Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56056
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 1,2, 1, 1, 1,2, 2, 1
1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig
* These authors contributed equally

Summary

Полугибких полимеров отображения уникальные механические свойства, которые широко применяются в живущих систем. Однако систематические исследования биополимеров ограничены, поскольку такие свойства, как жесткость полимера недоступны. Эта рукопись описывает, как обойти это ограничение, программируемые ДНК нанотрубок, позволяя экспериментальные исследования о влиянии накаливания жесткости.

Abstract

Механические свойства сложных, на полимерной основе мягкой материи, например клетки или биополимеров сетей, может пониматься в ни классической рамке гибких полимеров, ни жестких стержней. Основные нити остаются вытянутой вследствие их жесткость не исчезающие позвоночника, который количественно через сохранение длины (lp), но они также subject to сильные зыбкост тепловой. Их конечный изгиб жесткость приводит к уникальным, нетривиальные коллективных механики сыпучих сетей, позволяя формирования стабильных подмостей на низкой громкости фракций обеспечивая большие сетки размерами. Этот основополагающий принцип широко распространены в природе (например, в клетки или ткани), минимизации высокой молекулярной содержание и способствуя диффузионных или активного транспорта. Благодаря их биологические последствия и потенциальные технологические приложения в биосовместимые гидрогели полугибких полимеров претерпели значительные исследования. Однако понятной расследований остается сложной, поскольку они полагались на природные полимеры, такие как филаментов актина, которые не являются свободно перестраиваемый. Несмотря на эти ограничения и отсутствием синтетических, механически перестраиваемый и полугибких полимеров филаментов актина были созданы в качестве общей модели системы. Основным ограничением является, что Центральный количество lp не могут быть настроены свободно изучить ее влияние на макроскопических массовых структур. Это ограничение была решена путем применения структурно программируемых нанотрубках ДНК, включение контролируемые изменения жесткости накаливания. Они формируются через плитки основе конструкции, где дискретный набор частично дополнительные пряди гибридизировать в кольцевую структуру с дискретной окружности. Эти кольца имеют липкие концы, позволяя эффективные полимеризации в нити несколько мкм в длину и отображать аналогичные кинетика полимеризации как природные биополимеры. Из-за их программируемых механики эти трубы являются универсальным, Роман инструменты для изучения влияния lp на сингл молекулы, а также основная шкала. В отличие от филаментов актина они остаются стабильными в течение недель, без заметных дегенерации, и их обработка сравнительно проста.

Introduction

Из-за сложного поведения, благодаря их уникальным механических свойств полугибких Полимеры являются базовыми стандартными блоками живой материи. В отличие от гибких полимеров полугибких полимеров принять вытянутой конфигурации из-за их не исчезает скованность позвоночника оставаясь при условии сильные термические флуктуации1. Таким образом чисто стохастических моделей не может применяться к их поведение, как и в случае с крайностями полностью гибкие или жесткие полимеров. Для количественной оценки этой жесткости через lp, который является константа распада тангенс тангенс корреляции вдоль нити накала4был разработан так называемый червь как цепь модель2,3,4 . Если lp сопоставима с контурной длины (lc) нити накала, полимер считается полугибких1. Аналогично поляков палатки, их механизмов в сетях или пучки стабилизирует всю коллективной системы при низкой громкости фракций, приводит к необычным вязкоупругие свойства5,6,7, 8,9. Эти структуры обеспечивают высокую эластичность в целом сетка Размеры10, поддержание механическую целостность то же время содействие диффузионные и процессы активного транспорта. Это свойство особенно подходит для биологических систем, таких как цитоскелета или внеклеточного матрикса, но она также широко используется в пищевой инженерных1,,1112.

Выходящие за рамки их значимости для живой материи, важно всесторонне изучить на физические свойства этих структур для того, чтобы иметь инструменты для разработки биоимитирующие материалы или Роман гидрогели. С точки зрения полугибких полимеров это предполагает систематическое определение коллективные свойства результате сингл накаливания свойства, такие как lp и развития описательный теоретические основы сетей. В первопроходца исследования сотовой биополимера актина была учреждена в качестве модельной системы для полугибких полимеров и до сих пор считается золотым стандартом5,13,14,15 , 16 , 17. Однако, исчерпывающего исследования ограничены с этой системой, поскольку они привязаны к имманентные свойства этого белка. Различные теоретические подходы нацелены на создание Описание нетривиальных механического поведения на уровне одной нити накала и привели к особенно различных масштабирования предсказания для зависимость модуль сдвига линейных упругих плато, G 0 (то есть, «эластичность» сети), в отношении концентрации (c) и lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Хотя концентрация масштабирование легко доступны в экспериментах с актин- или другие модели системы и теоретические прогнозы были тщательно проверены13,16,24, 25, масштабирование относительно lp оставалась экспериментально недоступны. Однако, это одним из основных ограничений с lp также независимой переменной, которая является определяющей количество полугибких полимеров.

Этот центральный, природные ограничения, введенные фиксированной lp актин или других биологически производные полимеры, такие как коллаген недавно была решена путем применения плитки основе ДНК трубки, которые перестраиваемый в их механические свойства 9 , 26 , 27 , 28. небольшие вариации в архитектурах труб (например, различное количество составляющих ДНК пряди в пределах подразделения кольца) дают различные значения lp, которые могут быть оценены через микроскопии флуоресцирования, анализ одного колебания трубы либо путем оценки изогнутой конфигурации нескольких придерживался трубок как описано ранее9,28. Эти анализы показали, что lp населения различных трубка значения за более чем один порядок величины и различные оценки методов дают постоянные результаты9,28.

Удивительно общее масштабирование линейных упругих плато сдвига модуль G0 в отношении концентрации и lp было сообщено быть несовместимым с всех предыдущих теоретических подходов 9, в частности демонстрируют гораздо сильнее, чем предсказано зависимость от lp. Эти выводы подчеркивают значение новой модели системы для изучения Центральной свойства полугибких полимеров. Использование n-трубы спирали ДНК значительно расширяет сферу этих расследований. Не только может lp свободно варьироваться без изменения основной материал, но присущие программируемый характер ДНК можно включить систематического рассмотрения дополнительных элементов, таких как сшивки или кинетическим переключения процессов. Кроме того эти трубы растворимы в воде и, в отличие от большинства белков, стабильная в адекватных pH и ионных условий в течение нескольких недель, без обнаружению деградации9.

Чтобы собрать эти трубы, используется дискретный набор ДНК-олигонуклеотиды, каждый из которых содержит два домены, использующие дополнительные базовые последовательности для двух соседних нитей (из-за специфических последовательностей, одиночной стренги не может сформировать структуры, такие как шпильки). Дополнительные последовательности гибридизируйте циклическим образом, образуя замкнутые, половина перекроя кольца n в взаимосвязанные двойной винтовой сегментов (рис. 1а и B). Эти формы кольца на дискретные диаметр (рис. 1 c) и их половину перекрытие конфигурации предоставляет осевой липкие концы дополняет липкие концы другого кольца. Это селективный Добавление сопоставления олигонуклеотиды триггеров, укладывая колец, ведущих к эффективной полимеризации нитчатые трубы спирали ДНК размера n (nHT). Их контуров длины обычно измеряют несколько мкм в длину, и их распределение длины сопоставим с миозина нитей9,26,27,28. Для подобных нанотрубках ДНК показано, что они действительно обладают кинетика полимеризации аналогичны филаментов актина и микротрубочеккласс p = «внешней» > 29. В зависимости от числа n отдельных нитей ДНК, составляющих структуру основного кольца, nHT архитектуры, а также его окружности и диаметр, можно варьировать controllably. С помощью более нитей ДНК увеличивается окружность трубы кольца, и соответствующее изменение архитектуры смены механических свойств на более высокие значенияp l(рис. 1 c), соответствует более высокой жесткости. На шкале мезоскопических эти большие значенияp lперевести на менее изогнутой конформации из-за более высокой жесткости (рис. 1 d и E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка n HTs

Примечание: здесь, n обозначает количество различных одной нити ДНК, участвующих в формировании трубы спирали определенного размера. Для n = 8, восемь различных одной нити ДНК составляют блок кольцо.

  1. Последовательностей ДНК покупки (ВЭЖХ чистоты или выше) из подходящих синтеза ДНК услуг или выполнения очистки (образцовый последовательности в таблице 1) и синтез высокого качества.
  2. Ресуспензируйте лиофилизированный олигонуклеотиды в очищенной воды и следовать далее ресуспендирования инструкциям в соответствующем руководстве от компании. Регулировать количество воды, чтобы получить окончательный концентрации 200 µM.
  3. Определение концентрации одного ДНК пряди для проверки значений, предоставленных распространитель (например, через спектроскопия UV-Vis на 260 Нм) с точной стехиометрии имеет решающее значение для процесса сборки. Рассчитать концентрации олигонуклеотиды, принимая во внимание конкретные Молярная масса и коэффициент вымирания для каждого одноцепочечной ДНК олигонуклеотида.
    Примечание: Значения коэффициента вымирания изначально варьируются для различных последовательностей и указаны в документации коммерчески приобретенных ДНК. Они также могут быть рассчитаны в соответствии с моделью ближайшего соседа, с использованием ряда бесплатных онлайн инструментов. В соответствии с линейной диапазон спектрометра, рассмотрим разбавления образца, используемого для определения концентрации.
  4. С помощью микропипеткой, смешать ДНК пряди каждого в то же концентрации в контейнер подходит для Термоциклер (например, 200 мкл ПЦР-пробирку) сформировать желаемый n HTs (последний буфер условия: 1xTE (10 мм 1 мм и трис ЭДТА, рН 8) и 12,5 мм MgCl 2).
    Примечание: Окончательный ДНК образцов n HT состоят из n - 1 пряди, У 1 − U n − 1 и одно T n strand. Концентрация на нить может варьироваться от суб валиком для более чем 10 мкм, в зависимости от потребностей пользователя (например, < 1 мкм за прядь для последующего разведения соблюдать одной нити или более высокие концентрации для изучения густая сеть механика).
  5. Гибридизируйте n HTs в Термоциклер (денатурация 10 минут при 90 ° C, с последующей быстрой падение до 65 ° C; медленно температура снизится от 65 ° C до 55 ° C, с взаимодополняющими низкопробный спаривать в 20 шагах температуры -0.5 K за 30 мин Каждый; и быстрое падение от 55 ° C до 20 ° C); Посмотреть рисунок 2A.
    Примечание: Медленное снижение шагах от 65 ° C может быть увеличена, чтобы увеличить длину средняя трубка; Однако, последующее быстрое падение до 20 ° C важно избежать агрегации полимеризованной трубок.
  6. Хранить гибридизированные n HTs до 3 недель при температуре 4 ° C без обнаружению деградации.
    Примечание: Для флуоресцентной микроскопии, помечены n HTs гибридизированных (частично) заменив U1 с модифицированных U1-Cy3 (Таблица 1). За время наблюдения, рекомендуется добавление установленных анти отбеливающие агенты.
  7. Тщательно размыть образца до желаемой конечной концентрации (например, 4 мкм для сетей или 20 Нм для одной нити накала наблюдений) с использованием буфера выборки, в случае необходимости. Чтобы свести к минимуму возможные ошибки источники, собрать образцы на желаемой концентрации выпускных.

2. Сдвига реология

  1. выбрать соответствующий геометрии (пластина пластина или конус пластина) для Реометр динамический сдвиг. Для небольших объемов (то есть, ниже 200 мкл), используйте геометрия конуса пластина.
  2. Загрузить образец на динамический сдвиг Реометр.
  3. Воздух вода интерфейс образца и окружающей среды, используя следующие шаги для предотвращения потенциального испарения эффекты пассивации.
    1. Объемного образца с 2,5 мл ванны буфер образца.
    2. Добавления ПАВ чуть ниже концентрации мицеллообразования.
    3. Использовать Гамильтон шприц для объемного образца с липидов, чтобы избежать прямого контакта образца с воздуха.
  4. Печать образца камеры с крышкой с влажной губки и, если возможно, с дополнительной воды ванны (не в контакте с образца) для дальнейшего подавления испарения.
  5. Начала измерения с помощью программного обеспечения конкретных Реометр при комнатной температуре; Кроме того, выполнение измерений при различных температурах, например, 37 ° C (если физиологические условия необходимы).
    Примечание: Охлаждения образца часто сопровождается конденсации водяного пара из окружающего воздуха, хотя Отопление приводит к расширенной испарения. Оба эффекта бесконтрольно можно изменить концентрацию образца, поэтому все измерения в серии должны быть выполнены при постоянной температуре.
  6. Позволяют образец, чтобы сбалансировать втечение 2 ч при комнатной температуре. Время эволюция может контролироваться с развертки времени (один из данных точки в минуту; напряжение γ = 5%; частота f = 1 Гц).
  7. Измерения механических свойств с протоколами необходимый тест. Начните с серии зачисток частоты (f-зачисток) потому, что они не удалялось образца и позволяют больше измерений.
    Примечание: Кроме того, короткие f-зачисток должна осуществляться до и после длительного измерения (например длиной f-зачисток с гораздо более высоким разрешением) чтобы убедиться, что образец оставался неизменным на протяжении полного измерения протокол.
    1. Выполнить короткий f-развертки (например, γ = 5%; f = 0,01 Гц до 30 Гц; 5 точек за десятилетие).
    2. Выполнять длинные f-развертки (например, γ = 5%; f = 0.001 Гц до 30 Гц; 21 точек данных за десятилетие); режим низкой частоты может быть опущен, если не нужно сократить время измерения.
    3. Выполнить короткий f-развертки.
    4. Выполнять γ-развертки (например, f = 1Гц; γ = 0,0125% до 100%; 20 точек за десятилетие).
      Примечание: Используйте короткие f - развертки во-первых, как это обычно соответствует предыдущим f - зачисток потому что сетей обычно разрыва во время γ-развертки или отсоединить от пластины. Кроме того, использовать γ-рампа (например, = 0,025 s -1, t = 60 s); Однако, пандусы обычно требуют изменения мотор режим, поэтому последующие короткие f-отчёты будут сфальсифицированы.
  8. Бен или гладкой необработанные данные с ядро Gaussian.

3. при содействии флуоресценции анализ ДНК, отжига

  1. подготовить 8 аликвоты 12 мкл для каждого образца, используя 1-4 мкм ДНК пряди, 12,5 мм MgCl 2 в 1 x TE буфера и 1 x нуклеиновой кислоты гель пятно от 10000 x ДМСО акций. Сделать отрицательный контроль с не ДНК, но включают пятен нуклеиновой кислоты гель.
  2. Передавать в реальном времени PCR пластины аликвоты и запечатать клейкой пленкой (например, 96-луночных реакции плита).
    Примечание: Высокие температуры, используемые в термического отжига протоколов будет испаряться образцы. Таким образом, убедитесь, что колодцы плотно запечатаны с липкой пленкой для предотвращения увеличения испарения и концентрации воды, особенно в ходе долгосрочных экспериментов.
  3. Центрифуга пластину на 100 g x 1 мин при комнатной температуре для удаления пузырьков газа; Если развернуть пузырьки газа, скважин нельзя проанализировать.
  4. Загрузить пластину запечатанный в систему количественного PCR реального времени.
  5. Запустить программу отжига. Денатурируйте ДНК при 90 ° C на 10 мин падение температуры быстро до 72 ° C. Затем уменьшить температуру медленно на 0,5 ° C каждые 30 мин. После того, как сигнал сгнили, ускорить температура пандуса.
    Примечание: 72 ° C является достаточно выше реальной гибридизации температуры; Таким образом, сигнал записывается в широком температурном диапазоне подходит для определения необходимых температур.
  6. Убедитесь, что крышка циклователь нагревается до по крайней мере 100 ° C для предотвращения конденсации испаренной образца на клейкой пленке.
  7. Во время Ассамблеи, возбуждают образцы с Аргон Аргоновый лазер на 488 нм и обнаруживать флуоресценции в 550 Нм при использовании пятно гель нуклеиновой кислоты (или спектрально подобные). Другие красители выберите сочетание возбуждения соответствующую/выбросов. Измерения флуоресценции сигнал так часто, как можно увеличить общее качество сигнала, используя встроенную камеру.
    Примечание: Здесь, измерения проводились каждые 9 s.
  8. Если пресет плавления и отжига программы применяются, использовать предоставленное программное обеспечение для анализа данных. Если нет, вычесть предыдущее среднее значение от среднего значения для каждого шага температуры для получения относительного изменения флуоресцентного сигнала.

4. АСМ изображения

  1. расщеплять слюды (например, слюда " V1 ") путем прикрепления коммерчески доступных скотч и срывая; следует снять верхний слой слюды.
  2. С помощью микропипеткой, депозит предварительно сформированных n HT в мг 2 + содержащие складной буфера на свеже рассеченного слюды и пусть он соглашаться на 10 мин.
  3. Спина образцы в короткие 3-s интервалы 2000 x g на центрифугу столик, чтобы удалить оставшуюся жидкость. Несколько n HTs должен по-прежнему прилагаться к поверхности слюды.
  4. Использовать кончик консольные с высокой жесткостью (например, 54 Нм -1) и определить ее резонансной частоты с внутренним программным обеспечением AFM.
  5. Рекорд высоты профиля с AFM в воздухе в выстукивать режим ставкам низкого сканирования (например, 1 линия/s) чтобы избежать повреждения или вытесняя n Хайтс

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ассамблея нанотрубках ДНК через рампу температуры (рис. 2) является весьма надежный способ сформировать эти искусственные полугибких полимеров. Эти полимеры имеют сопоставимые характеристики их естественным аналогов, например филаментов актина, но обеспечивают гораздо шире экспериментальных рамок, поскольку их механические свойства могут быть controllably изменены9,27 . Как биополимеры они могут быть организованы в сетях (рис. 3) и конкретно позволяют проверить влияние жесткости накаливания на основной структуры и свойств. Как показано на рисунке 4, эти сети отображения режим линейной деформации для штаммов до 10%, что близко напоминает характеристики сетей нитей актина. В рамках этого режима реология Линейный сдвиг может легко применяться, например, для определения упругих и вязкой реакции ДНК нанотрубок сетей исследован на разных частотах9. Эти тесты показывают, что эти сети преимущественно ведут себя упруго (рис. 5). В отличие от измерения с белками, эти трубы не денатурируют на воздух вода интерфейс образца и таким образом, сложные пассивации стратегии требуется (рис. 6). Таким образом обработка образцов довольно прост и оказалась очень надежный, приносят устойчивые результаты с низкой вариации на образец.

Однако вопрос ли свободные «липкие концы» непарных одноцепочечной ДНК на обоих концах каждой трубы может вызвать нежелательные, стохастический гибридизации, события остались. Для решения этой проблемы, дополнительные «торцевая заглушка» последовательности, охватывающих концы трубки были добавлены к образцу после завершения процесса гибридизации. Однако Рисунок 7 показывает, что укупорки концы нитей влияет не обнаружено и что концы трубки не вызывать каких-либо переходных сшивки эффект в сети9. Вставлять события только играют значительную роль, когда образец обрабатывается слишком грубо и трубы перерыв из-за суровых закупорить. Действительно, как представляется, эти точки обрыва сшивки последствия, ведущие к нелинейной реакции системы, такие как Штамм жесткости (рис. 8).

Если образцы тщательно подготовлены, они может использоваться для проверки влияния концентрации накаливания (рис. 9а) или накаливания жесткость (рис. 9B)9 на механические свойства сети, состоящей из полугибких полимеров. В первый раз количественные связи между накаливания жесткости и упругости сети было исследовано экспериментально и систематически, уступая линейной власти закона поведение, которое противоречит преобладающей теоретические прогнозы. Эти результаты показывают, что ДНК нанотрубки являются новым, универсальный инструмент для изучения последствий полугибких полимеров, которые были ранее экспериментально недоступных9,27. Теперь различные теории могут быть экспериментально проверены, предполагающие составление заявлений о зависимости на сохранение длины lp нитей. Кроме того очень основные эффекты, такие как reptation (рис. 10), могут расследоваться с различных точек зрения путем использования трубок, которые отличаются в жесткости.

Имя Последовательность
U1: А1 *-b1 *-А2-В2 GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U1-Cy3: А1 *-b1 *-А2-В2 Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT
U2: a2 *-b2 *-a3-b3 GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT
U3: a3 *-b3 *-a4-b4 GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT
U4: a4 *-b4 *-А5-В5 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT
U5: a5 *-b5 *-a6-b6 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT
U6: a6 *-b6 *-a7-b7 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG
U7: a7 *-b7 *-a8-b8 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA
U8: a8 *-b8 *-a9-b9 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA
U9: a9 *-b9 *-a10-b10 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC
U10: a10 *-b10 *-a11-b11 TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT
U11: a11 *-b11 *-a12-b12 AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA
U12: a12 *-b12 *-a13-b13 ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA
U13: a13 *-b13 *-a14-b14 GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC
T4: a4 *-b4 *-А1-В1 GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T5: a5 *-b5 *-А1-В1 GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T6: a6 *-b6 *-А1-В1 GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T7: a7 *-b7 *-А1-В1 GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T8: a8 *-b8 *-А1-В1 TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T9: a8 *-b8 *-А1-В1 GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T10: a10 *-b10 *-А1-В1 GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
T14: a14 *-b14 *-А1-В1 TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT
торцевая заглушка А1 CCTAATCGCC
торцевая заглушка A2 CCTTTAGATCC
торцевая заглушка A3 CCACTCTTCC
торцевая заглушка A4 CCGTGAGAACC
торцевая заглушка A5 CCGCACGACC
торцевая заглушка A6 CCAACGATGCC
торцевая заглушка A7 ATGCACCTCC
торцевая заглушка A8 AACGGTAACTA
торцевая заглушка B1 * ACGCTAAGCCA
торцевая заглушка B2 * ACCAGATACA
торцевая заглушка B3 * ACAAGATGTCA
торцевая заглушка B4 * ACGCATTGCA
торцевая заглушка B5 * ACTGTCGAACA
торцевая заглушка B6 * ACTTCTATCA
торцевая заглушка B7 * CATTCAAAGCT
торцевая заглушка B8 * TCCCAAGTCA

Таблица 1: Пример ДНК последовательности для гибридизации nHTs, отображается в Рисунок 1 c, которые также были использованы в ходе предыдущих исследований на nHTs9, класс = «внешней» > 26,27,28. Данный набор последовательностей позволяет Ассамблее семи труб различных архитектур (например, a1 скрещивается с взаимодополняющими последовательности a1 *). Другие архитектуры трубки не дано здесь также может быть сформирован путем сложения или вычитания сопровождается согласно циклизация n прядь с U1пряди.

Figure 1
Рисунок 1: трубки Ассамблеи и архитектуры. (A) схема Ассамблеи 4HT формируется из четырех отдельных 42-РВК. Прилегающих одноцепочечной ДНК пряди гибридизируйте через непрерывное чередование доменов 10-11 баз, обозначается длинные черные клещей (короткие черные клещей указывают unhybridized баз). Этот мотив, половина шатаясь особенности липкие концы обеих сторон вдоль оси, позволяя осевой роста, изображается в виде стрелки. Стренги границы U1 и T4 также есть дополнительные домены и таким образом формируют закрытый кольцо, как указано стрелкой вправо. Обратите внимание, что этот эскиз 2D представление; в состоянии гибридизированные нитей образуют двойных спиралей и паре все базы. (B) Quasi-3D схема 4HT Тетрамер с двух двойных спиралей покрыты тенистой далеких слоя. Двойных спиралей форма для дополнительных доменов и связаны с обеих соседних двойных спиралей трубки один раз за единицу длины элемента. Однонитевой U2 рисуется толще для ясности. (C) семь различных трубки архитектуры приводятся примеры, с номерами прядь, начиная от 4 HT до 14 HT и lp от 1.2 до 26 мкм. (D и E) Epi люминесцентные изображения Cy3-помечены, адсорбированного 5 HT и 10 HT иллюстрируют различные жесткость через по-разному изогнутые контуры. Красной наложения является контур накаливания, нашли через анализ изображений, end-to-end расстояние R и контурная длина lC. Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: температура пандуса и соответствующей Ассамблеи ДНК нанотрубок. (A) нанотрубках ДНК собираются в Термоциклер через протокол, содержащий несколько отдельных температуры шаги над примерно 11 х. (B) в системы реального времени количественного PCR, относительное изменение флуоресцентного сигнала окрашенных нитей Это мера для вновь образованной двуцепочечной ДНК при переходе через рампу температуры. В зависимости от типа нанотрубках ДНК уровень Ассамблея может отличаться. Более сложные формирования структуры, чем шире Ассамблея, предположительно с больше нитей (и поэтому более сегментов с отдельных последовательностей и местной температуры нагрева при отжиге) нужно гибридизировать в соответствующих позициях, процесса, который управляется Стохастические термические флуктуации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель AFM изображение запутанной сети 8HTs на 4 µM. Высота профиля преформированных сети 8HTs всасывается с поверхности слюды был записан в режиме разговоров в воздухе. АСМ изображения визуализировать 2D проектирование сети, но не позволяют для надежного извлечения данных (например, размер сетки) для 3D случае так как трубы, а также сети сжаты в 2D конфигурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: линейный Диапазон. Штамм измерений (G' = 1 Гц) выявить широкий линейных упругих плато, без признаков сшивки эффектов, таких как нелинейного поведения, проявляется как штамм упрочнения. Выше характерные деформации (разные для каждого nHT) модуль упругости эластичного плато необратимо обрывается. Планки погрешностей представляют среднеквадратичное отклонение среднего значения всех выполненных измерений. Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: зависимость типичная частота сети запутанные 6HT. Сетей трубы ДНК показывают широкий эластичность плато над четырьмя порядков, в зависимости от прикладной частоты. Как ожидается, полимерные сети, эластичная часть (G') комплекс сдвига модуль значительно выше, чем в вязкой части (G''). Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Не жидкость воздуха интерфейс эффекты. Частоты зачисток (f-зачисток; γ = 5%) из 8HT образцы на 8 мкм показали, что влияние испарения и гелеобразования эффектов на воздух вода интерфейс, незначительным. Использовались различные уравновешивания раз, а также два метода, известно, резко уменьшить кластеризации на интерфейс (ПАВ и липиды), белка. Независимо от метода, никаких признаков резкое влияниям испарения или поверхности эластичности были записаны. Здесь, G' представляет собой модуль упругости и G'' представляет модуль вязкой (пунктирные линии). Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: никакого влияния конца модификации. Модуль упругости эластичного плато остается неизменным при укупорки липкие свободные концы 8HTs с их соответствующих дополнительных последовательностей. Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: влияние процедур обработки предварительно ДНК сетей на измерении. В зависимости от того, как предварительно сетей обрабатываются после гибридизации размеры могут отличаться. В этом примере была резко менялся сдвига потока во время закупорить ДНК нанотрубок, и трубы сломал если обрабатывается слишком грубо. Обрыв приводит к нежелательных взаимодействий между подвергаются, взаимодополняющих сингл пряди, соотнося сломанные или разорванные сегментов, которые приводит к увеличению эластичности и индуцирует нелинейные эффекты, sуч как напрягать закалочные (Увеличение упругости для больших штаммов, зеленая кривая). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9: Нанотрубках ДНК включить изучение lp зависимостей. (A) изучение сетей полугибких полимеров с nHTs позволяет исследование механических реакции системы с увеличением концентрации (концентрация развертки), аналогичные исследования на основе биополимеров например актина. (B) Кроме того, различные архитектуры трубы упрощения определения механических ответа в отношении различных lp основных нитей, который является практически неосуществимым с естественным полугибких полимеров. Для этой цели является replotted данные из A решения масштабирование упругой плато модуль связи lp. Планки погрешностей представляют среднеквадратичное отклонение среднего значения всех выполненных измерений. Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 10
Рисунок 10: размер сетки и Reptation. Запись изображения флуоресценции reptating нитей (однокомпонентным ДНК 8HT встроенных в сетевой непомеченного; c = 14 мкм) может использоваться для проверки запутанный характер нитей в сети. Любые эффекты сшивки будет препятствовать этой одномерный диффузии. Вставка: Reptation анализ может использоваться для определения размера ячеи, масштабирование с концентрациями, который сравнивает хорошо актина измерений и соглашается с Теоретические предсказания30. Планки погрешностей представляют среднеквадратичное отклонение среднего значения всех выполненных измерений. Адаптировано из Шульдт et al9рис. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы получить правильно сформированные сетей, монтаж нанотрубках ДНК представляет собой решающий шаг. Ошибки во время процесса синтеза отрицательно влияют на качество трубки; Поэтому рекомендуется использовать для очистки олигонуклеотиды ВЭЖХ или более строгий процесс. Поскольку формирование дискретных вместо агрегированных нанотрубках ДНК, а также их распределение длины зависит эквимолярных стехиометрии составляющих олигонуклеотиды n в наборе, необходимо повторно измерить концентрации приобретенные нитей с учетом значения может значительно варьироваться от фактической концентрации. Это может осуществляться, например, спектроскопия UV-Vis на длине волны поглощения 260 Нм. Мы хотели бы отметить, что молекулярным весом и коэффициентами вымирания варьируются между различными последовательностями; Таким образом значения перевести поглощения в концентрации должны определяться для каждого ДНК олигонуклеотида. При использовании оборудования, оптимизированный для небольшой образец тома, такие как NanoDrop, каждая точка измерения следует несколько раз и в среднем. Соответствовать Линейная дальность обнаружения спектрометра. Разбавьте фракция используется для определения концентрации при необходимости. Незначительные неточности могут иметь большое влияние на правильный стехиометрии и качества формирования трубки; Таким образом закупорить одиночные стренги должны быть как можно точнее. Впоследствии последний пример решения следует тщательно перемешивают, медленно закупорить образец вверх и вниз перед его размещением в Термоциклер. Если нити были изменены с флуоресцентными красителями для визуализации, все действия должны выполняться в среде, защищены от прямого света и позднее добавление установленных анти Отбеливание агентов (т.е., кислородной очистки систем, таких как глюкоза оксидаза/каталаза) рекомендуется. После того, как одиночные стренги смешались в условиях буфера правая, температура пандуса применяется к Гибридизировать структур (рисунок 2A). Этот шаблон температуры ниже ранее определенных критических гибридизации температуры, где ДНК двойной форме спиралей. Несколько методов были разработаны для анализа ДНК гибридизации кинетика (т.е., родной поглощения ДНК УФ31, калориметрии32или33флуоресцентных красителей). В последний метод красители вставлять в двойных спиралей ДНК, образуя высоко Флуоресцентные комплексы ярче, чем несвязанных красители. Они частично связывают двунитевая но не одноцепочечной ДНК34. Таким образом такие краски применяются для мониторинга ДНК наноструктур для самостоятельной сборки в системе35 и может использоваться для определения условий идеально Ассамблеи.

Первоначально любой double-stranded дна в образце, таких как предопределенные и непредсказуемые дуплексы, денатурированы при высокой температуре (90 ° C), чтобы избежать непреднамеренного низкопробный спаривать. Последующее постепенное снижение температуры (аналогично рис. 2A) уменьшает теплового движения нити ДНК, включение базовых кожура событий. Благодаря минимизации свободной энергии нити ДНК гибридизируйте преференциально на их взаимодополняющих последовательностей. Когда применяется dsDNA конкретных интеркалирующего краситель, яркость увеличивается с образованием весьма Флуоресцентные комплексы, который, в свою очередь количественная мера для вновь образованной двуцепочечной ДНК34. Относительное изменение флуоресценции сигнала для формирования 4HTs и 8HTs построены на рисунке 2B. Это относительное изменение рассчитывается путем усреднения интенсивности флуоресценции для каждой температуры и впоследствии вычитания среднее значение предыдущих температуры. С понижением температуры, может быть повышенный флуоресценции обнаружения (рис. 2B), и пик этой кривой освещаются температуры, где происходят массовые скрещиваний. Капля кривых относится к интенсивности значения достижения плато. В зависимости от конструкции ДНК и его сложности (например, когда маленький или большой набор ДНК пряди) пик может быть Шарп (Рисунок 2Б, синяя кривая) или широкой (Рисунок 2Б, зелёная кривая). Когда это возможно, это должны быть проверены на каждый вновь разработанной структуры для обеспечения что постепенно снижение часть пандуса температуры содержит диапазон, где происходит формирование трубы через формирование гибридизированные dsDNA сегментов. После соответствующей температуры определяется режим, наноструктуры могут быть успешно собраны в очень узком температурные диапазоны (Рисунок 2Б, синяя кривая), или даже isothermally35. Обратите внимание, что гибридизации ДНК нескольких нитей в периодических решетки индуцирует кооперативного отжига эффекты35,36, которые поддерживают дальнейшее ДНК отжига. Следует считать, что интеркалирующего красители растянуть спиралей ДНК за пределами их стандартных 10.5 низкопробных пар на винтовой поворот конфигурации, таким образом изменяя общую геометрии труб. Таким образом это не рекомендуется для повышения концентрации красителя над одной молекулы за 900 пар оснований ДНК35. Кроме того Ассамблея температура пика может отличаться от фактической оптимальной температуры отжига. Для достижения высокой точности и определить лучшие условия для формирования трубки, гибридизация ДНК должны расследоваться во многих медленно меняющихся температуры шаги, которые должны быть проверкой с электрофорезом геля агарозы. В случае нанотрубках ДНК мы создали три шага протокол. Во-первых образец нагревается до 90 ° C для денатурировать ДНК в одиночных стренги. Впоследствии рассматривается в широком диапазоне температур (вокруг Ассамблея пика флуоресценции сигнала). В нашем случае рассматривается целый ряд 10 ° C, от 65 ° C до 55 ° C, с шагом -0.5 ° C каждые 30 мин. На последнем шаге температура должна быстро падение при комнатной температуре - или, как в нашем случае, 20 ° C - для предотвращения каких-либо неблагоприятных взаимодействий на промежуточных температурах (рисунок 2A). Обычно thermocyclers тепло образцы из холодных температур. Таким образом важно отрегулировать температуру крышки соответственно ограничить испарения жидкости в примере во время Ассамблеи, которая увеличивает концентрацию окончательной выборки.

Если nHTs образуются надлежащим образом, они организуют в чисто запутанной сети (рис. 3), без взаимодействия, вызывая эффекты сшивки между отдельных труб. Сшивки предположительно приведет непарных сегментов ДНК, простирающейся от дефектов вдоль трубки или липкие концы, которые бы свободно в паре с взаимодополняющими одноцепочечной сегментов на соседних трубы. Эти эффекты будут побуждать нелинейные свойства, такие как деформации упрочнение (увеличение G' для больших штаммы), но они отсутствуют в запутанных сетей (рис. 4). Отображается γ-зачисток также выявить соответствующие линейной деформации режимов для реологической измерений в целом. Выше определенного порога сеть разрывов или теряет контакт с пластины Реометр, которое необратимо повреждает системы. Таким образом прикладной штаммов должно быть в линейный режим для получения надежных данных. Как правило штамм 5% достаточно дают данные значительно выше режима шум. Выше штаммы могут быть применены; Однако они легко подойти к разрыву порог, и результаты могут быть falsifiЭд связи измерения нелинейных режима.

Реологические измерений требуют тщательного и последовательного подготовки образца и тщательно рассмотрены протоколы измерений для получения воспроизводимых и интерпретации результатов. Центральная точка заключается в создании абсолютно случайные, изотропным сети между пластины Реометр поскольку эти сети являются главным образом только воспроизводимые структуры. Таким образом довольно долго уравновешивания раз (обычно около 2 ч, иногда даже больше) необходимы для разгона любого заказа эффекты, которые происходят из-за сдвига индуцированной выравнивания во время закупорить образца. Перед тестированием эксперименты рекомендуются для записи время эволюция (время развертки) системы во время уравновешивания для того, чтобы определить необходимые сроки. Как только сигналы достигают плато без дальнейших изменений, является достижение равновесного уровня системы. После уравновешивания определены условия, желаемого тестов, таких как штамм пандус или f - или γ-зачисток, может быть выполнен. Тестирование широкий спектр штаммов может в конечном итоге уничтожить в сети или подключение к пластинам. Однако если тесты ограничиваются штаммов ниже порога разрыв, штамм рампы и отчётами может многократно повторяться расследовать потенциальные эффекты старения или гистерезис. В случае f-зачисток, измерение раз может значительно варьироваться. Тестирование низких частот значительно продлевает эксперименты, поскольку одно колебание может занять несколько минут. Обратите внимание, что в случае nHTs, f-отчёты показывают, что упругости G' превышает вязкой модуль G'' примерно один порядок, который иллюстрирует преобладающим упругой реакцию этих систем ( Рисунок 5). Как правило, различные типы экспериментов может сопровождаться короткие f-зачисток до и после основной эксперимент, чтобы убедиться, что система остается undisturbed измерения, сам. Однако, некоторые машины должны изменить базовый мотор режим для различных типов измерений, особенно при переходе от динамических экспериментов (например, колебаний для f-зачисток) нарастить статическое напряжение. Это изменение часто сопровождаются спонтанной большой штаммов разрушение сети и закалка последующих измерений. Таким образом рекомендуется проверить спецификации Реометр используется.

Реология эксперименты на системах на базе актина выявить драматический эффект денатурации белков, происходящих на воздух вода интерфейс системы. Денатурированные белки придерживаться содержанием друг друга, тем самым образуя плотный гель, который может сильно доминировать на механические свойства всей системы. Для предотвращения прямого контакта образца с окружающим воздухом, могут использоваться методы пассивирование, которые также подавить испарения воды содержание образца. Три потенциальных методов являются: (i) вокруг камеры образец с же буфера, как показано в примере; (ii) использование ПАВ для покрытия интерфейс из-за их гидрофобных и гидрофильных доменов (необходимо соблюдать осторожность, так как некоторые ПАВ вмешиваться с полимерной конформации); или (iii) занято более биологически совместимый липиды, с аналогичными эффектами как ПАВ. Следует отметить, что nHTs не были найдены подвергаются денатурации эффекты на уровне интерфейса, и результаты не зависят от метода пассивации (рис. 6), который устраняет крупным потенциальным источником ошибки. Как правило образец палата всегда должны быть запечатаны с крышкой, которая может быть оснащен влажной губки увеличить влажность в камере, подавляя испарения.

Как кратко описано ранее, потенциальный источник ошибок в системах на основе ДНК unhybridized ДНК, например непарные одноцепочечной ДНК свесы на дефекты или на концах нанотрубок, который может вызвать дополнительные сшивки эффекты. Для расследования и/или ликвидировать эту возможность, дополнительные короткие нити может использоваться для ограничения этих липкие концы. Однако наши собственные исследования показали, что добавление укупорки пряди не влияет на введено nHTs и поведение запутанных сетей остался неизменным (рис. 7). Однако укупорочные липкие концы с взаимодополняющими последовательностей может быть полезным для других систем на основе ДНК (и более сложных) для подавления нежелательных взаимодействий. Кроме того, следует тщательно накапаны образцы nHTs (например, для разбавления шаги и подготовки проб) для предотвращения любого нарушения или другие повреждения трубок. Если накапаны решение слишком грубо, трубы перерыв бесконтрольно, разоблачение большое количество липкие концы точках дефекта, приводит к нежелательным взаимодействия среди потенциальных сшивки и труб в системе. Это мешает сигнала и приводит к жесткости эффекты, а также нелинейные эффекты, такие как деформации упрочнение, который становится видимым в γ-зачисток (рис. 8). Таким образом, дозирование, запутанные решение должно быть сделано только медленно и с помощью наконечники с довольно большого диаметра (резка конце кончика пипетки рекомендуется) для уменьшения сдвига силы на трубы.

В заключение nHTs ДНК являются модель подходит и очень гибкой системы для изучения полугибких полимеров и сыпучие сети формируются из этих нитей, представляющий новый класс механически перестраиваемый гидрогелей. Если трубы готовы тщательно, они может использоваться для проверки влияния lp нитей в различных случаях. Измерение сыпучих реологических запутанных сетей, например, показывает, что теоретически предсказанных зависимостей упругости с концентрацией и lp несовместимы с экспериментально производных масштабирования законы (рис. 9)9. Это исследование подчеркивает, что эластичность сети может быть увеличена путем увеличения жесткости базовых полимеров. Традиционно увеличение жесткости гидрогеля была достигнута, добавляя больше полимеров в решение или вызывая сшивки (физический или химический) между соседними полимеров37,38. Однако более высокое содержание молекулярного также связан с сокращением сетка размер, который может ограничить приложения, такие как 3D клеточной культуры. Сшивки, с другой стороны, могут вызвать сложный морфологические изменения в пределах базовой архитектуры сети, что еще больше усложняет точное Тюнинг механических свойств39. Использование сетей nHTs, однако, позволяет для полного разделения этих параметров, whereby жесткости эффектов может быть вызвана исключительно изменения жесткости основной нити, в то время как размер ячеи неизменным. Кроме того трубки архитектуры могут быть специально изменены для выборочно интегрировать дополнительные эффекты, такие как сшивки, который, аналогично в запутанных сетей, создает дополнительные возможности для экспериментально проверить теоретические прогнозы для параметры, такие какl p или crosslink размер и прочность для сетей. В общем, программируемые архитектура расширяет сферу приложения, позволяя для изучения lp-зависимых эффектов не только оптом, но и на уровне одной молекулы. Помечены трубы может быть встроен в сети для изучения, например, зависимостьp lна одномерном движение нити в ламповую заключения, обычно называют reptation (рис. 10)9. Если это диффузионное движение является видимым, он также проверяет запутанный характер сети, поскольку он будет подавлено сшивки эффектов. Анализируя динамику базового также показывает размер сети. Кроме того эти трубы может использоваться для изучения зависимости жесткости и хиральности основной трубы на формирование пачки40,41,,4243, 44 , 45 или более высокого порядка структуры, такие как звезда как астры46,47,48,49,50, который может быть наведено сшивки эффекты или через молекулярно переполненном среды27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы признаем, финансирование DFG (1116/17-1) и Лейпциг школа естественных наук «BuildMoNa» (GSC 185). Эта работа оказывалась через Fraunhofer привлечь проекта 601 683. Т. ч. признает финансирование из Европейского социального фонда (ЕСФ-100077106).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM cantilever ACTA AppNano
AFM - NanoWizard 3 JPK Instruments
CCD camera Andor iXon DV887
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DNA oligonucleotides Biomers.net For sequences see Table 1
DNA Cy3-labeled oligonucleotides Biomers.net For sequence see Table 1
EDTA Sigma-Aldrich E-9884
Epi-fluorescence micro-scope Leica DM-IRB
MgCl2 Sigma-Aldrich M-8266
Mica "V1", 12 mm round Plano GmbH 50-12
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific Inc. 4346907
MicroAmp® Optical Adhesive Film Thermo Fisher Scientific Inc. 4306311
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Inc.
100x objective Leica5 506168
Purified water Merk Millipore - Milli-Q & Elix
Sapphire PCR tubes Greiner Bio-One 683271
TProfessional Standard PCR Thermocycler Core Life Sciences Inc. 070- Standard
7900HT Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems 4351405
Rheometer TA Instruments ARES
SYBR® Green I nucleic acid gel stain Thermo Fisher Scientific Inc. S7567
Tris Sigma-Aldrich T4661
Triton X-100 Sigma-Aldrich Co. X-100 Suppresses evaporation of sample at air-water interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
  2. Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
  3. Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y. The Statistical Mechanical Theory of Stiff Chains. J Phys Soc Jpn. 22 (1), 219-226 (1967).
  4. Doi, M., Edwards, S. F. The Theory of Polymer Dynamics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1986).
  5. Mueller, O., Gaub, H. E., Baermann, M., Sackmann, E. Viscoelastic moduli of sterically and chemically cross-linked actin networks in the dilute to semidilute regime: measurements by oscillating disk rheometer. Macromolecules. 24 (11), 3111-3120 (1991).
  6. MacKintosh, F. C., Käs, J., Janmey, P. A. Elasticity of semiflexible biopolymer networks. Phys Rev Lett. 75 (24), 4425-4428 (1995).
  7. Gardel, M. L. Elastic Behavior of Cross-Linked and Bundled Actin Networks. Science. 304 (5675), 1301-1305 (2004).
  8. Sonn-Segev, A., Bernheim-Groswasser, A., Diamant, H., Roichman, Y. Viscoelastic Response of a Complex Fluid at Intermediate Distances. Phys Rev Lett. 112 (8), (2014).
  9. Schuldt, C., et al. Tuning Synthetic Semiflexible Networks by Bending Stiffness. Phys Rev Lett. 117 (19), (2016).
  10. Käs, J., et al. F-actin, a model polymer for semiflexible chains in dilute, semidilute, and liquid crystalline solutions. Biophys J. 70 (2), 609-625 (1996).
  11. Ross-Murphy, S. B. Structure-property relationships in food biopolymer gels and solutions. J Rheol. 39 (6), 1451-1463 (1995).
  12. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  13. Hinner, B., Tempel, M., Sackmann, E., Kroy, K., Frey, E. Entanglement, Elasticity, and Viscous Relaxation of Actin Solutions. Phys Rev Lett. 81 (12), 2614-2617 (1998).
  14. Palmer, A., Mason, T. G., Xu, J., Kuo, S. C., Wirtz, D. Diffusing Wave Spectroscopy Microrheology of Actin Filament Networks. Biophys J. 76 (2), 1063-1071 (1999).
  15. Gardel, M. L., Valentine, M. T., Crocker, J. C., Bausch, A. R., Weitz, D. A. Microrheology of Entangled F-Actin Solutions. Phys Rev Lett. 91 (15), (2003).
  16. Liu, J., et al. Microrheology Probes Length Scale Dependent Rheology. Phys Rev Lett. 96 (11), (2006).
  17. Golde, T., Schuldt, C., Schnauß, J., Strehle, D., Glaser, M., Käs, J. Fluorescent beads disintegrate actin networks. Phys Rev E. 88 (4), (2013).
  18. Isambert, H., Maggs, A. C. Dynamics and Rheology of Actin Solutions. Macromolecules. 29 (3), 1036-1040 (1996).
  19. Käs, J., Strey, H., Sackmann, E. Direct imaging of reptation for semiflexible actin filaments. Nature. 368 (6468), 226-229 (1994).
  20. Schmidt, C. F., Baermann, M., Isenberg, G., Sackmann, E. Chain dynamics, mesh size, and diffusive transport in networks of polymerized actin: a quasielastic light scattering and microfluorescence study. Macromolecules. 22 (9), 3638-3649 (1989).
  21. Kroy, K., Frey, E. Force-Extension Relation and Plateau Modulus for Wormlike Chains. Phys Rev Lett. 77 (2), 306-309 (1996).
  22. Morse, D. C. Tube diameter in tightly entangled solutions of semiflexible polymers. Phys Rev E. 63 (3), (2001).
  23. Broedersz, C. P., MacKintosh, F. C. Modeling semiflexible polymer networks. Rev Mod Phys. 86 (3), 995-1036 (2014).
  24. Tassieri, M., Evans, R. M. L., Barbu-Tudoran, L., Khaname, G. N., Trinick, J., Waigh, T. A. Dynamics of Semiflexible Polymer Solutions in the Highly Entangled Regime. Phys Rev Lett. 101 (19), (2008).
  25. Hinsch, H., Frey, E. Non-Affine Shear Modulus in Entangled Networks of Semiflexible Polymers. arXiv:0907.1875[cond-mat]. , Available from: https://arxiv.org/abs/0907.1875 (2009).
  26. Yin, P., et al. Programming DNA Tube Circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  27. Glaser, M., et al. Self-assembly of hierarchically ordered structures in DNA nanotube systems. New J Phys. 18 (5), 055001 (2016).
  28. Schiffels, D., Liedl, T., Fygenson, D. K. Nanoscale Structure and Microscale Stiffness of DNA Nanotubes. ACS Nano. 7 (8), 6700-6710 (2013).
  29. Hariadi, R. F., Yurke, B., Winfree, E. Thermodynamics and kinetics of DNA nanotube polymerization from single-filament measurements. Chem Sci. 6 (4), 2252-2267 (2015).
  30. de Gennes, P. G. Reptation of a Polymer Chain in the Presence of Fixed Obstacles. J Chem Phys. 55 (2), 572-579 (1971).
  31. Huss, V. A. R., Festl, H., Schleifer, K. H. Studies on the spectrophotometric determination of DNA hybridization from renaturation rates. Syst Appl Microbio. 4 (2), 184-192 (1983).
  32. Breslauer, K. J., Frank, R., Blöcker, H., Marky, L. A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (11), 3746-3750 (1986).
  33. You, Y., Tataurov, A. V., Owczarzy, R. Measuring thermodynamic details of DNA hybridization using fluorescence. Biopolymers. 95 (7), 472-486 (2011).
  34. Zipper, H. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103-e103 (2004).
  35. Sobczak, J. -P. J., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid Folding of DNA into Nanoscale Shapes at Constant Temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
  36. Snodin, B. E. K., Romano, F., Rovigatti, L., Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami. ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).
  37. Das, R. K., Gocheva, V., Hammink, R., Zouani, O. F., Rowan, A. E. Stress-stiffening-mediated stem-cell commitment switch in soft responsive hydrogels. Nat Mater. 15 (3), 318-325 (2015).
  38. Sharma, A., et al. Strain-controlled criticality governs the nonlinear mechanics of fibre networks. Nat Phys. 12 (6), 584-587 (2016).
  39. Lieleg, O., Claessens, M. M. A. E., Bausch, A. R. Structure and dynamics of cross-linked actin networks. Soft Matter. 6 (2), 218-225 (2010).
  40. Claessens, M. M. A. E., Semmrich, C., Ramos, L., Bausch, A. R. Helical twist controls the thickness of F-actin bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8819-8822 (2008).
  41. Claessens, M. M. A. E., Bathe, M., Frey, E., Bausch, A. R. Actin-binding proteins sensitively mediate F-actin bundle stiffness. Nat Mater. 5 (9), 748-753 (2006).
  42. Schnauß, J., Händler, T., Käs, J. Semiflexible Biopolymers in Bundled Arrangements. Polymers. 8 (8), 274 (2016).
  43. Heussinger, C., Schüller, F., Frey, E. Statics and dynamics of the wormlike bundle model. Phys Rev E. 81 (2), (2010).
  44. Schnauß, J., et al. Transition from a Linear to a Harmonic Potential in Collective Dynamics of a Multifilament Actin Bundle. Phys Rev Lett. 116 (10), (2016).
  45. Strehle, D., et al. Transiently crosslinked F-actin bundles. Eur Biophys J. 40 (1), 93-101 (2011).
  46. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: dynamics of patterning and self-organization. Phys Biol. 3 (4), 264-273 (2006).
  47. Surrey, T. Physical Properties Determining Self-Organization of Motors and Microtubules. Science. 292 (5519), 1167-1171 (2001).
  48. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  49. Smith, D., et al. Molecular Motor-Induced Instabilities and Cross Linkers Determine Biopolymer Organization. Biophys J. 93 (12), 4445-4452 (2007).
  50. Huber, F., Strehle, D., Schnauß, J., Käs, J. Formation of regularly spaced networks as a general feature of actin bundle condensation by entropic forces. New J Phys. 17 (4), 043029 (2015).

Tags

Биоинженерия выпуск 128 реология полугибких полимеров сохранение длина ДНК трубы биополимеры актина гидрогеля сети
Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnauß, J., Glaser, M.,… More

Schnauß, J., Glaser, M., Lorenz, J. S., Schuldt, C., Möser, C., Sajfutdinow, M., Händler, T., Käs, J. A., Smith, D. M. DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers. J. Vis. Exp. (128), e56056, doi:10.3791/56056 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter