Summary
Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.
Abstract
Mechanische eigenschappen van complexe, polymeer gebaseerde zachte materie, zoals cellen of biopolymeer netwerken, kunnen worden begrepen in noch het Klassiek frame van flexibele polymeren noch van stijve staven. Onderliggende filamenten blijven uitgestrekte als gevolg van hun niet-verdwijnen ruggengraat stijfheid, die wordt gekwantificeerd via de persistentie lengte (l-p), maar ze zijn ook onderhevig aan sterke thermische schommelingen. Hun eindige Buigstijfheid leidt tot unieke, niet-triviale collectieve mechanica van bulk netwerken, waardoor de vorming van stabiele steigers op lage volumegehalten terwijl het verstrekken van grote maaswijdte. Dit onderliggende principe heerst in de natuur (bijvoorbeeld in cellen of weefsels), minimaliseren van de hoge moleculaire inhoud en teneinde diffusive of actief transport. Als gevolg van hun biologische gevolgen en mogelijke technologische toepassingen in biocompatibel hydrogels zijn semiflexible polymeren onderworpen aan aanzienlijke studie. Begrijpelijke onderzoek bleef echter uitdagende, omdat ze vertrouwden op natuurlijke polymeren, zoals de actine-filamenten, die niet vrij afstembare. Ondanks deze beperkingen en wegens het gebrek aan synthetische, mechanisch afstembare en semiflexible polymeren, werden door samensmelting van filamenten actine opgericht als het gemeenschappelijke modelsysteem. Een belangrijke beperking is dat de centrale hoeveelheid lp vrij kan niet worden afgestemd om te bestuderen van de impact ervan op macroscopische bulk structuren. Deze beperking werd opgelost door gebruik te maken van structureel programmeerbare DNA nanobuisjes, inschakelen van gecontroleerde wijziging van de stijfheid van de gloeidraad. Ze worden gevormd door tegel-gebaseerde ontwerpen, waar een discrete verzameling gedeeltelijk complementaire strengen te vermengen in de structuur van een ring met een discrete omtrek. Deze ringen beschikken over sticky ends, waardoor de effectieve polymerisatie in filamenten verschillende micron in lengte, en soortgelijke polymerisatie kinetiek berichtsymbool natuurlijke biopolymeren. Als gevolg van hun programmeerbare mechanica zijn deze buizen veelzijdig, nieuwe hulpmiddelen te bestuderen van de impact van lp op het single-molecuul, alsook de omvang van de bulk. In tegenstelling tot de actine-filamenten, ze blijven stabiel in weken, zonder opvallende degeneratie, en hun behandeling is relatief eenvoudig.
Introduction
Als gevolg van de complexe gedrag ingeschakeld door hun unieke mechanische eigenschappen, zijn semiflexible polymeren fundamentele bouwstenen van de levende materie. In tegenstelling tot flexibele polymeren vast semiflexible polymeren een uitgestrekte configuratie als gevolg van hun niet-verdwijnen ruggengraat stijfheid terwijl nog onderworpen aan sterke schommelingen van de thermische1. Dus worden niet puur stochastische modellen om hun gedrag, net als bij de uitersten van volledig flexibele of stijve polymeren toegepast. De zogenaamde worm-achtige keten model2,3,4 werd ontwikkeld om te kwantificeren deze stijfheid via de lp, dat is de constante verval van de correlatie van de tangens-tangens langs de gloeidraad4. Als lp vergelijkbaar met de contour lengte (lc) van de gloeidraad is, wordt het polymeer beschouwd als semiflexible1. Analoog aan de Polen van een tent, hun regelingen in netwerken of bundels stabiliseert het gehele collectieve systeem op laag volume breuken, wat leidt tot ongewone visco eigenschappen5,6,7, 8,9. Deze structuren bieden hoge elasticiteit van de grote mesh maten10, behoud van mechanische integriteit terwijl nog diffusive vergemakkelijken en actief transportprocessen. Deze eigenschap is vooral geschikt voor biologische systemen zoals het cytoskelet of de extracellulaire matrix, maar het wordt ook op grote schaal gebruikt in voedsel engineering1,11,12.
Die verder gaan dan hun betekenis aan levende materie, is het cruciaal voor de fysische eigenschappen van deze structuren uitvoerig te onderzoeken om de tools te ontwikkelen biomimetische materialen of Roman hydrogels. Dit betekent in termen van semiflexible polymeren, de systematische bepaling van de collectieve eigenschappen van netwerken als gevolg van single-filament eigenschappen zoals lp en de ontwikkeling van een beschrijvende theoretisch kader. Aantal baanbrekende studies, de cellulaire biopolymeer actine werd opgericht als een modelsysteem voor semiflexible polymeren en wordt nog steeds beschouwd als de gouden standaard5,13,14,15 , 16 , 17. uitvoerige studies zijn echter beperkt met dit systeem omdat ze zijn gebonden aan de inherente eigenschappen van dit eiwit. Verschillende theoretische benaderingen hebben gericht op het opbouwen van een beschrijving van de niet-triviale mechanische problemen op het niveau van de single-filament en hebben geleid tot met name verschillende schalen voorspellingen voor de afhankelijkheid van de lineaire elastische plateau afschuifmodulus, G 0 (dat wil zeggen, de "elasticiteit" van het netwerk), met betrekking tot concentratie (c) en lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Terwijl de concentratie schaal gemakkelijk toegankelijk in experimenten met actine gebaseerde of andere modelsystemen is en terwijl theoretische voorspellingen strikt zijn gecontroleerd13,16,24, 25, de schaal met betrekking tot lp experimenteel ontoegankelijk gebleven. Dit is echter een grote beperking omdat lp is ook een onafhankelijke variabele thats de definiërende hoeveelheid semiflexible polymeren.
Deze centrale, natuurlijke beperking opgelegd door de vaste lp van actine of andere biologisch-afgeleid polymeren zoals collageen is onlangs opgelost door gebruik te maken van dakpan DNA buizen, die afstembare in hun mechanische eigenschappen 9 , 26 , 27 , 28. lichte variaties in de platforms van de buizen (bijvoorbeeld verschillende aantallen samenstellende DNA strengen binnen de ring van de eenheid) opbrengst verschillende waarden voor lp, die kan worden geëvalueerd via fluorescentie microscopie, door het analyseren van een schommelende buis of door de beoordeling van de gebogen configuraties van verschillende zelfklevend buizen, als eerder beschreven9,28. Deze analyses bleek dat de lp -waarden van de verschillende buis-bevolking over meer dan één orde van grootte variëren en dat verschillende evaluatietechnieken consistente resultaten9,28opleveren.
Verrassend, is de totale schaal van de lineaire elastische plateau schuintrekken modulus G0 ten opzichte van de concentratie en de lp gemeld als onverenigbaar is met alle eerdere theoretische benaderingen 9, in het bijzonder aan te tonen een veel sterker dan voorspelde afhankelijkheid van lp. Deze bevindingen onderstrepen de waarde van een nieuw modelsysteem voor het bestuderen van de centrale eigenschappen van semiflexible polymeren. Met n-helix DNA buizen dramatisch verbreedt het toepassingsgebied van deze onderzoeken. Niet alleen kan lp vrij worden gevarieerd zonder dat het basismateriaal, maar de inherente programmeerbare aard van DNA een systematisch onderzoek van aanvullende elementen, zoals crosslinks of kinetische switch processen kunt inschakelen. Bovendien, deze buizen zijn oplosbaar in water en, in tegenstelling tot de meeste proteïnen, stabiel in voldoende pH en Ionische voorwaarden voor enkele weken, zonder aantasting van de detecteerbare9.
Te monteren deze buizen, een discrete verzameling van DNA oligonucleotides wordt gebruikt, die elk twee domeinen die delen van de complementaire base sequenties aan twee naburige strengen bevat (als gevolg van de specifieke opeenvolgingen, een enkele streng kan zich geen vormen structuren zoals haar pinnen). De complementaire sequenties te vermengen in een cyclische manier, vorming van gesloten, half-overlappende ringen van n onderling verbonden dubbel-spiraalvormige segmenten (figuur 1A en B). Deze ringen vormen op een discrete diameter (Figuur 1 c), en hun half-overlappende configuratie blootstelt axiale sticky ends complementair aan de kleverige uiteinden van een andere ring. Deze selectieve toevoeging van matching oligonucleotides triggert een stapeling van de ringen, wat leidt tot de effectieve polymerisatie van draadvormige DNA helix buizen van grootte n (nHT). Hun contour lengtes meten meestal verschillende micron in lengte, en de distributie van hun lengte is vergelijkbaar met dat van actine filamenten9,26,27,28. Voor soortgelijke DNA nanotubes is aangetoond dat zij inderdaad polymerisatie kinetiek vergelijkbaar met die van de actine-filamenten en microtubuli vertonen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van n HTs
Opmerking: hier, n geeft het aantal verschillende één DNA-strengen die betrokken zijn bij de vorming van de helix buizen van een bepaalde grootte. Voor n = 8, acht verschillende één DNA-strengen make-up een eenheid ring.
- Aankoop DNA sequenties (zuiverheid HPLC-kwaliteit of hoger) van een geschikte DNA-herstelsynthese service of het uitvoeren van kwalitatief hoogwaardige synthese en zuivering (voorbeeldige sequenties gegeven in tabel 1).
- Resuspendeer gelyofiliseerd oligonucleotides in gezuiverd water en volg de verdere resuspensie stappen in de bijbehorende gebruiksaanwijzing gegeven van het bedrijf. Aanpassen van de hoeveelheid water om een eindconcentratie van 200 µM.
- Bepalen concentraties van één DNA strengen om te controleren of de waarden die door de distributeur (bijvoorbeeld via UV-Vis-spectroscopie op 260 nm) omdat de exacte stoichiometrie is van cruciaal belang voor de assemblage proces. Bereken de concentratie van de oligonucleotides, rekening houdend met de specifieke molaire gewicht en de coëfficiënt uitsterven voor elke single-stranded DNA oligonucleotide.
Opmerking: De waarden van de coëfficiënt uitsterven inherent variëren voor de verschillende reeksen en worden vermeld in de documentatie van commercieel aangeschafte DNA. Zij kunnen eveneens worden berekend volgens het model van de dichtstbijzijnde-buurman met behulp van een aantal vrij beschikbare online tools. Om te voldoen aan het lineaire bereik van de spectrometer, overwegen verdunning van het monster gebruikt voor bepaling van de concentratie. - Met behulp van een micropipet, het mengen van de DNA strengen-geheugen voor elke tegelijkertijd concentratie-in een container die geschikt is voor de thermocycler (bijvoorbeeld een buis van 200 µL PCR) om de gewenste n HTs (laatste buffer voorwaarden: 1xTE (10 mM Tris en 1 mM EDTA, pH 8) en 12.5 mM MgCl 2).
Opmerking: Laatste DNA n HT monsters bestaan uit n - 1 strengen, U 1 − U n − 1, en één T n strand. De concentratie per streng kan variëren van sub-micromolar tot meer dan 10 µM, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker (bijvoorbeeld, < 1 µm per onderdeel voor de daaropvolgende verdunning te observeren enkele filamenten of hogere concentraties voor de behandeling van dichte netwerk mechanica). - Kruisen de n HTs in een thermocycler (denaturatie gedurende 10 minuten op 90 ° C, met een daaropvolgende snelle daling tot 65 ° C; traag temperatuur dalen van 65 ° C tot 55 ° C, met complementaire base paren in 20 stappen van de temperatuur van -0,5 K gedurende 30 minuten elke; en een snelle daling van 55 ° C tot 20 ° C); Zie figuur 2A.
Opmerking: De stappen van de langzame daling van 65 ° C kunnen worden verlengd om de verhoging van de gemiddelde buislengte; echter, de latere snelle daling tot 20 ° C is belangrijk om te voorkomen dat de samenvoeging van gepolymeriseerde buizen. - Slaan de gehybridiseerde n HTs voor maximaal 3 weken bij 4 ° C zonder aantasting van de detecteerbare.
Opmerking: Voor fluorescentie microscopie, label n HTs zijn gekruist door (gedeeltelijk) vervangen door U1 met de gewijzigde U1-Cy3 (tabel 1). Voor langere momenten van de observatie, de toevoeging van gevestigde anti-bleken agenten is aan te raden. - Zorgvuldig verdunnen het monster, tot de gewenste eindconcentratie (bijvoorbeeld 4 µM voor netwerken of 20 nM voor single-filament waarnemingen) met behulp van de buffer monster indien nodig. Om te minimaliseren mogelijk fout bronnen, assembleren monsters op de gewenste eindconcentratie.
2. Schuintrekken reologie
- Kies een passende meetkunde (plaat-plaat of kegel-plaat) voor de rheometer van de dynamische schuintrekken. Voor kleine hoeveelheden (dat wil zeggen, onder 200 µL), gebruik de kegel-plaat geometrie.
- Laden van het monster op de dynamische schuintrekken rheometer.
- Passivate van de lucht-water-interface van het monster en de omgeving met behulp van de volgende stappen uit om te voorkomen dat potentiële effecten van de verdamping.
- Omringen het monster met 2,5 mL van het monster buffer bad.
- Toevoegen van een oppervlakteactieve stof net onder de concentratie micel.
- Gebruiken een spuit Hamilton om te omringen het monster met een lipide direct contact van het monster met lucht te vermijden.
- Zegel van de monsterkamer met een cap uitgerust met natte sponsen en, indien mogelijk, met een extra waterbad (niet in contact met het monster) verder onderdrukken verdamping.
- Start van de meting met behulp van de rheometer-specifieke software bij kamertemperatuur; anderzijds voeren de metingen bij verschillende temperaturen, zoals 37 ° C (als fysiologische omstandigheden nodig zijn).
Opmerking: Koeling van het monster gaat vaak gepaard met de condensatie van waterdamp uit de omringende lucht, terwijl verwarming tot verbeterde verdamping leidt. Beide effecten ongecontroleerd de concentratie van het monster, kunnen wijzigen zodat alle metingen in een reeks moeten worden uitgevoerd bij een constante temperatuur. - Toestaan het monster equilibreer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. De tijdsevolutie kan worden gecontroleerd met een sweep tijd (één punt per minuut; stam γ = 5%; frequentie f = 1 Hz).
- Meten de mechanische eigenschappen met de gewenste testprotocollen. Beginnen met een reeks van frequentie veegt (f-veegt) omdat ze het monster intact te laten en te voor meer metingen zorgen.
Opmerking: Daarnaast korte f-veegt moeten worden uitgevoerd vóór en na langere metingen (zoals lange f-veegt met een veel hogere resolutie) om te controleren dat het monster bleef onveranderd in het gehele protocol volledige meting.- Uitvoeren een korte f-sweep (bijvoorbeeld γ = 5%; f = 0,01 Hz tot 30 Hz; 5 gegevenspunten per decennium).
- Voeren een lange f-sweep (bijvoorbeeld γ = 5%; f = 0,001 Hz tot 30 Hz; 21 gegevenspunten per decennium); het lagefrequentie-regime kan worden weggelaten als niet noodzakelijk voor het verminderen van de tijd van de meting.
- Uitvoeren van een korte f-sweep.
- Voeren een γ-sweep (bijvoorbeeld f = 1 Hz; γ = 0.0125% tot 100%; 20 gegevenspunten per decennium).
Opmerking: Gebruik de korte f - vegen eerst, aangezien er meestal strijdig is met eerdere f - veegt omdat netwerken meestal tijdens γ-sweep scheuren of van de platen losmaken. Γ-oprit (ITMU) gebruiken (bijvoorbeeld = 0,025 s -1, t = 60 s); echter de hellingshoek meestal moeten veranderen van het motor-modus, dus volgende korte f-veegt zouden worden vervalst.
- Bin en/of vlot de onbewerkte gegevens met een Gaussiaans kernel.
3. fluorescentie-bijgewoonde analyse van DNA-gloeien
- bereiden 8 aliquots van 12 µL voor elk monster met behulp van 1-4 µM DNA per streng, 12.5 mM MgCl 2 in 1 x TE buffer, en 1 x nucleïnezuur gel vlek uit een 10.000 x DMSO voorraad. Maken van een negatieve controle met geen DNA, maar omvatten nucleïnezuur gel vlek.
- De aliquots overbrengen in een real-time PCR-plaat en verzegelen met kleeffilm (bijvoorbeeld een reactie van de 96-wells-plaat).
Opmerking: De hoge temperaturen in de thermische gloeien protocollen gebruikt zal verdampen monsters. Dus, zorg ervoor dat de putten zijn strak verzegeld met zelfklevende film om te voorkomen dat water verdamping en concentratie toenemen, met name tijdens langdurige experimenten. - Centrifugeren van de plaat bij 100 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te verwijderen van de gasbellen; als de gasbellen uit te breiden, de putjes kunnen niet worden geanalyseerd.
- De verzegelde plaat in een real-time kwantitatieve PCR-systeem geladen.
- Een onthardende programma uitvoert. Denatureren van het DNA bij 90 ° C gedurende 10 min. Drop de temperatuur snel tot 72 ° C. Vervolgens dalen de temperatuur langzaam door 0,5 ° C om 30 min. Nadat het signaal is vervallen, versnellen de temperatuur oprit.
Opmerking: 72 ° C wordt voldoende boven de temperatuur van de echte kruising; Dus, het signaal is opgenomen over een breed temperatuurbereik geschikt voor het bepalen van het benodigde temperatuurbereik. - Ervoor te zorgen dat het deksel van de cycler tot ten minste 100 ° C verwarmt om te voorkomen dat de condensatie van verdampte monster op de kleeffilm.
- Tijdens de vergadering, de monsters te prikkelen met een laser argon-ion op 488 nm en detecteren de fluorescentie bij 550 nm bij het gebruik van een nucleïnezuur gel vlek (of spectraal vergelijkbaar). Andere kleurstoffen, kies een passende excitatie/emissie-combinatie. Meten van de fluorescentie signaal zo vaak mogelijk te verhogen de totale signaalkwaliteit met behulp van de ingebouwde camera.
Opmerking: Hier, metingen werden verricht elke 9 s. - Als vooraf ingestelde smelten en gloeien van programma's worden toegepast, de meegeleverde software kunnen gebruiken om de gegevens te analyseren. Zo niet, de vorige gemiddelde waarde van de gemiddelde waarde voor elke stap van de temperatuur te verkrijgen van de relatieve wijziging van het fluorescerende signaal aftrekken.
4. AFM Imaging
- klieven mica (bijvoorbeeld mica " V1 ") door verkrijgbare plakband vast te hechten en het rippen uit; de bovenste laag van de mica moet worden verwijderd.
- Pre-gevormde n HT in Mg 2 + met opklapbare buffer op de vers gekloofd mica en laat het voor 10 min. regelen met behulp van een micropipet, storten
- Draaien de monsters in korte 3-s intervallen op 2.000 x g op een tafeltje centrifuge voor het verwijderen van de resterende vloeistof. Verschillende n HTs moet nog steeds worden gekoppeld aan het oppervlak van mica.
- Gebruiken een cantilever-tip met een hoge stijfheid (bijvoorbeeld 54 Nm -1) en het bepalen van zijn resonantiefrequentie met de interne software van de AFM.
- Record het hoogte profiel bij de AFM in de lucht in te tikken modus tegen lage scan tarieven (bijvoorbeeld 1 lijn/s) om te voorkomen dat schadelijk of verdringt de n HTs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De vergadering van DNA nanotubes via een temperatuur helling (Figuur 2) is een zeer betrouwbare methode om te vormen van deze kunstmatige semiflexible polymeren. Deze polymeren hebben vergelijkbare kenmerken aan hun natuurlijke tegenhangers, zoals de actine-filamenten, maar bieden een veel breder experimentele kader omdat hun mechanische eigenschappen controllably worden kunnen gewijzigd9,27 . Zoals biopolymeren, ze kunnen worden gerangschikt in netwerken (Figuur 3) en één voor het testen van het effect van de stijfheid van de gloeidraad op bulk structuren en eigenschappen van dit specifiek toestaan. Zoals blijkt uit Figuur 4, weergeven deze netwerken een lineaire belasting regeling voor spanningen tot 10%, die sterk lijkt op de kenmerken van netwerken van actine-filamenten. Binnen dit regime, zijn lineaire schuintrekken reologie gemakkelijk toepasbaar, bijvoorbeeld om te bepalen van de elastische en viskeuze respons van DNA nanobuis netwerken peilden bij verschillende frequenties9. Deze tests blijkt dat deze netwerken voornamelijk elastisch gedragen (Figuur 5). In tegenstelling tot de metingen met eiwitten, deze buizen niet doen denatureren op het raakvlak van de lucht-water van het monster en daarom, verfijnde passivering strategieën zijn vereist (Figuur 6). Daarom is de behandeling van de monsters is eerder ongecompliceerd en heeft bewezen zeer robuust, opbrengst van consistente resultaten met lage monster-naar-sample variaties.
Echter de vraag of de gratis "sticky ends" van ongepaarde single-stranded DNA aan beide uiteinden van elke buis kan leiden tot ongewenste, stochastische hybridisatie evenementen bleef. Om aan deze bezorgdheid, werden complementaire "end cap" sequenties die betrekking hebben op de uiteinden van de buis toegevoegd aan het monster na de kruising proces compleet was. Figuur 7 illustreert echter dat de aftopping van de uiteinden van de gloeidraad geen aantoonbare invloed heeft en dat de uiteinden van de buis niet voorbijgaande crosslinking effect in de netwerk9doen veroorzaken. Steken gebeurtenissen alleen een belangrijke rol spelen bij het monster ook ongeveer wordt afgehandeld en de buizen breken door harde pipetteren. Deze breuk punten lijken inderdaad te induceren crosslinking effecten, wat leidt tot niet-lineaire respons van het systeem, zoals stam verstijving (Figuur 8).
Als de monsters worden zorgvuldig voorbereid, kunnen ze worden gebruikt voor het testen van het effect dat de concentratie van de gloeidraad (figuur 9A) of de gloeidraad stijfheid (figuur 9B)9 hebben op de mechanische eigenschappen van netwerken bestaande uit semiflexible polymeren. Voor de eerste keer, werd de kwantitatieve verbinding tussen de gloeidraad stijfheid en netwerk elasticiteit bestudeerd experimenteel en systematisch, opbrengst van een lineaire macht wet gedrag, dat in tegenspraak is met de overheersende theoretische voorspellingen. Deze resultaten illustreren dat DNA nanobuisjes zijn een nieuwe, veelzijdig hulpmiddel de effecten van semiflexible polymeren, die voorheen experimenteel ontoegankelijk9,27 warente bestuderen. Nu, verschillende theorieën kunnen worden experimenteel getest, waarbij uitspraken over afhankelijkheden op de persistentie lengte lp van de gloeidraden. Bovendien kunnen zeer fundamentele effecten, zoals reptation (Figuur 10), vanuit verschillende invalshoeken worden onderzocht door gebruik te maken van buizen die in stijfheid verschillen.
| Naam | Volgorde | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| eindkap A1 | CCTAATCGCC | ||
| eindkap A2 | CCTTTAGATCC | ||
| eindkap A3 | CCACTCTTCC | ||
| eindkap A4 | CCGTGAGAACC | ||
| eindkap A5 | CCGCACGACC | ||
| eindkap A6 | CCAACGATGCC | ||
| eindkap A7 | ATGCACCTCC | ||
| eindkap A8 | AACGGTAACTA | ||
| eindkap B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| eindkap B2 * | ACCAGATACA | ||
| eindkap B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| eindkap B4 * | ACGCATTGCA | ||
| eindkap B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| eindkap B6 * | ACTTCTATCA | ||
| eindkap B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| eindkap B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabel 1: Voorbeeld van DNA sequenties voor de kruising van de nHTs weergegeven Figuur 1 c, die werden ook gebruikt in eerdere studies op nHTs9, Class = "xref" > 26,27,28. De opgegeven verzameling sequenties kunt voor de montage van zeven verschillende buis platforms (bijvoorbeeld a1 hybridizes met de bijkomende opeenvolging a1 *). Andere architecturen van de buis die hier niet worden gegeven, kunnen ook gevormd worden door het optellen of aftrekken van strengen vergezeld gaan van het volgens cyclisatie van strand n met U1.
Figuur 1: Tube vergadering en architectuur. (A) schematische voorstelling van de vergadering van een 4e gevormd van vier verschillende 42-mers. Aangrenzende single-stranded DNA-strengen te vermengen door middel van continue wisselende domeinen van 10-11 bases, aangegeven door lange zwarte teken (de korte zwarte teken aangeven unhybridized basen). Dit half-gespreid motief kenmerkt kleverige uiteinden aan beide zijden langs de as, waardoor de groei van het axiale, aangegeven door de pijl. De grens strengen U1 en T4 ook beschikken over aanvullende domeinen en vormen zo een gesloten ring, zoals aangegeven door de pijl-rechts. Merk op dat deze sketch een 2D weergave is; in de gehybridiseerde staat, de strengen vormen double helices en alle basissen zijn gekoppeld. (B) Quasi-3D schematische voorstelling van een tetrameer 4e met twee dubbele helices bedekt met de gearceerde verre laag. Double helices vormen voor aanvullende domeinen en aan beide aangrenzende double helices van de buis eenmaal per eenheid lengte element zijn gekoppeld. Een U2 strand dikker wordt getekend voor de duidelijkheid. (C) voorbeelden van zeven verschillende buis platforms worden gegeven, met onderdeel nummers variërend van 4 tot 14 HT en lp variërend van 1.2 tot 26 µm. HT (D en E) Epi-belichting fluorescerende beelden van Cy3-label, geadsorbeerde 5 HT en 10 HT illustreren de verschillende stiffnesses via anders gebogen contouren. De rode overlay is de contour van de gloeidraad gevonden via beeldanalyse, met end-to-end afstand R en contour lengte lC. Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: temperatuur oprit en bijbehorende vergadering van DNA nanotubes. (A) DNA nanotubes worden geassembleerd in een thermocycler via een protocol met die meerdere verschillende temperatuur over ongeveer 11 h. (B) In een real-time kwantitatieve PCR-systeem, de relatieve verandering van het fluorescerende signaal van gekleurde onderdelen stappen is een maat voor de nieuw gevormde double-stranded DNA terwijl er via de oprit van de temperatuur. Afhankelijk van het soort DNA nanobuisjes, kan het tarief van de vergadering verschillen. De meer complexe de vorming van structuur, hoe breder de vergadering, vermoedelijk sinds meer strengen (en dus meer segmenten met verschillende reeksen en lokale onthardende temperaturen) moet kruisen op de juiste posities, een proces dat wordt gedreven door stochastische thermische schommelingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger AFM afbeelding van een verwarde netwerk van 8HTs bij 4 µM. Het hoogte profiel van een voorgevormde netwerk van 8HTs geabsorbeerd op een oppervlak van mica werd opgenomen met behulp van te tikken modus in lucht. AFM beelden visualiseren van een 2D-projectie van het netwerk maar niet toestaan voor de betrouwbare extractie van gegevens (bijv . maaswijdte) voor het 3D geval omdat de buizen, alsmede de netwerken worden gecomprimeerd in een 2D-configuratie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: lineaire bereik. Metingen van de stam (G' = 1 Hz) onthullen een brede lineair elastische plateau, zonder tekenen van crosslinking effecten zoals de niet-lineaire gedrag manifesteren als verharding van de stam. Boven een karakteristieke stam (verschillend voor elke nHT) breekt de elastische plateau modulus onherroepelijk af. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de gemiddelde waarde van alle uitgevoerde metingen. Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: typische frequentie afhankelijkheid van een netwerk van verstrikt 6HT. Netwerken van DNA buizen Toon een brede elasticiteit plateau over vier ordes van grootte, afhankelijk van de toegepaste frequentie. Zoals verwacht voor een polymeer-netwerk, het elastische gedeelte (G') van de complexe schuintrekken modulus is beduidend hoger dan de viskeuze deel (G''). Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Geen lucht-liquid interface effecten. Frequentie veegt (f-veegt; γ = 5%) van de 8HT monsters op 8 µM openbaarde dat de invloed van verdamping en gelering effecten op de lucht-water-interface te verwaarlozen. Verschillende evenwichtsinstelling tijden, evenals twee methoden bekend te drastisch verminderen eiwit clustering op het raakvlak (oppervlakteactieve stoffen en lipiden), werden gebruikt. Onafhankelijk van de methode, geen indicatie van drastische invloeden door verdamping of oppervlakte elasticiteit werden geregistreerd. Hier, G' vertegenwoordigt de elasticiteitsmodulus en G'' vertegenwoordigt de viskeuze modulus (onderbroken lijnen). Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: geen invloed van einde wijziging. De elastische plateau modulus blijft constant wanneer plafonnering van de kleverige vrije uiteinden van de 8HTs met hun respectieve complementaire sequenties. Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: invloed van de omgang van de voorgevormde DNA netwerken op de meting. Afhankelijk van hoe de voorgevormde netwerken worden behandeld na kruising, zijn de metingen van afwijken. In dit voorbeeld heeft de shear stroom tijdens pipetteren van de DNA-nanobuisjes drastisch is gevarieerd en buizen brak als ook ongeveer behandeld. Breuk leidt tot ongewenste interacties tussen blootgesteld, complementaire single-strengen correleren aan gebroken of gescheurde segmenten, die leidt tot een toename in de elasticiteit en niet-lineaire effecten induceert, sUCH zoals stam verharding (toename van elasticiteit voor grote stammen, groene curve). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: DNA nanotubes inschakelen de studie van lp afhankelijkheden. (A) bestuderen van netwerken van semiflexible polymeren met nHTs in staat stelt het onderzoek van de mechanische respons van het systeem met toenemende concentratie (concentratie sweep), analoog aan studies op basis van biopolymeren zoals actine. (B) bovendien, de verschillende architecturen van de buizen vergemakkelijken de bepaling van de mechanische reactie met betrekking tot de verschillende lp van de onderliggende gloeidraden, die is onhaalbaar met natuurlijk voorkomende semiflexible polymeren. Voor dit doel, is de gegevens van A replotted inspelen op de schaal van de elastische plateau modulus met betrekking tot lp. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de gemiddelde waarde van alle uitgevoerde metingen. Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10: Reptation en mesh grootte. Opname fluorescentie beelden van reptating door samensmelting van filamenten (single-geëtiketteerden DNA 8HT ingebed in een labelloze netwerk; c = 14 µM) kan worden gebruikt om te controleren of de verstrikt aard van de draden in het netwerk. Eventuele crosslinking effecten zouden deze eendimensionale diffusie hinderen. Inzet: Reptation analyse kan worden gebruikt om te bepalen van de maaswijdte schalen met concentraties, die zich verhoudt tot actine metingen goed en is het eens met theoretische voorspellingen30. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de gemiddelde waarde van alle uitgevoerde metingen. Figuur aangepast van Schuldt et al.9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met het oog op een goed gevormde netwerken, is monteren van de DNA-nanobuisjes een cruciale stap. Fouten tijdens het proces van synthese negatief effect hebben op de kwaliteit van de buis; Daarom is het aanbevolen dat HPLC of een strengere proces worden gebruikt voor het zuiveren van de oligonucleotides. Aangezien de vorming van discrete in plaats van geaggregeerde DNA nanobuisjes, evenals hun lengte distributie, hangt af van het mengsel stoichiometrie van de samenstellende oligonucleotides van n binnen de set, is het noodzakelijk om het remeasure van de concentraties van gekochte onderdelen, sinds gegeven waarden kan variëren aanzienlijk van de werkelijke concentratie. Dit kan worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door UV-Vis-spectroscopie bij een golflengte van de extinctie van 260 nm. We willen graag dat molecuulgewicht en uitsterven coëfficiënten variëren tussen de verschillende sequenties; dus moeten de waarden te vertalen van de extinctie in concentratie worden bepaald voor elke oligonucleotide DNA. Bij het gebruik van apparatuur die zijn geoptimaliseerd voor kleine steekproef volumen, zoals een NanoDrop, moet elk meetpunt worden genomen van meerdere malen en gemiddeld. Overeenstemming zijn met het lineaire bereik van detectie van de spectrometer. Verdun de breuk gebruikt voor bepaling van de concentratie, indien nodig. Lichte onjuistheden kunnen een grote invloed hebben op de juiste Stoichiometrie en de kwaliteit van de vorming van de buis; Daarom moet de pipetteren van de enkele strengen zo nauwkeurig mogelijk. Vervolgens moet de laatste monsteroplossing grondig worden gemixt door langzaam pipetteren het monster op en neer alvorens het in de thermocycler. Als onderdelen zijn gewijzigd met fluorescente kleurstoffen voor visualisatie, moeten alle stappen worden uitgevoerd in een omgeving die afgeschermd van direct licht, en de latere toevoeging van gevestigde anti-bleken agenten (dat wil zeggen, zuurstof systemen, zoals opruiming glucose-oxidase/katalase) wordt aanbevolen. Nadat de enkele strengen zijn gemengd in de buffer van de juiste voorwaarden, wordt een temperatuur helling toegepast om te kruisen de structuren (figuur 2A). Deze temperatuur patroon volgt de vooraf bepaalde kritieke kruising temperatuur, waar dubbele DNA helices vorm. Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te analyseren DNA hybridisatie kinetiek (dat wil zeggen, inheemse DNA UV-absorptie31, calorimetrie32of fluorescente kleurstoffen33). In deze laatste methode afwisseling kleurstoffen in DNA dubbele helices, vorming van sterk fluorescerende complexen helderder dan de niet-afhankelijke kleurstoffen. Ze binden gedeeltelijk naar double-stranded maar niet naar single-stranded DNA34. Daarom deze kleurstoffen zijn toegepast om te controleren van DNA nanostructuur zelf-assemblage in de systeem-35 en kunnen worden gebruikt voor het identificeren van de vergadering van de ideale omstandigheden.
In eerste instantie een double-stranded DNA in het monster, zoals vooraf gedefinieerde en onvoorspelbare duplexen, zijn gedenatureerd bij een hoge temperatuur (90 ° C) om te voorkomen dat onbedoelde base paren. Een verdere geleidelijke afname van de temperatuur (vergelijkbaar met figuur 2A) reduceert de thermische beweging van de DNA-strengen, base-paring gebeurtenissen inschakelen. Als gevolg van de minimalisering van de vrije energie kruisen DNA-strengen netcongestieproblemen op hun aanvullende reeksen. Wanneer een dsDNA-specifieke intercalating kleurstof wordt toegepast, wordt de helderheid verhoogd met de vorming van sterk fluorescerende complexen, die is op zijn beurt een kwantitatieve maat voor nieuw gevormde double-stranded DNA34. De relatieve verandering van de fluorescentie-signaal voor de vorming van 4HTs en 8HTs wordt getekend in figuur 2B. Deze relatieve verandering wordt berekend door de intensiteit van de fluorescentie voor elke temperatuur gemiddeld en vervolgens af te trekken van de gemiddelde waarde van de vorige temperatuur. Met afnemende temperatuur, een verhoogde fluorescentie kan worden gedetecteerd (figuur 2B), en het hoogtepunt van deze curve markeert de temperatuur waar enorme hybridisatie gebeurtenissen plaatsvinden. De daling van de curven verwijst naar intensiteitswaarden een plateau te bereiken. Afhankelijk van de constructie van DNA en de complexiteit ervan (bijvoorbeeld, een kleine of grote set van DNA strengen), kunnen de piek sharp (figuur 2B, blauwe kromme) of breed (figuur 2B, groene curve). Indien mogelijk, moet dit worden getest voor elke nieuw ontworpen structuur om ervoor te zorgen dat het geleidelijk afnemende gedeelte van de helling van de temperatuur bevat het bereik waar de vorming van buizen via de vorming van gehybridiseerde dsDNA segmenten optreedt. Na de juiste temperatuur regeling bepaald, nanostructuren met succes kunnen worden gemonteerd in zeer smalle temperatuurbereiken (figuur 2B, blauwe curve), of zelfs isothermally35. Merk op dat de kruising van meerdere DNA in periodieke roosters strengen induceert coöperatieve onthardende effecten35,36, ter ondersteuning van verdere DNA gloeien. Dit moet worden beschouwd dat intercalating kleurstoffen DNA helices buiten hun standaard 10.5 basenparen per spiraalvormige draai configuratie strekken, de algehele geometrie van de buizen daardoor wordt verstoord. Het is daarom niet raadzaam om te heffen van de kleurstof concentratie over één molecuul per 900 DNA-basenparen35. De temperatuur van de vergadering piek kan verder afwijken van de werkelijke optimale onthardende temperatuur. Te bereiken van hoge precisie en om te bepalen van de beste voorwaarde voor buis vorming, moet DNA hybridisatie worden onderzocht tijdens vele langzaam veranderende temperatuur stappen, die gecontroleerd met agarose gelelektroforese worden moeten. Voor het geval van de DNA-nanobuisjes vastgesteld we een drie-stappen-protocol. Ten eerste, het monster wordt verwarmd tot 90 ° C te denatureren van het DNA in enkele strengen. Vervolgens, een breed temperatuurbereik (rond de vergadering piek van het signaal van de fluorescentie) valt. In ons geval, is een bereik van 10 ° C bedekt, variërend van 65 ° C tot 55 ° C, met een stap van -0,5 ° C om 30 min. In de laatste stap, de temperatuur moet snel dalen tot kamertemperatuur - of, zoals in ons geval, 20 ° C - om te voorkomen dat een ongunstige interacties bij tussenliggende temperaturen (figuur 2A). Meestal Verwarm thermocyclers de monsters uit de koudere temperaturen. Daarom is het belangrijk om de temperatuur van het deksel dienovereenkomstig aanpassen als u wilt beperken de verdamping van vloeistof in de steekproef tijdens de vergadering, die de concentratie van het eindmonster verhoogt.
Als de nHTs op passende wijze worden gevormd, schik ze in zuiver verstrikt netwerken (Figuur 3), zonder interacties veroorzaakt crosslinking effecten tussen verschillende buizen. Crosslinks zou vermoedelijk het gevolg van de ongepaarde DNA-segmenten, zich uitstrekt van gebreken langs een buis of aan kleverige uiteinden, die vrij te koppelen met complementaire single-stranded segmenten op naburige buizen zou zijn. Deze effecten zouden niet-lineaire eigenschappen, zoals stam verharding induceren (toenemende G' voor grotere stammen), maar zij afwezig zijn verstrikt in netwerken (Figuur 4). De weergegeven γ-sweeps onthullen ook de passende lineaire stam regimes voor Rheologische metingen in het algemeen. Boven een bepaalde drempel, het netwerk breuken of verliest contact met de platen van de rheometer, die onherroepelijk schade van het systeem. Daarom moet de toegepaste stammen in het lineaire stelsel om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Meestal volstaat een stam van 5% opbrengst gegevens ruim boven het lawaai-regime. Hogere spanningen kunnen worden toegepast; echter ze gemakkelijk benaderen de drempel van de breuk en resultaten kunnen nepberichtenEd te wijten aan het meten van het niet-lineaire regime.
Rheologische metingen vereisen een zorgvuldige, consistente voorbereiding van het monster en zorgvuldig overwogen meting protocollen om reproduceerbare en interpreteerbaar resultaten te verkrijgen. Het centrale punt is een volledig willekeurig, isotrope netwerk tussen de platen van de rheometer aangezien deze netwerken meestal de alleen reproduceerbaar structuur zijn op te zetten. Dus, vrij lange evenwichtsinstelling keer (meestal ongeveer 2 h, soms zelfs meer) nodig zijn om te dispergeren eventuele bestellen effecten die als gevolg van afschuiving-geïnduceerde uitlijning optreden tijdens de pipetteren van het monster. Pre-test experimenten worden aanbevolen voor het opnemen van de tijdsevolutie (tijd sweep) van het systeem tijdens de evenwichtsinstelling om na te gaan van de nodige tijd frame. Zodra de signalen plateaus zonder verdere wijzigingen bereiken, is het systeem geëquilibreerd. Eenmaal evenwichtsinstelling voorwaarden zijn vastgesteld, de gewenste tests, zoals een spanning helling of f - of γ-veegt, kunnen worden uitgevoerd. Testen van een breed spectrum van spanningen kan uiteindelijk vernietigen het netwerk of de verbinding met de platen. Echter als tests beperkt tot stammen onder de drempel van de breuk zijn, kan stam hellingbanen en schoonmaakacties iteratief herhaald worden om te onderzoeken van de potentiële effecten van veroudering of hysteresis. In het geval van f-veegt, de tijden van de meting kunnen aanzienlijk variëren. Testen van lage frequenties dramatisch verlengt de experimenten, aangezien één trilling kan enkele minuten duren. Merk op dat, in het geval van nHTs, f-veegt blijkt dat de elasticiteitsmodulus G' overschrijdt de viskeuze modulus G'' door ongeveer één orde van grootte, illustreert dat de overheersende elastische reactie van deze systemen ( Figuur 5). In het algemeen, de verschillende soorten experimenten kunnen vergezeld gaan van korte f-veegt vóór en na de belangrijkste experiment om te controleren dat het systeem bleef ongestoord door de meting zelf. Sommige machines hebben echter de onderliggende motor modus voor de verschillende soorten metingen, vooral bij het wisselen van dynamische experimenten wijzigen (bijvoorbeeld oscillaties voor f-veegt) om een statische spanning helling. Deze wijziging gaat vaak gepaard met spontane grote stammen vernietiging van het netwerk en ontlaten van latere metingen. Dus is het aangeraden om te controleren de specificaties van de rheometer gebruikt.
Reologie experimenten op actine gebaseerde systemen onthullen een dramatisch effect van eiwit denaturatie optreedt op de lucht-water-interface van het systeem. Gedenatureerde eiwitten houden unspecifically aan elkaar, waardoor de vorming van een dichte gel die zeer de mechanische eigenschappen van het gehele systeem domineren kan. Om te voorkomen dat het directe contact van het monster met de omringende lucht, kunnen passivering technieken die ook de verdamping van het watergehalte van het monster onderdrukken worden gebruikt. Drie potentiële methoden zijn: (i) rondom de monsterkamer met de dezelfde buffer als in het monster; (ii) het gebruikmaken van oppervlakteactieve stoffen ter dekking van de interface toe te schrijven aan hun hydrofobe en hydrofiele domeinen (zorg moet worden genomen, aangezien sommige oppervlakteactieve stoffen met polymeer conformaties interfereren); of (iii) dienst meer biologisch compatibel lipiden, met soortgelijke effecten als oppervlakteactieve stoffen. Opgemerkt moet worden dat nHTs niet bleken onderworpen aan denaturatie effecten op de interface, en resultaten zijn onafhankelijk van de passivering methode (Figuur 6), die een belangrijke potentiële bron van fout elimineert. In het algemeen moet de monsterkamer altijd worden verzegeld met een pet, die kan worden uitgerust met vochtige sponzen te verhogen van de luchtvochtigheid in de zaal, het onderdrukken van verdamping.
Als kort beschreven eerder, een potentiële bron van de fout in DNA-gebaseerde systemen is unhybridized DNA, zoals ongepaarde single-stranded DNA overhangt op defecten of aan de uiteinden van de nanobuisjes, die extra crosslinking effecten zou kunnen veroorzaken. Om te onderzoeken en/of deze mogelijkheid te elimineren, kunnen aanvullende korte strengen Cap deze sticky ends worden gebruikt. Echter is ons eigen onderzoek gebleken dat de toevoeging van de aftopping van de strengen had geen effect op de geïntroduceerde nHTs en het gedrag van de verstrikt netwerken bleef onveranderd (Figuur 7). Aftopping kleverige eindigt met complementaire sequenties kan echter nuttig zijn voor andere DNA-gebaseerd (en meer complexe) systemen aan het onderdrukken van ongewenste interacties. Daarnaast moeten monsters van nHTs zorgvuldig worden pipetted (bijvoorbeeld voor verdunning stappen en bereiding van de monsters) om te voorkomen dat breaking of andere schade aan de buizen. Als de oplossing is afgepipetteerde ook ongeveer, de buizen breken ongecontroleerd, bloot grote aantallen kleverige eindigt bij defect punten, wat leidt tot ongewenste interacties tussen de buizen en potentiële crosslinking in het systeem. Dit verstoort het signaal en leidt aan verstijving van effecten, alsmede aan het niet-lineaire effecten zoals stam harden, die zichtbaar in γ-veegt (Figuur 8 wordt). Dus, pipetting de verstrikt oplossing slechts langzaam zou moeten worden gedaan en met behulp van tips van de pipet met een vrij grote diameter (snijden het einde van een pipet tip is aan te raden) om het schuintrekken krachten op de buizen.
Kortom, vormen DNA nHTs een geschikt en zeer flexibel modelsysteem te bestuderen van de semiflexible polymeren en bulk netwerken gevormd uit deze gloeidraden, die een nieuwe klasse van mechanisch afstembare hydrogels vertegenwoordigt. Als de buizen zijn zorgvuldig voorbereid, kunnen ze worden gebruikt voor het testen van het effect van de lp van de gloeidraden in verschillende gevallen. De bulk Rheologische meting van netwerken, bijvoorbeeld verstrikt, blijkt dat de theoretisch voorspelde afhankelijkheden van de elasticiteitsmodulus met concentratie en lp in strijd zijn met de experimenteel afgeleide schaal wetten (Figuur 9)9. Deze studie onderstreept dat de elasticiteit van een netwerk kan worden verhoogd door het verhogen van de stijfheid van de onderliggende polymeren. Traditioneel, werd verhogen van de stijfheid van een hydrogel bereikt door het toevoegen van meer polymeren aan de oplossing of door inducerende crosslinks (fysisch of chemisch) tussen naburige polymeren37,38. Echter wordt een hoger gehalte aan moleculaire ook geassocieerd met een verminderde maaswijdte, die toepassingen zoals 3D-celkweek kunt beperken. Crosslinks, aan de andere kant, kan leiden tot complexe morfologische veranderingen binnen de onderliggende netwerkarchitectuur, die verder compliceert de precieze afstemming van mechanische eigenschappen39. Gebruik te maken van netwerken van nHTs, staat echter voor een volledige ontkoppeling van deze parameters, waarbij de verstijving effecten kunnen worden opgewekt door de stijfheid van de onderliggende filamenten uitsluitend wijzigen terwijl de maaswijdte ongewijzigd. Bovendien, de buis architecturen specifiek kunnen worden gewijzigd om extra effecten zoals crosslinking, waardoor, zo ook in verstrikt netwerken, verdere mogelijkheden om te experimenteel testen theoretische voorspellingen voor selectief te integreren parameters zoalsl p of dwarslijn grootte en sterkte voor netwerken. In het algemeen, de programmeerbare architectuur verbreedt het toepassingsgebied van toepassingen, zodat voor de studie van lp-afhankelijke effecten niet alleen in bulk, maar ook op het niveau van de single-molecuul. Gelabelde buizen kunnen worden ingebed in het netwerk om te studeren, bijvoorbeeld, de afhankelijkheid van lp over de eendimensionale motie van een gloeidraad in buis-achtige opsluiting, gewoonlijk aangeduid reptation (Figuur 10)9. Als deze diffusive beweging zichtbaar is, het wordt ook gecontroleerd of de verstrikt karakter van het netwerk, omdat het zou worden onderdrukt door crosslinking effecten. Analyseren van de onderliggende dynamiek blijkt ook de maaswijdte van het netwerk. Bovendien, deze buizen kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de afhankelijkheid van de stijfheid en chiraliteit van de onderliggende buizen op de vorming van bundels40,41,42,43, 44 , 45 of hogere-orde structuren, zoals de ster-achtige asters46,47,48,49,50, die kan worden opgewekt door crosslinking effecten of via moleculair drukke omgevingen27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen dat financiering door DFG (1116/17-1) en de Leipzig School of Natural Sciences "BuildMoNa" (SGR 185). Dit werk is ondersteund door het Fraunhofer aantrekken project 601 683. T. H. erkent financiering uit het Europees Sociaal Fonds (ESF-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
References
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
- Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
- Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
- MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A.
- Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
- Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
- Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
- Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
- Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
- Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
- Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
- Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A.
- Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
- Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J.
- Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
- Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
- Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
- Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
- Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
- Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
- Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
- Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
- Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
- Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
- Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
- de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
- Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
- Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
- You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
- Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
- Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
- Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
- Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
- Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
- Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
- Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
- Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
- Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
- Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
- Strehle, D., et al.
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
- Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
- Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).
