pålagt av fast lp av utgangen eller andre biologisk-baserte polymerer som kollagen har nylig blitt løst ved å bruke filbasert DNA rør, som er tunable i sine mekaniske egenskaper 9 , 26 , 27 , 28. små variasjoner i arkitekturene av rør (f.eks forskjellig antall deltagende DNA tråder i enhet ringen) gir distinkte verdier for lp, som kan evalueres via fluorescens mikroskopi, enten ved å analysere en varierende tube eller ved å evaluere buet konfigurasjoner av flere adhered rør, som beskrevet tidligere9,28. Disse analysene viste at lp -verdier mellom de ulike tube varierer over flere størrelsesorden og at ulike evaluering gir konsistente resultater9,28.

Overraskende, er den totale skaleringen av lineære elastiske platå skjær modulus G0 med hensyn til konsentrasjon og lp rapportert å være uforenlig med alle tidligere teoretiske tilnærminger 9, spesielt demonstrere en mye sterkere enn anslått avhengighet av lp. Disse funnene vektlegger verdien av en ny modellsystem å studere sentrale egenskapene til semiflexible polymerer. Ansette n-helix DNA rør dramatisk utvider omfanget av disse undersøkelsene. Ikke bare kan lp fritt variert uten å endre det grunnleggende materialet, men iboende programmerbare natur DNA kan aktivere systematisk undersøkelse av flere elementer som krysskoblinger eller kinetisk bytte prosesser. I tillegg disse rørene er løselig i vann, og i motsetning til de fleste proteiner, stabil i tilstrekkelig pH og ioniske forhold i flere uker, uten synlig fornedrelse9.

Å sette sammen disse rør, et atskilt sett med DNA oligonucleotides brukes, hver inneholder to domener deler komplementære base sekvenser til to nabokommunene tråder (på grunn av de spesifikke sekvensene, en enkelt tråd kan ikke danne strukturer som hårnåler). Sekvenser komplementære hybridize i en syklisk måte, danner innesluttet, halv-overlappende ringer n sammen dobbel-spiralformede segmenter (figur 1A og B). Disse ringene skjemaet på en diskret diameter (figur 1 c) og deres halv-overlappende konfigurasjon viser aksial klissete ender komplementær til en annen ring klissete ender. Dette selektiv tillegg med matchende oligonucleotides utløser en stabling ringer, fører til effektiv polymerisasjon av trådformede DNA helix rør størrelse n (nHT). Deres kontur lengder måle vanligvis flere mikrometer i lengde, og lengde distribusjonen er sammenlignes med begrepsordbok, filamenter,9,,26,,27,,28. Det har vært vist for lignende DNA nanorør at de faktisk viser polymerisasjon kinetics ligner begrepsordbok filamenter og piskehale som hengerp class = "xref" > 29. Avhengig av mange n av personlige DNA tilnærmingene som utgjør den grunnleggende ring strukturen, kan nHT arkitektur, samt sine omkrets og diameter, controllably endres. Mer DNA tilnærmingene øker omkretsen av ringer/rør, og tilsvarende arkitektoniske endringen Skift de mekaniske egenskapene til høyere lp verdier (figur 1 c), tilsvarer en høyere stivhet. På Mesoskopisk skala, oversette disse større lp verdiene til mindre bøyd konformasjonen på grunn av høyere stivhet (figur 1 d og E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse n HTs

Merk: her, n angir antall ulike enkelt DNA tilnærmingene involvert i dannelsen av Spiralen rørene av en viss størrelse. N = 8, åtte ulike enkelt DNA tilnærmingene utgjør en enhet ring.

  1. Kjøp DNA-sekvenser (HPLC renhet klasse eller høyere) fra en egnet DNA-syntese tjeneste eller utføre høykvalitets syntese og rensing (et eksemplarisk sekvenser er gitt i tabell 1).
  2. Resuspend lyofiliserte oligonucleotides renset vann og følge den videre rørets skritt gitt i tilsvarende manualen fra selskapet. Justere mengden vann for å få en endelig konsentrasjon av 200 µM.
  3. Bestem konsentrasjoner av enkelt DNA tråder for å kontrollere verdiene gitt av distributøren (f.eks via UV-Vis spektroskopi på 260 nm) siden den eksakte støkiometri er avgjørende for monteringen. Beregn konsentrasjonen oligonucleotides, tar hensyn til molar egenvekt og utryddelse koeffisient for hver enkelt-strandet DNA oligonucleotide.
    Merk: Utryddelse koeffisienten verdiene iboende varierer for de forskjellige sekvensene og er oppgitt i dokumentasjonen for kjøpt kommersielt DNA. De kan også beregnes etter nærmeste nabo modellen med en rekke fritt tilgjengelig online verktøy. For å overholde lineær rekke spektrometer, vurdere fortynne prøven brukt for konsentrasjon besluttsomhet.
  4. Bruker brønnene, bland DNA tilnærmingene-hvert på samme konsentrasjon i en beholder egnet for thermocycler (f.eks en 200 µL PCR tube) å danne ønskede n HTs (endelig buffer forhold: 1xTE (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8) og 12.5 mM MgCl 2).
    Merk: Siste DNA n HT-prøver består av n - 1 tråder, U 1 − U n − 1 og en T n tråd. Konsentrasjonen per strand kan variere fra sub-micromolar til mer enn 10 µM, avhengig av behovene til brukeren (f.eks < 1 µm per strand for påfølgende fortynning å observere enkelt filamenter eller høyere konsentrasjoner for undersøkelse av tett nettverk mekanikk).
  5. Hybridize n HTs i en thermocycler (rødsprit i 10 min ved 90 ° C, med en påfølgende hastig miste til 65 ° C, langsom temperaturen reduseres fra 65 ° C til 55 ° C, med supplerende base sammenkobling i 20 temperatur trinn-0.5 k i 30 min hver; og en rask nedgang fra 55 ° C til 20 ° C) se figur 2A.
    Merk: Punktene langsom reduksjon fra 65 ° C kan bli forlenget for å øke den gjennomsnittlige tube lengden; men det påfølgende raske miste 20 ° c er avgjørende for å unngå aggregering av polymerized rør.
  6. Lagre hybridisert n HTs 3 uker på 4 ° C uten synlig nedverdigelsen.
    Merk: Til fluorescens hybridiserte mikroskopi, merket n HTs ved å erstatte (delvis) U1 med den endrede U1-Cy3 (tabell 1). For lengre observasjon, tillegg av etablerte anti-blekemidler agenter anbefales.
  7. Nøye fortynne prøve å ønsket endelige konsentrasjonen (f.eks 4 µM for nettverk eller 20 nM for single-filament observasjoner) ved hjelp av bufferen for eksempel om nødvendig. For å minimere mulige feilkilder, samle eksempler på ønsket endelige konsentrasjonen.

2. Skråstille Reologi

  1. Velg en passende geometri (plate-plate eller kjegle-plate) for dynamisk skjær rheometer. For små volumer (dvs. under 200 µL) bruke kjegle-plate geometrien.
  2. Laste utvalget på dynamisk skjær rheometer.
  3. Passivate luft-vann-grensesnittet i eksempelet og miljø benytter det fulgte skritt for å forhindre potensielle fordampning virkninger.
    1. Omgir prøven med 2,5 mL eksempel buffer badekaret.
    2. Legge til en surfactant rett under micelle konsentrasjonen.
    3. Bruker en Hamilton sprøyte for å omgi prøven med en lipid å unngå direkte kontakt for utvalget med luft.
  4. Forsegle eksempel kammer med en cap utstyrt med våte svamper og, hvis mulig, med en ekstra vannbad (ikke i kontakt med prøven) å undertrykke fordampning.
  5. Starte målingen ved hjelp av rheometer-spesifikk programvare ved romtemperatur, eventuelt utføre måling ved forskjellige temperaturer, som 37 ° C (hvis fysiologiske forhold er nødvendig).
    Merk: Kjøling prøven er ofte ledsaget av kondens av vanndamp fra omkringliggende luften, mens oppvarming fører til økt fordampning. Begge effekter endrer ukontrollert konsentrasjonen av prøven, slik at alle mål i en serie bør utføres på en konstant temperatur.
  6. Kan prøve å equilibrate for 2 timer ved romtemperatur. Tid utviklingen kan overvåkes med en gangen feie (én punkt per minutt, belastning γ = 5%; frekvens f = 1 Hz).
  7. Måle de mekaniske egenskapene med ønsket test protokoller. Start med en rekke frekvens feier (f-feier) fordi de la prøven intakt og tillate flere målinger.
    Merk: I tillegg kort f-feier burde bli utført før og etter lengre målinger (for eksempel lang f-feier med mye høyere oppløsning) å bekrefte at prøven uforandret gjennom hele måling protokollen.
    1. Utføre en kort f-feie (f.eks γ = 5%. f = 0,01 Hz til 30 Hz; 5 datapunktene per tiår).
    2. Utføre en lang f-feie (f.eks γ = 5%. f = 0,001 Hz til 30 Hz; 21 datapunktene per tiår); lavfrekvent regimet kan utelates hvis ikke nødvendig å måling.
    3. Utfører en kort f-feie.
    4. Utfører en γ-fei (f.eks f = 1 Hz; den ble = 0.0125% til 100%. 20 datapunktene per tiår).
      Merk: Bruk kort f - feie først, som det er vanligvis uforenlig med forrige f - feier fordi nettverk vanligvis ruptur under γ-feie eller koble fra platene. Alternativt bruke γ-rampen (f.eks = 0.025 s -1, t = 60 s); imidlertid ramper krever vanligvis endre motor modus, så etterfølgende kort f-feier ville være falsifisert.
  8. Bin og/eller glatt rådata med kjerne Gaussian.

3. fluorescens-assistert analyse av Annealing DNA

  1. forberede 8 dele 12 µL for hvert utvalg bruker 1-4 µM DNA per strand, 12.5 mM MgCl 2 i 1 x TE buffer og 1 x nukleinsyre gel flekker fra en 10 000 x DMSO lager. Gjøre en negativ kontroll med ingen DNA, men inkluderer nukleinsyre gel flekken.
  2. Overføre dele til en sanntid PCR-plate og forsegle med selvklebende folien (f.eks en 96-brønns reaksjon plate).
    Merk: De høye temperaturene som brukes i termisk annealing protokoller vil fordampe prøver. Derfor sørge for at brønnene er tett forseglet med selvklebende folien å hindre vann fordampning og konsentrasjon økningen, spesielt under langsiktige eksperimenter.
  3. Sentrifuge platen 100 x g for 1 min ved romtemperatur å fjerne gassboblene; hvis gassboblene utvider, brønnene kan ikke analyseres.
  4. Laste forseglet platen i et sanntids kvantitative PCR.
  5. Kjøre en annealing program. Denature DNA ved 90 ° C i 10 min. slipp temperaturen til 72 ° C. Deretter redusere temperaturen sakte med 0,5 ° C enhver 30 min. Etter at signalet har forfalt, akselerere temperatur rampen.
    Merk: 72 ° C er tilstrekkelig over den virkelige hybridisering temperaturen; dermed signal registreres over et bredt temperaturområde egnet for å bestemme nødvendige temperaturområdet.
  6. Kontroller at lokket av cycler varmer minst 100 ° c å hindre kondens i fordampet utvalg på lim.
  7. Ved monteringen, opphisse prøvene med en argon-ion laser på 488 nm og oppdage fluorescens på 550 nm ved en nukleinsyre gel flekk (eller spectrally lignende). For andre fargestoffer, velger du en passende eksitasjon/utslipp kombinasjon. Måle fluorescens signalet så ofte som mulig for å øke totalt signalkvaliteten bruke webkameraet.
    Merk: Her målinger ble tatt hver 9 s.
  8. Hvis forhåndsinnstilte smelter og avspenning programmer brukes, bruker den medfølgende programvaren for å analysere dataene. Hvis ikke, trekke tidligere middelverdien fra middelverdien for hvert temperatur trinn å få den relative endringen av fluorescerende.

4. AFM Imaging

  1. Cleave glimmer (f.eks glimmer " V1 ") det øverste laget av glimmer bør fjernes av feste kommersielt tilgjengelig teip og ripping det off;.
  2. Ved hjelp av brønnene, innskudd pre-formet n HT Mg 2 + inneholder folding buffer på den nylig cleaved glimmer og la det seg ned i 10 min.
  3. Spinne prøvene i korte 3-s intervaller på 2000 x g på en lite bord sentrifuge fjerne gjenværende væsken. Flere n HTs fortsatt skal være knyttet til glimmer overflaten.
  4. Bruke en cantilever tips med en høy stivhet (f.eks 54 Nm -1) og finne sin resonansfrekvens med interne AFM programvaren.
  5. Post høyde profilen med AFM i luften i å tappe modus på lav skanning priser (f.eks 1 linje/s) å unngå skade eller fortrenge n HTs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Montering av DNA nanorør via en temperatur rampe (figur 2) er en svært pålitelig metode til disse kunstig semiflexible polymerer. Disse polymerer har sammenlignbare egenskaper for motpartene naturlig forekommende, som begrepsordbok filamenter, men gir et mye bredere eksperimentelle rammeverk siden sine mekaniske egenskaper kan være controllably endret9,27 . Som biopolymers, de kan arrangeres i nettverk (Figur 3) og tillater spesielt en å teste effekten av filament stivhet på bulk strukturer og egenskaper. Som vist i Figur 4, viser disse nettverkene en lineær belastning regime for stammer opptil 10%, som ligner på egenskaper av nettverk av utgangen filamenter. I dette regimet, kan lineær skjær Reologi lett brukes for eksempel for å fastslå elastisk og tyktflytende responsen av DNA nanotube nettverk analysert på forskjellige frekvenser9. Disse testene viser at disse nettverkene hovedsakelig fungerer elastisk (figur 5). I motsetning til målinger med proteiner, disse rørene ikke denature i luft-vann-grensesnittet på utvalget og derfor sofistikert passivation strategier er nødvendig (figur 6). Derfor håndtering av prøvene er ganske grei, og har vist seg for å være svært robust, gir konsistente resultater med lav prøve å sample variasjoner.

Men kan spørsmålet om gratis "klebrig ender" kortet enkelt-strandet DNA i begge ender av hver rør indusere uønsket, stokastiske hybridisering hendelser forble. For å møte denne bekymringen, ble utfyllende "end cap" sekvenser dekker endene av røret lagt til utvalget etter hybridisering prosessen var ferdig. Figur 7 illustrerer imidlertid at capping endene av filamenter har ingen synlig innflytelse og at rør endene ikke Fremkall noen forbigående crosslinking effekt i nettverket9. Stikker hendelser bare spille en betydelig rolle når prøven er håndtert for lag og rør bryte på grunn av harde pipettering. Poengene brekkasje synes faktisk å indusere crosslinking effekter, fører til ikke-lineære svar av systemet, som belastning stiffening (Figur 8).

Hvis utvalgene er nøye forberedt, kan de brukes til å teste virkningen at filament konsentrasjonen (figur 9A) eller filament stivhet (figur 9B)9 har i nettverk som består av mekaniske egenskaper semiflexible polymerer. For første gang, ble kvantitativ tilkoblingen mellom filament stivhet og nettverk elastisitet studert eksperimentelt og systematisk, gir en lineær lov virkemåte som motsier dominerende teoretisk spådommer. Disse resultatene viser at DNA nanorør er en ny, allsidig verktøy for å studere virkningene av semiflexible polymerer, som var tidligere eksperimentelt utilgjengelige9,27. Nå, ulike teorier kan eksperimentelt testes, involverer uttalelser om avhengigheter på utholdenhet lengde lp filamenter. I tillegg kan svært grunnleggende effekter, for eksempel reptation (Figur 10), bli undersøkt fra ulike perspektiver ved hjelp av rør som varierer i stivhet.

navn Sekvens
U1: a1 *-b1 *-a2-b2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
U11: a11 *-b11 *-a12-b12 AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
T4: a4 *-b4 *-a1-b1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
Beskyttelseskappe A1 CCTAATCGCC
Beskyttelseskappe A2 CCTTTAGATCC
Beskyttelseskappe A3 CCACTCTTCC
Beskyttelseskappe A4 CCGTGAGAACC
Beskyttelseskappe A5 CCGCACGACC
Beskyttelseskappe A6 CCAACGATGCC
Beskyttelseskappe A7 ATGCACCTCC
Beskyttelseskappe A8 AACGGTAACTA
Beskyttelseskappe B1 * ACGCTAAGCCA
Beskyttelseskappe B2 * ACCAGATACA
Beskyttelseskappe B3 * ACAAGATGTCA
Beskyttelseskappe B4 * ACGCATTGCA
Beskyttelseskappe B5 * ACTGTCGAACA
Beskyttelseskappe B6 * ACTTCTATCA
Beskyttelseskappe B7 * CATTCAAAGCT
Beskyttelseskappe B8 * TCCCAAGTCA

Tabell 1: Eksempel på DNA sekvenser for hybridization av nHTs vises i figur 1 c, som også ble brukt i tidligere studier på nHTs9, class = "xref" > 26,27,28. Angitt antall sekvenser tillater montering av syv forskjellige tube arkitekturer (f.eks a1 arten med komplementære sekvens a1 *). Andre tube arkitekturer ikke gitt her kan også dannes av addisjon eller subtraksjon av tråder ledsaget av den ifølge cyclization strand n med U1.

Figure 1
Figur 1: rør montering og arkitektur. (A) skjematisk av en 4HT dannet av fire distinkte 42-mers. Tilstøtende single-strandet DNA tilnærmingene hybridize gjennom kontinuerlig skiftende domener 10-11 baser, angitt med lange svarte merker (kort svart flått indikere unhybridized baser). Denne halv-sjanglet motiv funksjoner klissete ender på begge sider langs aksen, angitt slik at aksial vekst, med pilen. Grensen tråder U1 og T4 har også komplementære domener og dermed danne en lukket ring, som indikert av høyrepilen. Skissen er en 2D representasjon; i hybridisert staten, tråder form dobbel helikser og alle baser er koblet sammen. (B) Quasi-3D skjematisk av en 4HT tetramer med to dobbel helikser dekket i skyggelagt Fjern laget. Dobbel helikser form for utfyllende domener og er koblet til begge tilstøtende dobbel helikser av den en gang per enhet lengde element. En U2 tråd trekkes tykkere klarhet. (C) eksempler på syv forskjellige tube arkitekturer er gitt, med strand tall fra 4 HT 14 HT og lp spenner fra 1.2 til 26 µm. (D og E) Epi-fluorescerende bilder av Cy3-merket, adsorbert 5 HT og 10 HT illustrerer de forskjellige stiffnesses via ulikt buet konturer. Den røde overlappingen er filament konturen funnet via bildeanalyser, med gjennomgående avstand R og omkrets lC. Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: temperatur rampen og tilsvarende montering av DNA nanorør. (A) DNA nanorør er samlet i en thermocycler via en protokoll som inneholder flere forskjellige temperatur trinnene over omtrent 11 h. (B) i en real-time kvantitativ PCR system, den relative endringen av fluorescerende farget tråder er et mål for nyopprettede double-strandet DNA samtidig gå gjennom temperatur rampen. Avhengig av DNA nanorør, kan montering hastigheten variere. Flere komplekset danner struktur, den bredere forsamlingen, antagelig siden flere tråder (og derfor mer segmenter med forskjellige sekvenser og lokale annealing) må du hybridize til de riktige posisjonene, en prosess som er drevet av Stokastisk termiske fluktuasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant AFM bildet av en fanget nettverk av 8HTs på 4 µM. Høyde profilen av en preformed nettverk av 8HTs absorberes til en glimmer overflate ble spilt inn med tappe modus i luften. AFM bilder visualisere en 2D-projeksjon av nettverket, men tillater ikke for pålitelig utvinning av data (f.eks mesh størrelsen) for 3D saken siden rør samt nettverkene er komprimert i en 2D-konfigurasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: lineær området. Press målinger (G' = 1 Hz) avslører et bredt lineære elastiske platå, uten tegn til crosslinking effekter som ikke-lineær oppførsel manifestere som belastning herding. Over en karakteristisk belastning (forskjellig for hver nHT) bryter elastisk platå modulus irreversibelt. Feilfeltene hver representerer standardavviket for middelverdien av alle utførte mål. Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: typisk frekvens avhengighet av en fanget 6HT nettverk. Nettverk av DNA rør viser et bredt elastisitet platå over fire størrelsesordener, avhengig av anvendt frekvensen. Som forventet for en polymer nettverk, den elastiske delen (G') av komplekse skjær modulus er betydelig høyere enn den flytende delen (G''). Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Ingen air-flytende grensesnitt effekter. Frekvens feier (f-feier; γ = 5%) av 8HT eksempler på 8 µM avslørt at påvirkning av fordampning og gelation effekter i luft-vann-grensesnittet er ubetydelig. Forskjellige balanse ganger, samt to metoder kjent for å drastisk redusere protein klynger på grensesnittet (tensider og lipider), ble brukt. Uavhengig av metode, ingen indikasjon på drastisk påvirkninger av fordampning eller overflate elastisitet ble registrert. Her, G' representerer elastisk modulus og G'' representerer tyktflytende modulus (stiplet linje). Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: ingen innflytelse på slutten modifisering. Elastisk platå modulus forblir konstant når capping klissete gratis endene av 8HTs med sine respektive komplementære sekvenser. Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: påvirkning av håndteringsprosedyrer av preformed DNA nettverk på målingen. Avhengig av hvordan håndteres preformed nettverk etter hybridisering, kan målene variere. I dette eksemplet skjær flyten under pipettering av DNA Nanorør har blitt drastisk variert og rør brøt hvis håndtert for lag. Brudd fører til uønsket interaksjon mellom utsatt, utfyllende single-tråder samkjøre ødelagt eller sprukket segmenter, som fører til en økning i elastisitet og induserer ulineær effekter, such som belastning herding (økning av elastisitet for store belastninger, grønne kurve). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: DNA nanorør aktiverer studiet av lp avhengigheter. (A) studerer nettverk av semiflexible polymerer med nHTs gjør etterforskningen av mekanisk responsen av systemet med økende konsentrasjon (konsentrasjon feie), analogt med studier basert på biopolymers som utgangen. (B) i tillegg til forskjellige arkitekturer av rør lette fastsettelse av mekanisk respons med hensyn til de varierende lp av underliggende filamenter, som er umulig med naturlig forekommende semiflexible polymerer. For dette formålet, er dataene fra A replotted å ta skaleringen av elastisk platå modulus forhold til lp. Feilfeltene hver representerer standardavviket for middelverdien av alle utførte mål. Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: Reptation og mesh. Innspilling fluorescens bilder av reptating filamenter (single-merket DNA 8HT innebygd i et umerket nettverk; c = 14 µM) kan brukes til å kontrollere fanget natur filamenter i nettverket. Crosslinking effekter ville hindre denne endimensjonal spredning. Innfelt: Reptation analyse kan brukes til å bestemme mesh størrelsen skalering med konsentrasjoner, som sammenligner vel til utgangen målinger og enig med teoretisk spådommer30. Feilfeltene hver representerer standardavviket for middelverdien av alle utførte mål. Figur tilpasset fra Schuldt et al9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å få riktig formet nettverk, er montering DNA nanorør et viktig skritt. Feil under synteseprosessen innvirkning negativ rør kvalitet; Det anbefales derfor at HPLC eller en strengere prosessen brukes til å rense oligonucleotides. Siden dannelsen av diskret enn akkumulert DNA nanorør, samt lengden distribusjonen, avhenger av den ekvimolare støkiometri av n konstituerende oligonucleotides innenfor settet, er det nødvendig å remeasure konsentrasjonen av innkjøpte tråder, siden gitt verdiene kan variere betydelig fra faktiske konsentrasjonen. Dette kan utføres, for eksempel av UV-Vis spektroskopi på en absorbansen bølgelengden til 260 nm. Vi ønsker å merke seg at molekylvekt og utryddelse koeffisienter varierer mellom ulike sekvenser; Derfor bør det verdier å oversette absorbansen i konsentrasjon fastsettes for hver DNA oligonucleotide. Når du bruker utstyr optimalisert for lite utvalg volumer, for eksempel en NanoDrop, bør hver målingen tatt flere ganger og gjennomsnitt. Overholde lineær rekke påvisning av spectrometer. Fortynne brøken brukt til konsentrasjon besluttsomhet hvis nødvendig. Liten unøyaktigheter kan ha stor innvirkning på riktig støkiometri og kvaliteten på røret formasjon; Derfor må pipettering av singelen tråder være så nøyaktig som mulig. Deretter bør siste prøve løsningen blandes grundig av sakte pipettering prøven opp og ned før du setter det inn i thermocycler. Hvis trådene har endret med fluorescerende fargestoffer for visualisering, bør alle trinnene utføres i et miljø som er skjermet fra lys, og senere tillegg av etablerte anti-blekemidler agenter (dvs. oksygen scavenging systemer, som glukose oksidase/catalase) anbefales. Etter singelen tråder er blandet i riktig buffer forhold, brukes en temperatur rampe hybridize strukturer (figur 2A). Denne temperaturen mønsteret følger tidligere fastsatte kritiske hybridisering temperatur, hvor DNA dobbel helikser skjema. Flere metoder har blitt utviklet for å analysere DNA hybridisering kinetics (dvs. opprinnelige DNA UV absorbansen31, calorimetry32eller fluorescerende fargestoffer33). I sistnevnte metoden intercalate fargestoffer i DNA dobbel helikser, danner svært fluorescerende komplekser lysere enn de ubundne fargestoffer. De binder delvis double-strandet men ikke enkelt-strandet DNA34. Derfor slike fargestoffer er brukt for å overvåke DNA nanostructure selvtillit forsamlingen i systemet35 og kan brukes til å identifisere ideelle montering forhold.

I utgangspunktet alle double-strandet DNA i prøven, som forhåndsdefinerte og uforutsett dupleks, er denaturert ved høy temperatur (90 ° C) å unngå utilsiktet base sammenkobling. En etterfølgende gradvis nedgang i temperaturen (lik figur 2A) reduserer termisk bevegelsen av DNA tilnærmingene, slik at base paring hendelser. På grunn av minimering av den frie energien hybridize DNA tilnærmingene fortrinnsvis på de komplementære sekvensene. Når en dsDNA-spesifikke intercalating fargestoff brukes, øker lysstyrken med dannelsen av svært fluorescerende komplekser, som er igjen et kvantitativt mål for nyopprettede double-strandet DNA34. Den relative endringen av fluorescens for dannelsen av 4HTs og 8HTs er tegnet inn i figur 2B. Dette relative endringen beregnes ved snitt fluorescens intensiteten for hver temperatur og deretter trekke fra gjennomsnittsverdien av tidligere temperaturen. Med minkende temperatur, en opphøyet fluorescens kan være oppdaget (figur 2B) og toppen av denne kurven uthever temperaturen der massive hybridisering hendelser inntreffer. Slipp av kurvene refererer til intensitetsverdiene nådd et platå. Avhengig av DNA Konstruer og sin kompleksitet (f.eks en liten eller stor sett av DNA tråder), kan toppen være skarpe (figur 2B, blå kurve) eller bred (figur 2B, grønne kurve). Når dette bør testes for hver nydesignede struktur for å sikre at den gradvis avtagende delen av temperatur rampen inneholder området der dannelsen av rør via dannelsen av hybridisert dsDNA segmenter skjer. Etter riktig temperatur er regimet bestemt, nanostrukturer kan være vellykket samlet i svært smale temperaturområdet (figur 2B, blå kurve), eller selv isothermally35. Merk at hybridization av flere DNA tråder i periodiske lattices induserer samarbeidende annealing effekter35,36, som støtter ytterligere DNA avspenning. Det anses at intercalating fargestoffer strekker DNA helikser utover deres standard 10,5 base parene per spiralformede slå konfigurasjon, dermed endre generelle geometrien i rørene. Derfor er det ikke tilrådelig å heve fargestoff konsentrasjonen over ett molekyl per 900 DNA base parene35. Videre kan peak montering temperaturen avvike fra den faktiske optimal annealing temperaturen. Oppnå høy presisjon og bestemme beste tilstanden for rør formasjonen, bør DNA hybridisering undersøkes under mange skiftende sakte temperatur skritt, som bør kontrolleres med agarose gel geleelektroforese. For tilfelle av DNA nanorør etablerte vi en tretrinns protokoll. Først er prøven oppvarmet til 90 ° C til denature DNA til singelen tråder. Deretter er et bredt temperaturområde (rundt montering toppen av fluorescens) dekket. I vårt tilfelle, er et spekter av 10 ° C dekket, alt fra 65 ° C til 55 ° C, med et skritt-0.5 ° c enhver 30 min. I det siste trinnet, skal temperaturen raskt slippe romtemperatur - eller, som i vårt tilfelle, 20 ° C - for å unngå eventuelle ugunstige interaksjoner ved middels temperaturer (figur 2A). Vanligvis varme thermocyclers prøvene i kaldere temperaturer. Derfor er det viktig å justere temperaturen på lokket tilsvarende for å begrense fordampningen av væske i eksemplet under assembly, som øker siste eksempel konsentrasjonen.

Hvis nHTs dannes riktig, ordne de i rent fanget nettverk (Figur 3), uten interaksjon forårsaker crosslinking effekter mellom forskjellige rør. Krysskoblinger ville antagelig skyldes kortet DNA segmenter fra feil langs et rør eller klebrige slutter, som vil være gratis å sammenkoble komplementære single-strandet segmenter på nærliggende rør. Disse effektene vil indusere ulineær egenskaper, for eksempel belastning herding (økende G' for større stammer), men de er fraværende i fanget nettverk (Figur 4). De viste γ-feier avslører også de aktuelle lineære belastning regimene for reologiske målinger generelt. Over en viss terskel, nettverket brudd eller mister kontakt med plater rheometer, som irreversibelt skader systemet. Derfor bør brukes stammer være i lineær regimet å få pålitelige data. En belastning på 5% er vanligvis tilstrekkelig til å gi data over støy regimet. Høyere stammer kan brukes. men de nærmer enkelt ruptur terskelen, og resultatene kan være falsifiEd på grunn av måling i ikke-lineære regimet.

Reologiske mål krever en forsiktig og konsekvent forberedelse av prøven og nøye vurdert måling-protokoller for å få reproduserbare og interpretable resultater. Det sentrale punktet er å etablere et helt tilfeldig, isotropic nettverk mellom rheometer platene siden disse nettverkene er stort sett bare reproduserbare strukturen. Dermed for ganske lang balanse ganger (vanligvis rundt 2 h, noen ganger enda mer) å spre noen bestilling effekter som skyldes skjær-indusert justering under den pipettering av utvalget. Pre-test eksperimenter anbefales for opptak tid utviklingen (gangen feie) av systemet under balanse for å bestemme nødvendige tidsrammen. Når signaler når platåer uten videre endringer, equilibrated systemet. Når balanse forhold har blitt bestemt, ønsket testene, for eksempel en rampe eller f - eller γ-feier, kan bli henrettet. Teste et bredt spekter av stammer kan til slutt ødelegge nettverket eller tilkoblingen til platene. Men hvis testene er begrenset til stammer under ruptur terskelen, kan belastning ramper og feier iterativt gjentas for å undersøke mulige aldring eller hysteresis effekter. Ved f-feier, måling ganger kan variere betydelig. Testing lave frekvenser dramatisk forlenger eksperimentene, siden én svingning kan ta flere minutter. Merk at ved nHTs, f-feier avsløre elastisk modulus G' overskrider tyktflytende modulus G'' av ca en bestilling av omfanget, som illustrerer den dominerende elastiske responsen av disse systemene ( Figur 5). Vanligvis ulike eksperimenter kan være ledsaget av kort f-feier før og etter de viktigste eksperimentet å bekrefte at systemet forble uforstyrret av målingen selv. Men noen maskiner har endre underliggende motor for ulike typer målinger, spesielt når du endrer fra dynamisk eksperimenter (f.eks svingninger for f-feier) til en statisk belastning rampen. Denne endringen er ofte ledsaget av spontane store belastninger ødelegge nettverket og tempering påfølgende målinger. Således, det anbefales å sjekke spesifikasjonene for rheometer brukes.

Reologi eksperimenter på utgangen systemer avsløre en dramatisk effekt på protein rødsprit på luft-vann-grensesnittet til systemet. Denaturert proteiner følge uspesifikt til hverandre, og dermed danner en tett gel som kan svært dominerer mekaniske egenskaper for hele systemet. For å unngå direkte kontakt av prøven med den omkringliggende luften, kan passivation teknikker som også å undertrykker fordampning av vanninnholdet av prøven brukes. Tre mulige metoder: (i) rundt eksempel kammeret med samme bufferen som prøven; (ii) bruker tensider for å dekke grensesnittet på grunn av sine hydrofobe og hydrofile domener (må være forsiktig, siden noen tensider forstyrre polymer konformasjonen); eller (iii) bruke mer biologisk kompatibel lipider, med tilsvarende effekter som tensider. Det bør bemerkes at nHTs ikke ble funnet for å være underlagt rødsprit effekter på grensesnittet, og resultatene er uavhengig av passivation metoden (figur 6), som fjerner en stor potensiell feilkilde. Generelt, prøve chamber skal alltid tettes med en lue, som er utstyrt med fuktig svamp å øke luftfuktigheten i kammeret, undertrykke fordampning.

Som kort beskrevet tidligere, en potensiell feilkilde i DNA-baserte systemer er unhybridized DNA, som kortet enkelt-strandet DNA overhangs defekter eller i endene av nanorør, som kan føre til ytterligere crosslinking effekter. For å undersøke og/eller eliminere denne muligheten, kan utfyllende kort tråder brukes til cap disse gule ender. Imidlertid viste våre egne undersøkelser at tillegg av capping tråder hadde ingen effekt på introdusert nHTs og virkemåten til fanget nettverkene forble uendret (figur 7). Imidlertid kan capping klissete ender med komplementære sekvenser være nyttig for andre DNA-baserte (og mer komplisert) systemer å undertrykke uønskede interaksjoner. I tillegg prøver av nHTs bør være pipetted nøye (f.eks for fortynning trinn og prøve forberedelse) å forhindre bryte eller annen skade rørene. Hvis løsningen er pipetted også cirka, rør bryte ukontrollert, utsette stort antall gule ender på feil poeng, fører til uønsket interaksjon mellom rør og potensielle crosslinking i systemet. Dette forstyrrer signalet fører til stiffening effekter og ikke-lineære effekter som belastning herding, som blir synlig i γ-feier (Figur 8). Dermed pipettering fanget løsningen bør bare gjøres sakte og bruker pipette-spisser med en ganske stor diameter (kutte slutten av en pipette tips er tilrådelig) å redusere skjær styrker på rørene.

Avslutningsvis er DNA nHTs et egnet og svært tilpasningsdyktige system å studere semiflexible polymerer og bulk nettverk dannet fra disse filamenter, representerer en ny klasse av mekanisk tunable hydrogels. Hvis rørene er nøye forberedt, kan de brukes til å teste effekten av lp av filamenter i ulike tilfeller. Bulk reologiske måling av fanget nettverk, for eksempel, avslører at teoretisk spådd avhengigheter av elastisk modulus med konsentrasjon og lp er i strid med eksperimentelt avledede skaleringen lover (figur 9)9. Denne studien understreker at elastisitet i et nettverk kan økes ved å øke stivhet av de underliggende polymerer. Tradisjonelt ble økende stivhet av en hydrogel oppnådd ved å legge til flere polymerer løsningen eller inducing krysskoblinger (fysisk og kjemisk) mellom nærliggende polymerer37,38. Imidlertid er en høyere molekylær innhold også forbundet med en redusert maske størrelse, som kan begrense programmer som 3D cellekultur. Krysskoblinger, derimot, kan indusere komplekse morfologiske endringer i de underliggende nettverksarkitektur, som ytterligere complicates nøyaktig tuning av mekaniske egenskaper39. Bruker nettverk nHTs, men gir en komplett frikopling av disse parameterne, der stivne virkningen kan indusert ved kun endre stivhet av underliggende filamenter mens forlate mesh størrelsen uendret. Videre kan tube arkitekturer endres spesielt å selektivt integrere flere effekter som crosslinking, som tilsvarende i fanget nettverk, skaper flere muligheter til å teste eksperimentelt teoretisk spådommer for parametere soml p eller krysskobling størrelse og styrke for nettverk. Generelt, programmerbare arkitekturen utvider omfanget av programmer, gir for studier av lp-avhengige effekter ikke bare i bulk, men også på enkelt-molekylet nivå. Merket rør kan bygges i nettverket for å studere, for eksempel avhengighet av lp på en filament endimensjonal bevegelse i rør-aktige confinement, ofte referert til reptation (Figur 10)9. Hvis denne diffusive bevegelse er synlig, verifiserer også fanget natur nettverket, siden det ville bli undertrykt av crosslinking effekter. Analysere dynamikken underliggende avslører også mesh størrelsen på nettverket. Videre kan disse rørene brukes til å undersøke avhengighet av stivhet og chiralitet av underliggende rørene av bunter40,41,42,43, 44 , 45 eller høyere orden strukturer, for eksempel stjerne-lignende asters46,47,48,49,50, som kan være forårsaket av crosslinking effekter eller via Molecularly overfylt miljøer27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi erkjenner finansiering av DFG (1116/17-1) og Leipzig School of Natural Sciences "BuildMoNa" (GSC 185). Dette arbeidet har vært støttet gjennom Fraunhofer tiltrekke prosjektet 601 683. T. H. erkjenner finansiering fra European Social Fund (ESF-100077106).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

Bioteknologi problemet 128 Reologi semiflexible polymerer utholdenhet lengde DNA rør biopolymers begrepsordbok hydrogel nettverk
DNA nanorør som et allsidig verktøy for å studere Semiflexible polymerer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter