Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

سيميفليكسيبلي البوليمرات عرض الخصائص الميكانيكية الفريدة التي يتم تطبيقها على نطاق واسع بنظم المعيشة. ومع ذلك، تقتصر دراسات منهجية في البوليمرات البيولوجية نظراً لخصائص مثل صلابة البوليمر غير قابل للوصول. هذه المخطوطة يصف كيف يتم التحايل على هذا القيد بالأنابيب النانوية الحمض النووي للبرمجة، تمكين دراسات تجريبية عن أثر صلابة خيوط.

Abstract

ويمكن فهم الخواص الميكانيكية لهذه المسألة لينة معقدة، والمستندة إلى البوليمر، مثل الخلايا أو الشبكات بيوبوليمير، لا الإطار الكلاسيكي للبوليمرات المرنة ولا قضبان جامدة. خيوط الأساسية تظل ممدودة بسبب ما تيبس العمود الفقري غير التلاشي، الذي هو كمياً عن طريق طول استمرار (lp) وإنما أيضا عرضه للتقلبات الحرارية القوية. صلابة الانحناء محدود يؤدي إلى ميكانيكا الجماعية فريدة وغير عادية للشبكات الأكبر، مما يتيح تشكيل السقالات مستقرة في انخفاض حجم الكسور مع توفير أحجام كبيرة مش. هذا المبدأ الأساسي السائد في الطبيعة (مثلاً في الخلايا أو الأنسجة)، تقليل محتوى الجزيئي عالية ومما ييسر انتشارية أو النقل النشط. نظراً للآثار البيولوجية والتطبيقات التكنولوجية المحتملة في الهلاميات المائية متوافق حيويا، خضعت البوليمرات سيميفليكسيبلي دراسة كبيرة. بيد أن التحقيقات مفهومة ظلت صعبة نظراً لأنها تعتمد على البوليمرات الطبيعية، مثل خيوط الأكتين، التي غير الانضباطي بحرية. وعلى الرغم من هذه القيود، ونظرا لعدم وجود البوليمرات الاصطناعية وميكانيكيا الانضباطي، وسيميفليكسيبلي، وخيوط أكتين أنشئت كالنظام النموذجي الموحد. حد رئيسية أن الكمية الوسطى لف لا يمكن ضبطها بحرية لدراسة تأثيرها على هياكل السائبة العيانية. وتم حل هذا القيد باستخدام الأنابيب النانوية هيكلياً للبرمجة في الحمض النووي، تمكين التحكم تغيير صلابة خيوط. أنها تتشكل من خلال النماذج المستندة إلى البلاط، حيث هجن مجموعة منفصلة من خيوط مكملة جزئيا في بنية حلقة مع محيط منفصلة. نهايات لزجة، تمكين البلمرة فعالة إلى خيوط عدة ميكرون في الطول، وتتميز هذه الحلقات وعرض مماثل البلمرة حركية البوليمرات البيولوجية الطبيعية. سبب الميكانيكا القابلة للبرمجة، وهذه الأنابيب أدوات تنوعاً، رواية دراسة أثر لف في جزيء الواحد فضلا عن حجم الجزء الأكبر. وعلى النقيض من خيوط الأكتين، تظل مستقرة على مدى أسابيع، دون انحطاط ملحوظ، وتعاملها مع بسيط نسبيا.

Introduction

بسبب السلوكيات المعقدة خصائصها الميكانيكية الفريدة التي يوفرها، البوليمرات سيميفليكسيبلي هي اللبنات الأساسية لمعيشة هذه المسألة. خلافا للبوليمرات المرنة، البوليمرات سيميفليكسيبلي تعتمد على تكوين ممدودة بسبب تصلب العمود الفقري غير التلاشي على حين لا تزال تبقى خاضعة للتقلبات الحرارية قوية1. وهكذا، لا يمكن تطبيق النماذج العشوائية البحتة على سلوكهم، كما هو الحال مع النقيض إلى النقيض تماما مرنة أو جامدة البوليمرات. ووضعت ما يسمى دودة مثل سلسلة طراز2،3،4 لقياس صلابة هذا عن طريق لف، الذي هو ثابت الانحلال في العلاقة الظل الظل على طول الشعيرة4. في حالة مماثلة لطول كفاف (lc) خيوط لف ، يعتبر البوليمر سيميفليكسيبلي1. مماثلة لأقطاب خيمة، تستقر ترتيباتها في الشبكات أو حزم النظام الجماعي بأكمله في انخفاض حجم الكسور، مما يؤدي إلى لزج مطاطي غير عادية خصائص5،،من67، 8،9. وهذه الهياكل توفير مرونة عالية بوجه عام مش أحجام10، الحفاظ على سلامة الميكانيكية بينما لا يزال تيسير انتشارية وعمليات النقل النشط. هذه الخاصية مناسبة خاصة للنظم البيولوجية مثل سيتوسكيليتون أو المصفوفة خارج الخلية، ولكن يتم استخدامه على نطاق واسع في الغذاء الهندسة1،،من1112.

تتجاوز أهميتها للمسألة المعيشية، من الأهمية بمكان دراسة شاملة الخصائص الفيزيائية لهذه الهياكل من أجل لديك الأدوات اللازمة لوضع مواد المحاكاة البيولوجية أو رواية الهلاميات المائية. وهذا يعني من حيث سيميفليكسيبلي البوليمرات، منهجية تحديد الخصائص الجماعية للشبكات الناتجة عن خصائص خيط واحد مثل لف ووضع الإطار النظري الوصفي. في دراسات رائدة، تأسست كنظام نموذجي للبوليمرات سيميفليكسيبلي أكتين بيوبوليمير الخلوية ويعتبر على نطاق واسع لا تزال المعيار الذهبي5،13،،من1415 , 16 , 17-دراسات شاملة غير محدودة مع هذا النظام نظراً لأنها ترتبط بالخصائص الملازمة لهذا البروتين. مختلف النهج النظري قد تهدف إلى بناء وصفاً للسلوكيات الميكانيكية غير عادية على مستوى واحد-خيوط وأدت إلى خاصة مختلفة توقعات التحجيم للاعتماد على معامل القص الهضبة مطاطا الخطي، ز 0 (أي "مرونة" من الشبكة)، وفيما يتعلق بتركيز (ج) و لف6،7،،من1314، 15،،من1819،20،21،،من2223. بينما زيادة تركيز متاحة في تجارب مع القائم على الأكتين أو غيرها من النظم النموذجية وفي حين كانت التنبؤات النظرية دقة التحقق من، 13،،من1624 القياس بالنسبة لف ظل 25، تجريبيا غير قابل للوصول. هذا، ومع ذلك، يشكل قيداً رئيسيا نظراً لف هو أيضا متغير مستقل هو تحديد كمية بوليمرات سيميفليكسيبلي.

مؤخرا تم حل هذا القيد المركزي، والطبيعية التي تفرضها ثابت lp من أكتين أو البوليمرات الأخرى المستمدة من بيولوجيا مثل الكولاجين عن طريق استخدام أنابيب الحمض النووي القائم على بلاط، التي الانضباطي في خواصها الميكانيكية 9 , 26 , 27 , 28-اختلافات طفيفة في أبنية الأنابيب (مثلاً، إعداد مختلفة من الحمض النووي المكونة لها فروع داخل الحلبة وحدة) تعطي قيم مميزة لامف، التي يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الأسفار، تحليل أنبوب تقلب واحد أو بتقييم التكوينات المنحنية من عدة أنابيب التقيد بها، كما وصف سابقا9،28. وكشفت هذه التحاليل أن تختلف قيمp lالسكان أنبوب مختلفة على أمر واحد أو أكثر من حجم، وأن أساليب التقييم المختلفة تسفر عن نتائج متسقة9،28.

المثير للدهشة، سجلت الشاملة مقياس خطي الهضبة مطاطا القص معامل ز0 فيما يتعلق بتركيز و لف لا يتمشى مع جميع المناهج النظرية السابقة 9، مما يدل على وجه الخصوص كثير أقوى من المتوقع الاعتماد لف. هذه النتائج تؤكد قيمة نظام نموذج جديد لدراسة خصائص البوليمرات سيميفليكسيبلي الوسطى. توظيف n-الحلزون الدنا أنابيب كبيرة ويوسع نطاق هذه التحقيقات. لا يمكن أن تختلف لف بحرية دون تغيير المواد الأساسية فحسب، بل الطبيعة القابلة للبرمجة للحمض النووي يمكن تمكين الفحص المنهجي لعناصر إضافية، مثل كروسلينكس أو عمليات التحويل الحركية. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأنابيب القابلة للذوبان في الماء، وعلى عكس معظم البروتينات، مستقرة في درجة الحموضة كافية وظروف الأيونية لعدة أسابيع، دون تدهور يمكن كشفها9.

لتجميع هذه الأنابيب، يتم استخدام مجموعة منفصلة من النوكليوتيد الحمض النووي، كل منها يحتوي على هذين المجالين تتشارك تسلسلات قاعدة مكملة إلى شقين المجاورة (نظراً لتسلسل معين، لا يمكن أن تشكل حبلا واحد هياكل مثل دبابيس الشعر). تسلسلات مكملة هجن على نحو دوري، تشكيل الحلقات المغلقة، وتداخل نصف شرائح مزدوجة حلزونية ن مترابطة (الشكل 1A و ب). هذه شكل حلقات في قطر منفصلة (الشكل 1)، وعلى تكوين تداخل نصف يكشف نهايات لزجة المحوري مكملة لنهايات لزجة خاتم آخر. هذا بالإضافة إلى انتقائية لمطابقة النوكليوتيد المشغلات التراص الخواتم، مما يؤدي إلى البلمرة فعالة من أنابيب الحلزون الدنا الخيطية من حجم n (nHT). قياس أطوال كفاف بهم عادة عدة ميكرون في الطول، وتوزيعها على طول يماثل أكتين خيوط9،26،،من2728. ولقد ثبت للأنابيب النانوية الحمض النووي مماثلة أنهم في الواقع يحمل حركية البلمرة شبيهة بخيوط أكتين وميكروتوبوليسالفئة p = "xref" > 29. يمكن أن تختلف تبعاً لعدد n من خيوط الحمض النووي الفردية التي تشكل هيكل الحلقة الأساسية، كنترولبلي العمارة نHT، فضلا عن محيط به والقطر،. استخدام المزيد من خيوط الحمض النووي يزيد من محيط الخواتم/الأنابيب، وتحولات التغيير المعماري المقابلة الخواص الميكانيكية لأعلى قيمp l(الشكل 1)، تقابل صلابة أعلى. بمقياس mesoscopic، تترجم هذه القيمp lأكبر والتشكلات بنت أقل بسبب تصلب أعلى (الشكل 1 وه).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد n HTs

ملاحظة: هنا، تشير n إلى عدد مختلف خيوط الحمض النووي واحد يشارك في تشكيل أنابيب الحلزون من حجم معين. قيم n = 8، ثمانية مختلف خيوط الحمض النووي واحد يشكلون عصابة وحدة.

  1. تسلسل "الحمض النووي الشراء" (درجة نقاء [هبلك] أو أعلى) من توليف الحمض النووي مناسبة الخدمة أو إجراء توليف عالية الجودة وتنقية (تسلسل نموذجية في الجدول 1).
    2. الخطوات
  2. النوكليوتيد ريسوسبيند المجففة بالتبريد في تنقية المياه ومتابعة استثارة مزيد النظر في دليل المقابلة من الشركة. ضبط الكمية المياه للحصول على تركيز نهائي من 200 مليميكرون.
  3. تحديد تركيزات الحمض النووي واحد فروع للتحقق من القيم التي يقدمها الموزع (مثلاً، عن طريق التحليل الطيفي تجاه الأشعة فوق البنفسجية في 260 nm) منذ stoichiometry الدقيق حاسم بالنسبة لعملية التجميع. حساب تركيز النوكليوتيد، آخذا في الاعتبار الوزن المولى محددة ومعامل الانقراض لكل واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي اليغنوكليوتيد.
    ملاحظة: قيم معامل الانقراض طبيعتها تختلف عن تسلسلات مختلفة وهي ذكرت في الوثائق المتعلقة بالحمض النووي التي تم شراؤها تجارياً. يمكن أيضا حساب وفقا لنموذج أقرب جاره باستخدام عدد من أدوات متاحة مجاناً على الإنترنت. الامتثال لنطاق والمطياف الخطي، النظر في إضعاف العينة المستخدمة لتحديد التركيز.
  4. ميكروبيبيتي، باستخدام مزيج الحمض النووي كل خيوط في الوقت نفسه تركيز في حاوية مناسبة ثيرموسيكلير (مثل أنبوب بكر 200 ميليلتر) النموذج المطلوب ن HTs (شروط المخزن المؤقت النهائي: 1xTE (10 مم يدتا تريس و 1 مم، درجة الحموضة 8) و 12.5 مم مجكل 2)-
    ملاحظة: عينات الحمض النووي النهائي ن HT تتكون من n-1 فروع، يو 1 − ش ن − 1، وواحدة تي ن طاق. يمكن أن تختلف التركيز كل حبلا من ميكرومولار في لأكثر من 10 ميكرومتر، تبعاً لاحتياجات المستخدم (مثلاً، < 1 ميكرومتر كل حبلا لتمييع اللاحقة لمراقبة خيوط مفردة أو تركيزات أعلى للنظر في ميكانيكا شبكة كثيفة).
  5. هجن ن HTs في ثيرموسيكلير (تمسخ لمدة 10 دقائق عند 90 درجة مئوية، مع انخفاض سريع لاحقة إلى 65 درجة مئوية؛ درجة الحرارة بطيئة الانخفاض من 65 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية، مع إقران قاعدة مكملة في خطوات درجة الحرارة 20 ك-0.50 لمدة 30 دقيقة كل منها؛ وهبوط سريع من 55 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية)؛ انظر الشكل 2 أ.
    ملاحظة: يمكن أن تطول الخطوات الانخفاض البطيء من 65 درجة مئوية لزيادة طول أنبوب متوسط؛ إلا أن الانخفاض السريع لاحقاً إلى 20 درجة مئوية أمر حاسم لتجنب تجميع أنابيب مبلمرة.
  6. تخزين المهجن ن HTs لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند 4 درجة مئوية دون تدهور لا يمكن اكتشافها.
    ملاحظة: للأسفار يتم تهجين مجهرية، المسمى HTs ن (جزئيا) محل U1 مع تعديل U1-Cy3 (الجدول 1). لوقت أطول للمراقبة، يستحسن إضافة وكلاء مكافحة التبييض المتبعة.
  7. بعناية تمييع عينة للتركيز النهائي المطلوب (مثلاً، 4 ميكرون للشبكات أو 20 نانومتر للملاحظات خيط واحد) باستخدام المخزن المؤقت الذي عينة، إذا لزم الأمر. للتقليل من مصادر الخطأ الممكنة، تجميع عينات في تركيز النهائية المرجوة.

2. القص ريولوجيا

  1. اختيار مناسب الهندسة (لوحة لوحة أو لوحة مخروط) رهيوميتير القص الديناميكي. لاستخدام كميات صغيرة (أي، أدناه 200 ميليلتر)، هندسة مخروط-لوحة-
  2. تحميل العينة في رهيوميتير القص الديناميكي.
  3. تخميل واجهة الهواء والماء من العينة والبيئة باستخدام الخطوات التالية لمنع الآثار التبخر.
    1. المحيطي العينة مع 2.5 مل حمام المخزن المؤقت عينة-
    2. إضافة السطح فقط دون تركيز مذيل.
    3. استخدام المحاقن هاملتون لتطويق العينة مع دهن تجنب الاتصال المباشر عينة مع الهواء-
  4. ختم الدائرة عينة مع قبعة مزودة بالاسفنج الرطب، وإذا كان ذلك ممكناً، مع حمام مياه إضافية (ليس على اتصال العينة) لمواصلة قمع التبخر.
  5. بدء القياس باستخدام البرمجيات الخاصة رهيوميتير في درجة حرارة الغرفة؛ وبدلاً من ذلك، إجراء قياس درجات حرارة مختلفة، مثل 37 درجة مئوية (إذا كانت هناك حاجة إلى الظروف الفسيولوجية).
    ملاحظة: تبريد العينة غالباً ما يرافق التكثيف لبخار الماء من الجو المحيط، بينما تدفئة ويؤدي إلى زيادة التبخر. كلا آثار حسيب تغيير تركيز العينة، حيث ينبغي أن تجري جميع القياسات في سلسلة في درجة حرارة ثابتة.
  6. السماح العينة حجته على ح 2 في درجة حرارة الغرفة. قد رصد تطور الزمن مع اكتساح وقت (بيانات واحدة نقطة في الدقيقة الواحدة؛ وسلالة γ = 5%؛ التردد f = 1 هرتز).
  7. قياس الخواص الميكانيكية مع بروتوكولات الاختبار المطلوب. تبدأ بسلسلة من عمليات التمشيط التردد (f-الاحتلالات) لأنها تترك العينة سليمة والسماح لمزيد من القياسات.
    ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، قصيرة وينبغي إجراء عمليات التمشيط بقبل وبعد قياسات أطول (مثل طويلة والاحتلالات مع بدقة أعلى من ذلك بكثير) للتحقق من أن العينة لم يتغير طوال البروتوكول القياس الكامل.
    1. إجراء قصيرة واكتساح (مثلاً، γ = 5%؛ f = 0.01 هرتز إلى 30 هرتز؛ بيانات 5 نقاط في العقد الواحد)-
      2. أداء
    2. طويلة واكتساح (مثلاً، γ = 5%؛ f = 0.001 هرتز إلى 30 هرتز؛ 21 نقاط البيانات في العقد الواحد)؛ نظام التردد المنخفض ويمكن إهماله إذا كان ليس من الضروري الحد من قياس الوقت-
    3. أداء قصيرة واكتساح.
    4. أداء γ-اكتساح (مثلاً، f = 1 هرتز؛ γ = 0.0125% إلى 100%؛ نقاط البيانات 20 في العقد الواحد)-
      ملاحظة: استخدم قصيرة واكتساح أولاً، كما أنها لا تتفق عادة مع السابقة والاحتلالات لأن الشبكات عادة تمزق أثناء الاجتياح γ أو فصل من اللوحات. بدلاً من ذلك، استخدام منحنى γ (مثلاً = 0.025 s -1, t = 60 s)؛ ومع ذلك، عادة ما تتطلب السلالم تغيير وضع السيارات، وحتى اللاحقة قصيرة وسوف تكون مزورة الاحتلالات.
  8. بن و/أو سلسة البيانات الخام مع نواة ضبابي.

3-ساعدت fluorescence "تحليل للحمض النووي الصلب"

  1. مختبرين 8 إعداد من 12 ميليلتر لكل عينة باستخدام 1-4 ميكرون الحمض النووي كل حبلا و 12.5 مم مجكل 2 في 1 × المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات و 1 س جل الحمض النووي وصمة عار من س 10,000 [دمس] الأسهم. جعل عنصر تحكم سلبية مع لا الحمض النووي، ولكنها تشمل وصمة عار جل الحمض النووي-
  2. نقل مختبرين لصفيحة PCR الوقت الحقيقي وختم مع الفيلم لاصقة (مثل، لوحة رد 96-جيدا)-
    ملاحظة: سوف تتبخر درجات الحرارة العالية المستخدمة في الحرارية الصلب البروتوكولات العينات. وبالتالي، تأكد من أن الآبار هي مختومة محكم مع الفيلم لاصقة للحيلولة دون زيادة التبخر وتركيز المياه، لا سيما خلال التجارب الطويلة الأجل-
  3. الطرد المركزي اللوحة في 100 غ س ل 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة فقاعات الغاز؛ وإذا كان توسيع فقاعات الغاز، لا يمكن تحليل الآبار.
  4. تحميل لوحة مختومة إلى نظام PCR كمي في الوقت الحقيقي-
  5. تشغيل برنامج انلينغ. تؤذي الحمض النووي عند 90 درجة مئوية للحد الأدنى 10 انخفاض درجة الحرارة بسرعة إلى 72 درجة مئوية. ثم تنخفض درجة الحرارة ببطء من 0.5 درجة مئوية كل 30 دقيقة. بعد الإشارة التهاوي، التعجيل بمنحنى درجة الحرارة-
    ملاحظة: بما فيه الكفاية 72 درجة مئوية أعلى درجة حرارة التهجين الحقيقية؛ وهكذا، يتم تسجيل الإشارات عبر نطاق واسع من درجات حرارة مناسبة لتحديد نطاق درجة الحرارة اللازمة.
  6. تأكد من أن غطاء cycler ارتفاع درجات الحرارة إلى مالا يقل عن 100 درجة مئوية لمنع التكثيف من تبخر العينة على الفيلم لاصقة.
  7. خلال الجمعية، تثير هذه العينات مع ليزر أيون أرجون في 488 نانومتر والكشف عن الأسفار في 550 نيوتن متر عند استخدام وصمة عار جل حمض النووي (أو طيفيا مماثلة). لسائر الأصباغ، اختر مجموعة إثارة/انبعاثات مناسبة. قياس الإشارات fluorescence قدر الإمكان لزيادة الإجمالي جودة الإشارة باستخدام الكاميرا المدمجة.
    ملاحظة: هنا، تم أخذ قياسات كل 9 س.
  8. إذا طبقت ذوبان مسبقاً والصلب البرامج، استخدام البرامج المتوفرة لتحليل البيانات. إذا لم يكن كذلك، طرح القيمة الوسطية السابقة من القيمة الوسطية لكل خطوة درجة الحرارة للحصول على التغير النسبي لإشارة الفلورسنت.

4. فؤاد التصوير

  1. تنشق ميكا (مثلاً، ميكا " V1 ") بإرفاق شريط لاصق المتاحة تجارياً وتمزيق ذلك؛ وينبغي إزالة الطبقة العلوية من ميكا.
  2. ميكروبيبيتي، باستخدام إيداع سابق التشكيل ن HT بملغ 2 + الذي يحتوي على المخزن المؤقت للطي على ميكا ملصوق طازجة والسماح لها بتسوية للحد الأدنى 10
  3. تدور العينات في فترات قصيرة 3-s في 2,000 س ز على طاولة صغيرة للطرد مركزي لإزالة السائل المتبقية. لا يزال ينبغي أن ترفق عدة ن HTs السطح ميكا.
  4. استخدام تلميح ناتئ مع صلابة عالية (مثلاً، 54 نانومتر -1)، وتحديد ما تردد صدى مع البرنامج فؤاد الداخلية-
  5. سجل التشكيل الجانبي الارتفاع مع فؤاد في الهواء في التنصت على وضع أسعار منخفضة المسح الضوئي (مثلاً، 1 خط/s) لتجنب إلحاق الضرر بها أو تشريد ن HTs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجمعية العامة للأنابيب النانوية الحمض النووي عن طريق منحدر درجة حرارة (الشكل 2) وسيلة موثوق بها للغاية لتشكيل هذه البوليمرات سيميفليكسيبلي الاصطناعية. هذه البوليمرات لها خصائص مماثلة لنظيراتها التي تحدث بشكل طبيعي، مثل خيوط الأكتين، ولكنها توفر إطارا تجريبية أوسع بكثير نظراً لخواصها الميكانيكية يمكن أن كنترولبلي غيرت9،27 . مثل البوليمرات البيولوجية، أنها يمكن ترتيبها في الشبكات (الشكل 3) وعلى وجه التحديد تسمح باختبار أثر صلابة خيوط في معظم الهياكل وخصائص. كما هو موضح في الشكل 4، عرض هذه الشبكات نظاما إجهاد خطي لسلالات تصل إلى 10%، التي تشبه خصائص شبكات خيوط الأكتين. داخل هذا النظام، ريولوجيا الإمالة الخطية يمكن سهولة تطبيقها، على سبيل المثال، تحديد استجابة مرنة ولزج من شبكات أنابيب نانوية الحمض النووي سبر في ترددات مختلفة9. هذه الاختبارات تكشف عن أن تلك الشبكات الغالب تتصرف الاستيكالي (الشكل 5). خلافا للقياسات مع البروتينات، هذه الأنابيب لا تؤذي في واجهة الهواء والماء من العينة ومتطورة ولذلك التخميل الاستراتيجيات المطلوبة (الشكل 6). ولذلك، مناولة العينات مباشرة بدلاً من ذلك وقد ثبت أن تكون قوية جداً، مما أسفر عن نتائج متسقة مع انخفاض عينة إلى عينة الاختلافات.

ومع ذلك، يمكن أن يستحث مسألة ما إذا كان "نهايات لزجة" خالية من مزاوج واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي في كل من طرفي كل أنبوبة التهجين العشوائية غير مرغوب فيها، وظلت الأحداث. لمعالجة هذا الشاغل، وتسلسل التكميلية "في نهاية عملية النداءات الموحدة" تغطي طرفي الأنبوبة أضيفت إلى العينة بعد اكتمال عملية التهجين. ومع ذلك، يوضح الشكل 7 أن وضع سقف لنهايات خيوط ليس له أي تأثير لا يمكن اكتشافها، وأن طرفي أنبوب الحث على عدم أي تأثير crosslinking عابر في شبكة9. تتمسك الأحداث إلا تلعب دوراً هاما عندما تتم معالجة العينة جداً تقريبا وكسر الأنابيب بسبب بيبيتينج قاسية. تظهر هذه النقاط الكسر الواقع للحث على آثار كروسلينكينج، مما يؤدي إلى استجابات غير الخطية للنظام، مثل تشديد الضغط (الشكل 8).

إذا كانت العينات التي أعدت بعناية، يمكن استخدامها لاختبار تأثير تركيز الشعيرة (الشكل 9 ألف) أو تصلب (9B الشكل) الشعيرة9 على الخواص الميكانيكية للشبكات التي تتكون من بوليمرات سيميفليكسيبلي. للمرة الأولى، درست العلاقة الكمية بين خيوط صلابة ومرونة شبكة تجريبيا ومنهجي، مما أسفر عن سلوك قانون سلطة خطية، التي تتناقض مع التنبؤات النظرية السائدة. وتبين هذه النتائج أن الأنابيب النانوية الحمض النووي هي أداة جديدة وتنوعاً دراسة آثار البوليمرات سيميفليكسيبلي، التي كانت سابقا غير قابل للوصول تجريبيا9،27. الآن، نظريات مختلفة يمكن تجريبيا اختبارها، التي تنطوي على بيانات حول تبعيات على طول استمرار لف خيوط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحقق الآثار الأساسية جداً، مثل ريبتيشن (الشكل 10)، من منظورات مختلفة باستخدام الأنابيب التي تختلف في صلابة.

الاسم التسلسل
U1: * a1-b1 *-a2-b2 جكجاتاج-أكجكتاجككا-ككتتاجاتكك-تجتاتكتغت
U1-Cy3: * a1-b1 *-a2-b2 Cy3-تجكجاتاج-أكجكتاجككا-ككتتاجاتكك-تجتاتكتغت
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 جاتكتااج-أككاجاتاكا-ككاكتكتكك-تجاكاتكتجت
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 جاجاجتج-أكاجاتجتكا-ككجتجاجاكك-تجكاتجكجت
U4: a4 *-b4 *-a5-b5 جتكتكاكج-أكجكاتجكا-ككجكاكجاكك-تجتكجاكاجت
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 جتكجتجكج-أكتجتكجاكا-ككاكجاتجكك-تجاتاجاجت
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 جكاتكجتج-أكتكتاتكا-أتجكاككتكك-أجكتتجاتج
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 جاجتجكات-كاتكااجكت-آكجتاكتا-تجاكتججا
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 تاجتاككجت-تكككاجتكا-آكاكتاجاك-أكاتجكتككتا
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 جتكتاجتجت-تاجاجكاتجت-كجاجاكتاكاك-ككتجككاكك
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 تجتاجتكتكج-جتجكاجج-تاكتاككجكت-ككاتاجات
U11: a11 *-b11 *-a12-b12 أجكجتاجتا-أتكتاتج-أتككجتكتاتك-تاكاكتاتكا
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 أتاجاكجات-جاتاجتجتاج-أجاكجااتك-أجكاجاكتا
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 جاتتكجتكت-تاجتكتجكت-كتجكجاجتا-تكاجككجاجك
T4: a4 *-b4 *-a1-b1 جتكتكاكج-أكجكاتجكا-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T5: a5 *-b5 *-a1-b1 جتكجتجكج-أكتجتكجاكا-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T6: a6 *-b6 *-a1-b1 جكاتكجتج-أكتكتاتكا-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T7: a7 *-b7 *-a1-b1 جاجتجكات-كاتكااجكت-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T8: a8 *-b8 *-a1-b1 تاجتاككجت-تكككاجتكا-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T9: a8 *-b8 *-a1-b1 جتكتاجتجت-تاجاجكاتجت-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T10: a10 *-b10 *-a1-b1 جتجتاجتكتكج-جتجكاج-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
T14: a14 *-b14 *-a1-b1 تاكتكجكاج-جكتكجكتجا-ككتاتكجكك-تجكتاجكجت
نهاية سقف A1 ككتاتكجكك
نهاية سقف A2 ككتتاجاتكك
نهاية سقف A3 ككاكتكتكك
نهاية سقف A4 ككجتجاجاكك
نهاية سقف A5 ككجكاكجاكك
نهاية سقف A6 ككاكجاتجكك
نهاية سقف A7 أتجكاككتكك
نهاية سقف A8 آكجتاكتا
نهاية سقف B1 * أكجكتاجككا
نهاية سقف B2 * أككاجاتاكا
نهاية سقف B3 * أكاجاتجتكا
نهاية سقف B4 * أكجكاتتجكا
نهاية سقف B5 * أكتجتكجاكا
نهاية سقف B6 * أكتكتاتكا
نهاية سقف B7 * كاتكااجكت
نهاية سقف B8 * تكككاجتكا

الجدول 1: تسلسل مثال للحمض النووي التهجين من nHTs المعروضة في رقم 1، التي استخدمت أيضا في دراسات سابقة على nHTs9، الطبقة = "xref" >،2627،28- مجموعة معينة من تسلسل يسمح للجمعية العامة من سبعة أبنية أنبوب مختلفة (مثلاً، a1 هيبريديزيس مع تسلسل مكملة a1 *). يمكن أن تتكون أبنية الأنبوبة الأخرى لا تعطي هنا أيضا بالإضافة أو الطرح من خيوط مصحوبة سيكليزيشن وفقا ل حبلا ن مع يو1.

Figure 1
رقم 1: أنبوب الجمعية والهندسة المعمارية. (أ) التخطيطي للجمعية 4HT مكونة من أربعة متميزة 42-الصرف. هجن المتاخمة خيوط الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل من خلال المجالات التناوب المستمر للقواعد 10-11، يتبين من الأسود الطويل القراد (القراد سوداء قصيرة تشير إلى قواعد أونهيبريديزيد). ويتميز هذا الحافز متداخلة نصف ينتهي مثبت على كلا الجانبين على طول المحور، مما يتيح النمو المحوري، يدل على السهم. خيوط الحدود U1 و T4 أيضا ميزة المجالات مكملة وهكذا تشكل حلقة مغلقة، كما هو مبين بالسهم الأيمن. علما أن هذا الرسم تمثيل 2D؛ في حالة المهجن، تشكل الخيوط لوالب مزدوجة وجميع القواعد المقترنة. (ب) تغطية التخطيطي ظاهرياً-3D من تيترامير 4HT مع اثنين من لوالب مزدوجة في طبقة بعيدة مظللة. نموذج لمجالات مكملة لوالب مزدوجة وترتبط بكلا لوالب مزدوجة المتاخمة للأنبوب مرة واحدة لكل وحدة طول العنصر. ويوجه واحد U2 حبلا سمكا للوضوح. (ج) ترد أمثلة عن سبعة أبنية أنبوب مختلفة، مع أرقام حبلا تتراوح بين 4 HT إلى 14 HT و لف تتراوح من 1.2 إلى 26 ميكرومتر. (د و ه) صور برنامج التحصين الموسع-فلوري المسمى Cy3، تمتز 5 HT و 10 HT توضيح ستيفنيسيس مختلفة عن طريق خطوط منحنية بشكل مختلف. تراكب الحمراء هو كفاف خيوط العثور عليها عن طريق تحليل الصور، مع نهاية إلى نهاية المسافة R و l طول كفافج. الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: منحنى درجة الحرارة والجمعية المقابلة للأنابيب النانوية الحمض النووي- (أ) الأنابيب النانوية الحمض النووي يتم تجميعها في ثيرموسيكلير عبر البروتوكول الذي يحتوي على عدة درجات الحرارة متميزة الخطوات عبر تقريبا 11 حاء (ب) في نظام PCR كمي في الوقت الحقيقي، التغيير النسبي من إشارة الفلورسنت من خيوط الملون مقياس للحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل شكلت حديثا بينما يمر منحنى درجة الحرارة. اعتماداً على النوع من الأنابيب النانوية الحمض النووي، يمكن أن تختلف معدل الجمعية. أكثر تعقيداً في تشكيل الهيكل وأوسع الجمعية، يفترض أنه منذ خيوط أكثر (وذلك أكثر الشرائح مع متواليات متميزة ودرجات حرارة انلينغ المحلية) بحاجة إلى هجن في المواقف المناسبة، عملية التي تحركها التقلبات الحرارية العشوائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: صورة فؤاد ممثل شبكة متشابكاً من 8HTs في 4 ميكرومتر. وسجلت الشخصية ارتفاع شبكة بريفورميد من استيعابها لسطح ميكا 8HTs استخدام التنصت وضع في الهواء. صور فؤاد تصور إسقاط 2D من الشبكة ولكن لا تسمح لاستخراج البيانات (مثلاً، حجم فتحات الشباك) للقضية 3D موثوقة نظراً للأنابيب، فضلا عن الشبكات التي يتم ضغطها في 2D تكوين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مجموعة خطية. سلالة القياسات (ز' = 1 هرتز) تكشف عن هضبة مطاطا خطي واسعة، دون علامات آثار crosslinking مثل السلوك اللاخطي الإظهار كسلالة تصلب. أعلاه سلالة مميزة (مختلفة بالنسبة لكل nHT)، تقطع معامل مرونة الهضبة لا رجعة فيه. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لمتوسط قيمة كل القياسات المنجزة. الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الاعتماد على التردد نموذجي لشبكة 6HT متشابكاً. إظهار شبكات أنابيب الدنا هضبة مرونة واسعة على مدى أربعة أوامر من حجم، تبعاً لتواتر التطبيقية. كما هو متوقع لشبكة بوليمر، الجزء مطاطا (ز') معامل القص المعقدة أعلى بكثير من الجزء اللزج (ز''). الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: أي آثار واجهة الهواء السائل- تواتر عمليات التمشيط (والاحتلالات؛ γ = 5 ٪) من 8HT عينات في 8 ميكرومتر كشفت أن تأثير آثار التبخر وجيليشن في واجهة الهواء والماء لا يعتد بها. وقد استخدمت مرات الموازنة المختلفة، فضلا عن اثنين من الأساليب المعروفة لإجراء تخفيض جذري في البروتين التكتل في الواجهة (التوتر السطحي والدهون)،. وسجلت مستقلة عن الطريقة، وأي إشارة إلى التأثيرات جذرية بالتبخر أو مرونة السطحية. هنا، ز ' يمثل معامل مرونة وز '' يمثل معامل اللزوجة (خطوط متقطعة). الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: لا تأثير لتعديل نهاية. معامل مرونة الهضبة يبقى ثابتاً عند وضع سقف لنهايات لزجة الحرة 8HTs مع على تسلسلات يكمل كل منهما. الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: تأثير إجراءات التعامل مع الحمض النووي بريفورميد شبكات قياس. اعتماداً على كيفية التعامل مع شبكات بريفورميد بعد التهجين، قد تختلف القياسات. في هذا المثال، كانت متنوعة جذريا تدفق القص أثناء بيبيتينج للأنابيب النانوية الحمض النووي، وكسر الأنابيب إذا عولجت أيضا تقريبا. الكسر يؤدي إلى تفاعلات غير مرغوب فيها بين المعرضين، تكميلية واحدة-خيوط ربط لأجزاء مكسورة أو تمزق، مما يؤدي إلى زيادة في المرونة ويستحث التأثيرات غير الخطية، sأوك كسلالة تصلب (زيادة مرونة لمنحنى ضغوطا كبيرة، الخضراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: تمكين الأنابيب النانوية الحمض النووي دراسة لف التبعيات. (أ) دراسة شبكات البوليمرات سيميفليكسيبلي مع نHTs تمكن تحقيق الاستجابة الميكانيكية للنظام مع زيادة تركيز (تركيز اكتساح)، مماثلة للدراسات التي تعتمد على البوليمرات الحيوية مثل الأكتين. (ب) بالإضافة إلى ذلك، أبنية مختلفة من الأنابيب تيسيرا لتحديد الاستجابة الميكانيكية بالنسبة لمتفاوتةف من خيوط الكامنة، وقابل للتطبيق بشكل طبيعي بوليمرات سيميفليكسيبلي. ولهذا الغرض، هو ريبلوتيد البيانات من أ للتصدي لرفع معامل مرونة الهضبة بالنسبة لف. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لمتوسط قيمة كل القياسات المنجزة. الشكل مقتبس من شولت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
رقم 10: حجم ريبتيشن ومش- تسجيل الأسفار الصور من خيوط ريبتاتينج (المسمى واحد الحمض النووي 8HT جزءا لا يتجزأ من شبكة غير مسمى؛ c = 14 ميكرومتر) يمكن استخدامها للتحقق من طبيعة متشابكاً خيوط في الشبكة. أن يعوق أي آثار كروسلينكينج هذا نشر أحادي الأبعاد. الداخلي: يمكن استخدام التحليل ريبتيشن لتحديد حجم شبكة القياس مع التركيزات، الذي يقارن جيدا للقياسات أكتين ويتفق مع التنبؤات النظرية30. أشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري لمتوسط قيمة كل القياسات المنجزة. الشكل مقتبس من شولدت وآخرون9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للحصول على الشبكات بشكل صحيح المشكلة، تجميع الأنابيب النانوية الحمض النووي خطوة حاسمة. الأخطاء التي تحدث أثناء عملية التوليف تأثيراً سلبيا على نوعية الأنبوبة؛ لذلك، من المستحسن أن يستخدم [هبلك] أو عملية أكثر صرامة لتنقية النوكليوتيد. منذ تشكيل منفصلة بدلاً من تجميع الأنابيب النانوية الحمض النووي، فضلا عن توزيعها طول، يعتمد على ستويتشيوميتري اكويمولار من النوكليوتيد ن التأسيسية ضمن المجموعة، من الضروري أن يستحسن تركيزات من الخيوط التي تم شراؤها، منذ نظراً للقيم يمكن أن تختلف إلى حد كبير من تركيز الفعلية. وهذا يمكن أن يؤديها، على سبيل المثال، مطيافية الأشعة فوق البنفسجية بالنسبة في الطول موجي امتصاص من 260 نيوتن متر. ونود أن نلاحظ أن الأوزان الجزيئية وانقراض معاملات تختلف بين تسلسلات مختلفة؛ ولذلك، ينبغي تحديد القيم لترجمة امتصاص إلى تركيز لكل اليغنوكليوتيد الحمض النووي. عند استخدام المعدات الأمثل لأحجام عينة صغيرة، مثل نانودروب، ينبغي أن تؤخذ عدة مرات كل نقطة القياس وبلغ متوسط. الامتثال لنطاق كشف والمطياف الخطي. تمييع الكسر المستخدمة لتحديد تركيز إذا لزم الأمر. أخطاء طفيفة يمكن أن يكون لها تأثير كبير على ستويتشيوميتري الصحيح ونوعية تكوين الأنبوبة؛ ولذلك، بيبيتينج خيوط واحدة يجب أن تكون دقيقة قدر الإمكان. فيما بعد، ينبغي أن تكون مختلطة الحل النهائي عينة دقة ببطء بيبيتينج العينة صعودا وهبوطاً قبل وضعه في ثيرموسيكلير. إذا تم تعديل مسارات مع الأصباغ الفلورية للتصور، ينبغي تنفيذ كافة الخطوات في بيئة محمية من الضوء المباشر، ولاحقا إضافة وكلاء مكافحة تبييض المنشأة (أي الأوكسجين الكسح النظم، مثل ويوصي الجلوكوز أوكسيديز/الكاتلاز). بعد أن كانت مختلطة فروع واحد في ظروف المخزن المؤقت الصحيح، يتم تطبيق منحدر درجة حرارة هجن بنيات (الشكل 2A). يتبع هذا النمط درجة الحرارة درجة الحرارة التهجين الحرجة سبق تحديدها، حيث يتضاعف الحمض النووي شكل لوالب. وقد وضعت عدة أساليب لتحليل حركية تهجين الحمض النووي (أي أصلي "الأشعة فوق البنفسجية الحمض النووي" امتصاص31،32من القياس، أو الأصباغ الفلورية33). في الأسلوب الأخير، الأصباغ إينتيركالاتي في الحمض النووي لوالب مزدوجة، تشكيل مجمعات الفلورية العالية أكثر إشراقا من الأصباغ غير منضم. أنها جزئيا ربط مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل لكن ليس على واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي34. ولذلك، هذه الأصباغ التي طبقت على رصد الحمض النووي نانوستروكتوري التجميع الذاتي في نظام35 ويمكن استخدامها لتحديد ظروف مثالية من الجمعية.

في البداية، أي الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل داخل العينة، مثل الدوبلكس الهائل والمعرفة مسبقاً، يتم التشويه والتحريف في درجة حرارة عالية (90 درجة مئوية) لتجنب إقران قاعدة غير مقصودة. لاحقة انخفاض تدريجي في درجة الحرارة (على غرار الشكل 2A) يقلل حركة خيوط الحمض النووي، تمكين الأحداث قاعدة التقشير الحراري. بسبب تقليل الطاقة الحرة، هجن خيوط الحمض النووي تفضيلي في على تسلسلات التكميلية. عندما يتم تطبيق صبغة إينتيركالاتينج دسدنا محددة، يزيد السطوع مع تشكيل مجمعات الفلورية العالية، الذي بدوره مقياس كمي ل الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل شكلت حديثا34. التغيير النسبي من إشارة الأسفار لتكوين 4HTs و 8HTs المرسومة في الشكل 2. ويحسب هذا التغير النسبي بمتوسط كثافة الأسفار لكل درجة الحرارة وبعد طرح قيمة متوسط درجة الحرارة السابقة. مع انخفاض درجة الحرارة، الأسفار مرتفعة يمكن أن يكون الكشف عن (الشكل 2)، وذروة هذا المنحنى يسلط الضوء على درجة الحرارة التي تحدث فيها أحداث التهجين ضخمة. قطره المنحنيات تشير إلى قيم الكثافة التوصل إلى هضبة. اعتماداً على بنية الحمض النووي وتعقيدها (مثلاً، فروع مجموعة كبيرة أو صغيرة من الحمض النووي)، يمكن أن تكون الذروة حادة (الشكل 2B، المنحنى الأزرق) أو واسعة (الشكل 2B، منحنى الخضراء). عندما يكون ذلك ممكناً، وهذا ينبغي اختبار لكل هيكل المصممة حديثا لضمان أن تناقص تدريجيا جزء منحدر الحرارة تحتوي على نطاق حيث يتم حدوث تشكيل أنابيب عبر تشكيل قطاعات دسدنا المهجن. بعد درجة الحرارة الملائمة يتحدد نظام، يمكن تجميعها النانو بنجاح في نطاقات ضيقة جداً في درجة الحرارة (الشكل 2B، المنحنى الأزرق)، أو حتى إيسوثيرمالي35. علما بأن التهجين الحمض النووي عدة فروع في المشابك الدوري يدفع التعاونية انلينغ آثار35،36، التي تدعم زيادة الحمض النووي الصلب. فينبغي أن يعتبر أن الأصباغ إينتيركالاتينج تمتد لوالب الحمض النووي خارج عن أزواج قاعدة 10.5 القياسية كل دورة حلزونية التكوين، وبالتالي تغيير الهندسة الإجمالي من الأنابيب. ولذلك، أنه من غير المستصوب لزيادة تركيز صبغة أكثر واحد جزيء الواحدة أزواج قاعدة الحمض النووي 90035. علاوة على ذلك، قد تحيد الجمعية ذروة درجة الحرارة درجة الحرارة الفعلية انلينغ الأمثل. لتحقيق الدقة العالية، ولتحديد أفضل حالة لتشكيل أنبوب، ينبغي التحقيق في التهجين الحمض النووي خلال العديد من الخطوات درجة الحرارة المتغيرة ببطء، والتي ينبغي أن تدقق مع [اغروس] هلام التفريد. في حالة الأنابيب النانوية الحمض النووي، قمنا بإنشاء بروتوكول ثلاث خطوات. أولاً، يتم تسخين العينة إلى 90 درجة مئوية تؤذي الحمض النووي في خيوط واحد. وفي وقت لاحق، تغطي نطاق واسع من درجات حرارة (حول ذروة الجمعية إشارة الأسفار). وفي حالتنا، تغطي مجموعة من 10 درجة مئوية، تتراوح ما بين 65 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية، مع خطوة-0.50 درجة مئوية كل 30 دقيقة. في الخطوة الأخيرة، درجة الحرارة يجب سرعة إسقاط إلى درجة حرارة الغرفة--أو، كما هو الحال في حالتنا، 20 درجة مئوية-لمنع أي تفاعلات سلبية في متوسط درجات الحرارة (الشكل 2A). عادة, ثيرموسيكليرس الحرارة العينات المأخوذة من درجات الحرارة الأكثر برودة. ولذلك، من المهم لضبط درجة حرارة الغطاء وفقا للحد من تبخر السائل في العينة خلال الجمعية العامة، مما يزيد من تركيز العينة النهائية.

إذا كان nHTs تتشكل على نحو ملائم، أنها ترتيب شبكات متشابكاً بحتة (الشكل 3)، دون التفاعلات التي تسبب تأثيرات crosslinking بين أنابيب متميزة. كروسلينكس يفترض نتيجة مزاوج شرائح الحمض النووي تمتد من العيوب على طول أنبوب أو في نهايات لزجة، الذي سيكون حراً في زوج مع شرائح مفردة-الذين تقطعت بهم السبل التكميلية على أنابيب المجاورة. هذه الآثار من شأنه أن يحفز خصائص غير الخطية، مثل تصلب سلالة (زيادة ز' للضغوط الكبيرة)، ولكنها غائبة في شراك شبكات (الشكل 4). Γ-الاحتلالات المعروضة أيضا تكشف عن نظم الإجهاد الخطي المناسبة للقياسات انسيابية بشكل عام. عتبة معينة، تصدعات في الشبكة أو يفقد الاتصال مع اللوحات رهيوميتير، الذي لا رجعة فيه أضرار النظام. ولذلك، ينبغي أن تكون سلالات التطبيقية في نظام خطي للحصول على بيانات موثوق بها. عادة ما يكون سلالة من 5% كافية تسفر عن بيانات تفوق النظام الضوضاء. يمكن تطبيق السلالات أعلى؛ ومع ذلك، أنها تقترب بسهولة عتبة تمزق، ويمكن أن تكون النتائج فالسيفياد بسبب قوته في النظام غير الخطي.

قياسات انسيابية تتطلب أعدادا دقيقا، بما يتفق عينة، والنظر بعناية في البروتوكولات القياس للحصول على النتائج استنساخه والتفسير. النقطة المركزية ﻹنشاء شبكة عشوائية تماما، والخواص بين لوحات رهيوميتير منذ هذه الشبكات هي معظمها هيكل استنساخه فقط. وهكذا، مرات الموازنة طويلة (عادة حوالي ح 2، بل وأحيانا أكثر) هناك حاجة لتفريق أي آثار الطلب التي تحدث بسبب المحاذاة المستحثة بالقص أثناء بيبيتينج عينة. وأوصت تجارب ما قبل الاختبار لتسجيل تطور الوقت (وقت الاجتياح) للنظام خلال الموازنة من أجل تحديد الإطار الزمني اللازم. مجرد الإشارات إلى الهضاب دون مزيد من التغييرات، هو اكويليبراتيد النظام. مرة واحدة من الموازنة قد حددت الشروط، الاختبارات المطلوبة، مثل سلالة منحدر أو f أو الاحتلالات γ، يمكن تنفيذها. اختبار طائفة واسعة من سلالات يمكن في نهاية المطاف إلى تدمير الشبكة أو الاتصال باللوحات. ومع ذلك، إذا كانت الاختبارات محدودة لسلالات عتبة تمزق، سلالة سلالم والاحتلالات يمكن أن تكراري تتكرر للتحقيق في آثار الشيخوخة أو التباطؤ. وفي حالة والاحتلالات، مرات القياس يمكن أن تختلف إلى حد كبير. اختبار الترددات المنخفضة جذريا يطيل التجارب، نظراً للتذبذب واحد قد يستغرق عدة دقائق. لاحظ أنه، في حالة نHTs، والاحتلالات تكشف أن معامل مرونة ز' تجاوز معامل لزوجة ز'' بحوالي واحد الضخامة، مما يوضح الرد المرن السائد لهذه النظم ( الشكل 5). عموما، يمكن أن يكون مصحوبا أنواع مختلفة من تجارب قصيرة والاحتلالات قبل وبعد التجربة الرئيسية للتأكد من أن النظام لا يزال دون عائق بالقياس نفسه. بيد أن بعض الآلات لتغيير وضع المحرك الأساسي لأنواع مختلفة من القياسات، وخاصة عند تغيير من التجارب الديناميكية (مثل ذبذبات واو-الاحتلالات) إلى منحدر سلالة ثابتة. كثيرا ما يرافق هذا التغيير سلالات كبيرة عفوية تدمير الشبكة وتلطيف القياسات اللاحقة. وهكذا، من المستحسن للتحقق من مواصفات رهيوميتير المستخدمة.

وتكشف تجارب ريولوجيا على الأنظمة المستندة إلى أكتين تأثير كبير من تمسخ البروتينات التي تحدث في الهواء والماء واجهة النظام. الالتزام البروتينات التشويه والتحريف أونسبيسيفيكالي ببعضها البعض، وبالتالي تشكل جل كثيفة التي يمكن جداً أن تهيمن على الخواص الميكانيكية للنظام بأكمله. لمنع اتصال مباشر للعينة مع الهواء المحيط، يمكن استخدام تقنيات التخميل التي تقمع أيضا تبخر محتوى الماء من العينة. الأساليب المحتملة ثلاثة: (ط) المحيطة بالدائرة عينة مع المخزن المؤقت نفسه كما هو الحال في العينة؛ (ثانيا) استخدام التوتر السطحي لتغطية الواجهة بسبب نطاقاتها مسعور وماء (يجب الحرص، حيث تتداخل بعض التوتر السطحي مع والتشكلات البوليمر)؛ أو (ثالثا) تستخدم الدهون أكثر بيولوجيا متوافقة، مع آثار مماثلة كالتوتر السطحي. تجدر الإشارة إلى أن نعثر HTs لا تخضع لتأثيرات تمسخ في الواجهة، والنتائج مستقلة عن طريقة تخميل (الشكل 6)، الذي يلغي مصدرا رئيسيا لخطأ. عموما، ينبغي دائماً مختومة الدائرة عينة مع قبعة، التي يمكن أن تكون مجهزة بالاسفنج المبلل لزيادة نسبة الرطوبة في الدائرة، قمع التبخر.

كما هو موضح بإيجاز سابقا، مصدر خطأ محتملة في النظم القائمة على الحمض النووي أونهيبريديزيد الحمض النووي، مثل الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل مزاوج يتدلى في عيوب أو في نهايات الأنابيب النانوية، التي قد تتسبب في تأثيرات crosslinking إضافية. التحقيق و/أو القضاء على هذا الاحتمال، يمكن استخدام خيوط قصيرة متكاملة للحد من هذه الغايات لزجة. ومع ذلك، أظهرت التحقيقات الخاصة بنا أن إضافة وضع سقف خيوط أي تأثير على عرض نHTs، وسلوك شبكات متشابكاً لا يزال دون تغيير (الشكل 7). ومع ذلك، وضع حد أقصى نهايات لزجة مع تسلسل تكميلية يمكن أن تكون مفيدة للنظم الأخرى القائمة على الحمض النووي (وأكثر تعقيداً) لقمع تفاعلات غير مرغوب فيها. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن بيبيتيد عينات HTs نبعناية (مثلاً، لتمييع الخطوات وإعداد نموذج) لمنع أي ضرر كسر أو غيرها للأنابيب. إذا كان الحل هو بيبيتيد جداً تقريبا، كسر الأنابيب حسيب، وكشف عدد كبير من نهايات لزجة في نقاط الخلل، مما يؤدي إلى غير مرغوب فيها التفاعلات بين أنابيب و crosslinking المحتملة في النظام. وهذا يتداخل مع الإشارة ويؤدي إلى تشديد الآثار، فضلا عن التأثيرات غير الخطية مثل تصلب السلالة، التي تصبح مرئية في γ-الاحتلالات (الشكل 8). وهكذا بيبيتينج الحل متشابكاً ينبغي أن يتم إلا ببطء واستخدام تلميحات ماصة قطره كبيرة نوعا (قطع نهاية طرف الماصة من المستحسن) للحد من القص قوات في الأنابيب.

وفي الختام، نتس الحمض النووي نظام نموذج مناسب والقدرة على التكيف لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي ومعظم الشبكات التي تكونت من خيوط هذه، تمثل فئة جديدة من الهلاميات المائية الانضباطي ميكانيكيا. إذا كان يتم إعداد هذه الأنابيب بعناية، يمكن استخدامها لاختبار أثر لف خيوط في مختلف الحالات. قياس انسيابية السائبة متشابكاً الشبكات، على سبيل المثال، ويكشف عن أن التبعيات المتوقعة نظرياً لمعامل مرونة مع تركيز و لف تتعارض مع القياس المشتقة تجريبيا قوانين (الشكل 9)9. وتؤكد هذه الدراسة أنه يمكن زيادة مرونة شبكة عن طريق زيادة صلابة للبوليمرات الأساسية. تقليديا، تم زيادة صلابة من المائية أما بإضافة البوليمرات أكثر للحل أو بحمل كروسلينكس (فيزيائية أو كيميائية) بين37،البوليمرات المجاورة38. ومع ذلك، محتوى جزيئي أعلى يرتبط أيضا مع حجم مش مخفضة، التي يمكن أن تحد من التطبيقات مثل زراعة الخلايا ثلاثي الأبعاد. كروسلينكس، من ناحية أخرى، يمكن أن تحدث التغييرات الشكلية المعقدة داخل بنية الشبكة الأساسية، مما يزيد من تعقيد إلى ضبط دقيق للخصائص الميكانيكية39. استخدام شبكات nHTs، ومع ذلك، يسمح لفصل كامل لهذه المعلمات، حيث يمكن الناجمة عن آثار تشديد بتغيير صلابة خيوط الأساسي فقط بينما تترك حجم فتحات الشباك دون تغيير. وعلاوة على ذلك، يمكن تغيير البنى أنبوب على وجه التحديد الاندماج بشكل انتقائي تأثيرات إضافية مثل كروسلينكينج، الذي، وبالمثل في شبكات متشابكاً، يخلق زيادة إمكانيات تجريبيا لاختبار التنبؤات النظرية معلمات مثلl ف أو التشعب حجم وقوة للشبكات. وبصفة عامة، بنية قابلة للبرمجة ويوسع نطاق التطبيقات، مما يتيح لدراسة لفتعتمد آثار ليس فقط بكميات كبيرة، ولكن أيضا على مستوى جزيء واحد. يمكن تضمين الأنابيب المسماة في الشبكة للدراسة، على سبيل المثال، بالتبعية لف على اقتراح أحادي البعد خيوط في الولادة مثل أنبوب، يشار إلى ريبتيشن (الشكل 10)9. إذا كان هذا الاقتراح انتشارية مرئياً، فإنه يتحقق أيضا طبيعة متشابكاً من الشبكة، نظراً لأنها سوف قمعت بآثار كروسلينكينج. تحليل القوى المحركة الأساسية كما يكشف حجم فتحات الشبكة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الأنابيب للتحقيق في تبعية صلابة وعدم التطابق الأنابيب الكامنة في تشكيل حزم40،،من4142،43، 44 , هياكل 45 أو رتب أعلى، مثل نجمة مثل أستيرس46،47،48،49،50، الذي يمكن أن يتسبب بآثار كروسلينكينج أو عن طريق 27من بيئات مزدحمة جزيئيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نعترف بالتمويل عن طريق DFG (1116/17-1) ومدرسة لايبزيغ للعلوم الطبيعية "بويلدمونا" (GSC 185). تم دعم هذا العمل من خلال مشروع اجتذاب فراونهوفر 601 683. ت. ﻫ. تعترف بتمويل من "الصندوق الاجتماعي الأوروبي" (كلية العلوم التربوية-100077106).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، 128 مسألة، ريولوجيا، البوليمرات سيميفليكسيبلي، طول استمرار، أنابيب الحمض النووي، البوليمرات البيولوجية، أكتين، والمائية، وشبكات
النانومترية الحمض النووي كأداة مرنة لدراسة البوليمرات سيميفليكسيبلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter