Summary
Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.
Abstract
Propriedades mecânicas da matéria mole complexa, à base de polímero, tais como células ou redes de biopolímero, podem ser entendidas em nem o quadro clássico de polímeros flexíveis nem de hastes rígidas. Filamentos subjacentes permanecem estendidos devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo, que é quantificada através do comprimento de persistência (l.p), mas eles também estão sujeitos a fortes flutuações térmicas. Sua rigidez de flexão finito leva a mecânica coletiva única, não-trivial de redes em massa, permitindo a formação de andaimes estáveis em frações de baixo volume, proporcionando grande malha tamanhos. Este princípio subjacente é prevalente na natureza (por exemplo, em células ou tecidos), minimizando o alto teor molecular e facilitando difusiva ou transporte ativo. Devido a suas implicações biológicas e potenciais aplicações tecnológicas em hidrogel biocompatível, semiflexível polímeros têm sido objecto de estudo considerável. No entanto, investigações compreensíveis permaneceram desafiadoras desde que eles dependiam de polímeros naturais, tais como os filamentos de actina, que não são livremente ajustáveis. Apesar dessas limitações e devido à falta de polímeros sintéticos, mecanicamente ajustáveis e semiflexível, filamentos de actina estabeleceram-se como sistema comum de modelo. Uma grande limitação é que a quantidade central lp não pode ser livremente ajustado para estudar seu impacto nas estruturas macroscópicas em massa. Esta limitação foi resolvida empregando estruturalmente programáveis nanotubos de DNA, permitindo a alteração controlada de rigidez do filamento. Eles são formados por projetos baseados em azulejo, onde um conjunto discreto de costas parcialmente complementares cruzar em uma estrutura em anel com uma circunferência discreta. Estes anéis apresentam extremidades pegajosas, permitindo a efetiva polimerização em filamentos vários microns de comprimento e exibir semelhante cinética de polimerização como biopolímeros naturais. Devido à sua mecânica programável, estes tubos são ferramentas versátil, a novela para estudar o impacto da lp a único-molécula, bem como a escala em massa. Em contraste com os filamentos de actina, eles permanecem estáveis durante semanas, sem degeneração notável, e sua manipulação é comparativamente simples.
Introduction
Devido os comportamentos complexos habilitados por suas propriedades mecânicas únicas, semiflexível polímeros são blocos de construção fundamentais da matéria viva. Em contraste com polímeros flexíveis, polímeros semiflexível adotam uma configuração estendida devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo enquanto ainda permanecem sujeitas a fortes flutuações térmicas1. Assim, modelos estocásticos puramente não podem ser aplicados a seus comportamentos, como com os extremos de polímeros totalmente flexíveis ou rígidos. A cadeia de tipo worm chamado modelo2,3,4 foi desenvolvido para quantificar essa rigidez através a lp, que é a constante de decaimento da correlação tangente-tangente ao longo do filamento de4. Se lp é comparável ao comprimento de contorno (l.c) do filamento, o polímero é considerado semiflexível1. Análogo aos polos de uma tenda, seus arranjos em redes ou feixes estabiliza todo o sistema coletivo em frações de baixo volume, levando a incomum viscoelástico propriedades5,6,7, 8,9. Essas estruturas fornecem altas elasticidades em grande malha tamanhos10, mantendo a integridade mecânica enquanto ainda facilitando difusiva e processos de transporte ativo. Esta propriedade é especialmente indicada para sistemas biológicos, tais como o citoesqueleto ou a matriz extracelular, mas é também amplamente utilizado na engenharia de alimentos1,11,12.
Indo além da sua importância com a matéria viva, é fundamental examinar exaustivamente as propriedades físicas destas estruturas a fim de ter as ferramentas para desenvolver materiais biomimético ou hidrogel romance. Em termos de polímeros semiflexível, isto implica a determinação sistemática das propriedades coletivas de redes resultantes de filamento único propriedades como lp e o desenvolvimento de um quadro teórico descritivo. Em estudos pioneiros, a actina biopolímero celular foi estabelecida como um sistema modelo para polímeros semiflexível e é ainda considerada o padrão-ouro5,13,14,15 , 16 , 17. no entanto, estudos exaustivos são limitados com este sistema, desde que eles são obrigados às propriedades inerentes desta proteína. Diversas abordagens teóricas têm visa construir uma descrição dos comportamentos não-trivial mecânicas a nível de filamento único e conduziram a notavelmente diferentes previsões dimensionamento para a dependência o módulo de cisalhamento do planalto elástica linear, G de 0 (ou seja, a "elasticidade" da rede), no que diz respeito a concentração (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Enquanto o dimensionamento de concentração é prontamente acessível em experimentos com actina-based ou outros sistemas modelo e enquanto predições teóricas têm sido rigorosamente verificados13,16,24, 25, o dimensionamento em relação ao lp manteve-se experimentalmente inacessível. Isto, porém, é uma limitação principal desde lp também é uma variável independente que é a definição quantidade de polímeros semiflexível.
Esta central, natural limitação imposta pelo fixo lp de actina ou outros polímeros derivados biologicamente como colágeno recentemente foi resolvida empregando tubos telha-baseado de DNA, que são ajustáveis em suas propriedades mecânicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeiras variações nas arquiteturas dos tubos (por exemplo, números diferentes do DNA constituinte vertentes dentro do anel de unidade) produzem valores distintos para lp, que pode ser avaliada através de microscopia de fluorescência, analisando um tubo flutuante ou avaliando as configurações curvas de vários tubos aderidas, como descrito anteriormente9,28. Essas análises revelaram que valores dep ldas populações diferentes de tubo variam ao longo de mais de uma ordem de magnitude e que técnicas de avaliação diferentes produzem resultados consistentes9,28.
Surpreendentemente, a escala global do planalto elástica linear cisalhamento módulo G0 em relação à concentração e lp foi relatada para ser inconsistente com todas as abordagens teóricas anteriores 9, em particular, demonstrando um muito mais forte do que o previsto dependência lp. Esses achados enfatizam o valor de um novo sistema de modelo para estudar as propriedades centrais de polímeros semiflexível. Empregando n-tubos de DNA de hélice dramaticamente amplia o escopo destas investigações. Não só pode lp ser variado livremente sem alterar o material básico, mas a natureza inerente programável do DNA pode permitir o exame sistemático dos elementos adicionais, tais como as referências cruzadas ou processos cinéticos de comutação. Além disso, estes tubos são solúveis em água e, em contraste com a maioria das proteínas, estável em pH adequado e condições iônicas por várias semanas, sem degradação detectável9.
Para montar estes tubos, é utilizado um conjunto de oligonucleotídeos de DNA, cada uma das quais contém dois domínios que compartilham sequências base complementares às duas vertentes vizinhas (devido as sequências específicas, um único fio não pode formar estruturas como pinos de cabelo). As sequências complementares cruzam de forma cíclica, formando anéis fechados, metade-sobreposição de dupla-hélice segmentos n interligados (figura 1A e B). Estes formam anéis em um discreta de diâmetro (Figura 1) e sua configuração de meia-sobreposição expõe axiais extremidades pegajosas complementares às extremidades pegajosas de outro anel. Esta adição seletiva de correspondência oligonucleotides desencadeia um empilhamento dos anéis, levando à polimerização eficaz de filamentosas tubos de hélice de DNA de tamanho n (n-HT). Seus comprimentos contornos tipicamente medem vários microns de comprimento, e sua distribuição de comprimento é comparável de actina filamentos9,26,,27,28. Tem sido demonstrado para nanotubos de DNA semelhantes que eles de fato apresentam cinética de polimerização semelhante dos microtúbulos e filamentos de actina
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Protocol
1. preparação de n HTs
Nota: aqui, n denota o número de diferentes cadeias de DNA simples envolvidos na formação dos tubos de um determinado tamanho de hélice. Para n = 8, oito diferentes cadeias de DNA simples compõem um anel unidade.
- Sequências de DNA de compra (grau de pureza HPLC ou superior) de uma síntese de DNA adequada para o serviço ou realizar a síntese de alta qualidade e purificação (sequências exemplares indicadas na tabela 1).
- Oligonucleotides Ressuspender liofilizado em água purificada e siga a ressuspensão mais passos indicados no manual correspondente da companhia. Ajustar a quantidade de água para obter uma concentração final de 200 µM.
- Determinar concentrações do DNA único vertentes para verificar os valores indicados pelo distribuidor (por exemplo, através de espectroscopia de UV-Vis em 260 nm) desde a estequiometria exata é crucial para o processo de montagem. Calcular a concentração dos oligonucleotides, tendo em conta o peso específico molar e coeficiente de extinção para cada single-stranded do oligonucleotide de DNA.
Nota: Os valores do coeficiente de extinção inerentemente variam para as sequências diferentes e são demonstrados na documentação do DNA adquirido comercialmente. Eles também podem ser calculados de acordo com o modelo de vizinho mais próximo, usando uma série de ferramentas on-line disponíveis gratuitamente. Para garantir a conformidade com a escala linear do espectrómetro, considerar-se diluir a amostra utilizada para determinação de concentração. - Utilizando uma micropipeta, misturar o DNA vertentes-cada na mesma concentração-em um recipiente apropriado para o thermocycler (por exemplo, um tubo PCR de 200 µ l) formar o desejado n HTs (condições de buffer final: 1xTE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH 8) e 12.5 mM MgCl 2).
Nota: Amostras de DNA Final n HT consistem em n - 1 fios, U 1 − U n − 1 e um fio de n T. A concentração por fio pode variar de sub-micromolar para mais de 10 µM, dependendo das necessidades do usuário (por exemplo, < 1 µm por vertente para a diluição subsequente observar filamentos simples ou concentrações mais elevadas para o exame de mecânica de rede densa). - Cruzar o n HTs em um thermocycler (desnaturação por 10 min a 90 ° C, com uma queda rápida subsequente a 65 ° C; temperatura lenta diminuição de 65 ° C a 55 ° C, com emparelhamento base complementar em 20 passos de temperatura de-0,50 K por 30 min cada; e uma rápida queda de 55 ° C a 20 ° C); Ver Figura 2A.
Nota: Os passos de diminuição lenta de 65 ° C podem ser alongados para aumentar o comprimento médio do tubo; no entanto, a subsequente queda rápida a 20 ° C é fundamental para evitar a agregação dos tubos polimerizados. - Armazenar o hibridizadas n HTs por até 3 semanas a 4 ° C, sem degradação detectável.
Nota: Para fluorescência microscopia, rotulada n HTs são hibridizados substituindo (parcialmente) U1 com o U1-Cy3 modificado (tabela 1). Para tempos mais longos de observação, a adição de agentes antibranqueamento estabelecidas é aconselhável. - Cuidadosamente diluir a amostra para a concentração final desejada (por exemplo, 4 µM para redes ou 20 nM para observações de filamento único) usando o buffer de amostra, se necessário. Para minimizar as fontes de erro possível, montar amostras na concentração final desejada.
2. Reologia de cisalhamento
geometria- escolher um apropriado (placa-placa ou cone-placa) para o rheometer cisalhamento dinâmico. Para volumes pequenos (ou seja, abaixo de 200 µ l), use a geometria cone-placa.
- Carregar a amostra sobre o cisalhamento dinâmico rheometer.
- Passivate interface ar-água da amostra e do ambiente, usando as seguintes etapas para evitar os efeitos de evaporação potencial.
- Cercam a amostra com 2,5 mL do banho de tampão de amostra.
- Adicionar um surfactante apenas abaixo da concentração micelle.
- Usar uma seringa Hamilton para cercar a amostra com um lipídio para evitar contato direto da amostra com ar.
- Selar a câmara de amostra com um boné equipado com esponjas molhadas e, se possível, com um banho de água adicionais (não em contato com a amostra) para mais suprimir evaporação.
- Iniciar a medição usando o software de rheometer específicos à temperatura ambiente; em alternativa, realizar a medição em temperaturas diferentes, tais como a 37 ° C (se são necessárias condições fisiológicas).
Nota: Refrigerar a amostra é muitas vezes acompanhada pela condensação do vapor de água do ar circundante, enquanto o aquecimento leva a maior evaporação. Ambos os efeitos incontrolavelmente podem alterar a concentração da amostra, para que todas as medições em uma série devem ser executadas a uma temperatura constante. - Permitir a amostra equilibrar para 2 h à temperatura ambiente. A evolução temporal pode ser monitorizada com uma varredura de tempo (dados de um ponto por minuto; tensão γ = 5 %); frequência f = 1 Hz).
- Mede as propriedades mecânicas com os protocolos do teste desejado. Comece com uma série de varreduras de frequência (f-varre) porque eles deixam a amostra intacta e permitir mais medições.
Nota: Além disso, curto f-varreduras devem ser efectuadas antes e após as medições mais (tais como longo f-varre com uma resolução muito maior) para verificar que a amostra permaneceu inalterada durante todo o protocolo de medição completo.- Realizar um curto f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; pontos de 5 dados por década).
- Realizar um longo f-varredura (e.g., γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 pontos de dados por década); o regime de baixa frequência pode ser omitido se não for necessário para reduzir o tempo de medição.
- Realizar um curto f-varredura.
- Executar uma varredura-γ (por exemplo, f = 1 Hz; γ = 0,0125% a 100%; pontos de 20 dados por década).
Nota: Utilize o curto f - varrer primeiro, como é geralmente inconsistente com anterior f - varre porque redes geralmente ruptura durante a varredura-γ ou separar as chapas. Como alternativa, use o γ-rampa (por exemplo, = 0.025 s -1, t = 60 s); no entanto, as rampas normalmente requerem alterando o modo de motor, então subsequentes curto f-varreduras iria ser falsificadas.
- Bin e/ou liso, os dados brutos com um kernel Gaussian.
3. análise da fluorescência-assistida de DNA recozimento
- 8 preparar alíquotas de 12 µ l de cada amostra usando 1-4 µM DNA por vertente e 12,5 mM MgCl 2 em 1 x tampão TE 1x gel de ácido nucleico mancha de DMSO um 10.000 x estoque. Fazer um controle negativo sem DNA, mas incluem ácido nucleico gel mancha.
- Transferir as alíquotas para um prato PCR em tempo real e selar com película adesiva (por exemplo, uma placa de 96 poços de reação).
Nota: As altas temperaturas, utilizadas em protocolos de recozimento térmico evaporará amostras. Assim, certifique-se que os poços são hermeticamente fechados com película adesiva para evitar o aumento de concentração e evaporação de água, particularmente durante as experiências a longo prazo. - Centrifugar a placa a 100 x g por 1 min à temperatura ambiente para remover as bolhas de gás; se expandem as bolhas de gás, os poços não podem ser analisados.
- Carregar a placa selada em um sistema PCR quantitativo em tempo real.
- Executar um programa de recozimento. Desnaturar o DNA a 90 ° C por 10 min. soltar a temperatura rapidamente a 72 ° C. Então, diminua a temperatura lentamente por 0,5 ° C cada 30 min. Depois que o sinal está estragada, acelerar a rampa de temperatura.
Nota: 72 ° C é suficientemente acima da temperatura real da hibridação; assim, o sinal é gravado sobre uma escala de temperatura larga apropriada para determinar a escala de temperatura necessário. - Certifique-se de que a tampa do reciclador aquece a pelo menos 100 ° C para evitar a condensação da amostra evaporada sobre a película adesiva.
- Durante a montagem, excitar as amostras com um laser de argônio-íon em 488 nm e detectar a fluorescência em 550 nm quando usando uma mancha de gel de ácido nucleico (ou espectralmente semelhantes). Para outros corantes, escolha uma combinação adequada de excitação/emissão. Medir o sinal de fluorescência, sempre que possível para aumentar a total qualidade do sinal usando a built-in câmera.
Nota: Aqui, as medidas foram tomadas todas as 9 s. - Se derretendo predefinidos e recozimento programas são aplicados, use o software fornecido para analisar os dados. Se não, subtrair o valor médio anterior do valor médio para cada etapa de temperatura obter a mudança relativa do sinal fluorescente.
4. AFM Imaging
- Cleave mica (por exemplo, mica " V1 ") anexando comercialmente disponível de fita adesiva e rasgá-lo fora; a camada superior da mica deve ser removida.
- Utilizando uma micropipeta, depositar pré-formado n HT em Mg 2 + com solução tampão dobrável sobre a mica clivada fresco e deixá-lo resolver durante 10 min.
- Girar as amostras em intervalos curtos 3 s a 2.000 x g em uma centrífuga de mesa pequena para remover o líquido restante. Vários n HTs ainda deve ser anexado à superfície de mica.
- Use uma ponta de cantilever com uma rigidez elevada (por exemplo, 54 Nm -1) e determinar a sua frequência de ressonância com o software interno do AFM.
- Registro do perfil de altura com o AFM no ar na batida modo de varredura baixas taxas (por exemplo, 1 linha/s) para evitar danificar ou deslocando o n HTS
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Representative Results
A montagem dos nanotubos de DNA através de uma rampa de temperatura (Figura 2) é um método muito confiável para formar estes polímeros semiflexível artificiais. Estes polímeros têm características comparáveis aos seus homólogos naturais, tais como os filamentos de actina, mas fornecem um quadro experimental muito mais amplo, uma vez que suas propriedades mecânicas podem ser botija alterado9,27 . Como biopolímeros, eles podem ser dispostos em redes (Figura 3) e permitem especificamente testar o impacto da rigidez do filamento em massa das estruturas e propriedades. Como mostrado na Figura 4, estas redes exibem um regime de tensão linear para tensões até 10%, que se assemelha as características das redes de filamentos de actina. Dentro deste regime, reologia de cisalhamento linear pode ser facilmente aplicada, por exemplo, para determinar a resposta elástica e viscosa do DNA nanotubo redes analisados em diferentes frequências9. Estes testes revelam que essas redes predominantemente se comportam elasticamente (Figura 5). Em contraste com as medições com proteínas, esses tubos não desnaturar na interface ar-água da amostra e, portanto, sofisticados passivação são estratégias necessárias (Figura 6). Portanto, a manipulação das amostras é bastante simples e tem provado para ser muito robusto, gerando resultados consistentes com baixas variações de amostra-de-amostra.
No entanto, a questão de se a enciclopédia "extremidades pegajosas" de desirmanada single-stranded DNA em ambas as extremidades de cada tubo pode induzir hibridização indesejada, estocástica eventos permaneceram. Para resolver esta preocupação, sequências "acabar cap" complementares, cobrindo as extremidades do tubo foram adicionadas à amostra após o processo de hibridização estava completo. No entanto, a Figura 7 ilustra que tampar as extremidades dos filamentos não tem nenhuma influência detectável e que as extremidades do tubo não provocar qualquer efeito de reticulação transientes na rede9. Degola eventos só desempenham um papel significativo, quando a amostra é tratada demasiado aproximadamente e os tubos quebrar devido a pipetagem dura. Estes pontos de ruptura na verdade parecem induzir efeitos de reticulação, levando a respostas não-linear do sistema, tais como tensão de reforço (Figura 8).
Se as amostras são cuidadosamente preparadas, eles podem ser usados para testar o impacto que a concentração de filamentos (Figura 9A) ou o filamento rigidez (Figura 9B)9 nas propriedades mecânicas das redes consistindo de semiflexível polímeros. Pela primeira vez, a conexão quantitativa entre o filamento rigidez e a elasticidade da rede foi estudada experimentalmente e sistematicamente, produzindo um comportamento de lei de alimentação linear, que contradiz as previsões teóricas predominantes. Esses resultados ilustram que nanotubos de DNA são uma nova ferramenta versátil para estudar os efeitos de polímeros semiflexível, que eram anteriormente experimentalmente inacessíveis9,,27. Agora, várias teorias podem ser experimentalmente testadas, envolvendo declarações sobre dependências sobre a persistência de comprimento lp dos filamentos. Além disso, efeitos muito fundamentais, tais como reptation (Figura 10), podem ser investigados de várias perspectivas empregando tubos que variam de rigidez.
| Nome | Sequência de | ||
| U1: a1 *-b1 *-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1 *-b1 *-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2 *-b2 *-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4 *-* b4-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7 *-* b7-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11 *-* b11-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13 *-* b13-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7 *-* b7-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| tampão de extremidade A1 | CCTAATCGCC | ||
| tampão de extremidade A2 | CCTTTAGATCC | ||
| tampão de extremidade A3 | CCACTCTTCC | ||
| tampão de extremidade A4 | CCGTGAGAACC | ||
| tampão de extremidade A5 | CCGCACGACC | ||
| tampão de extremidade A6 | CCAACGATGCC | ||
| tampão de extremidade A7 | ATGCACCTCC | ||
| tampão de extremidade A8 | AACGGTAACTA | ||
| tampão de extremidade B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| tampão de extremidade B2 * | ACCAGATACA | ||
| tampão de extremidade B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| tampão de extremidade B4 * | ACGCATTGCA | ||
| tampão de extremidade B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| tampão de extremidade B6 * | ACTTCTATCA | ||
| tampão de extremidade B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| tampão de extremidade B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tabela 1: Exemplo de DNA sequências para a hibridização do nHTs exibidos em Figura 1, que também foram usados em estudos anteriores sobre nHTs9, classe = "xref" > 26,27,28. Um determinado conjunto de sequências permite a montagem de sete arquiteturas de tubo diferentes (por exemplo, a1 se com a sequência complementar a1 *). Outras arquiteturas de tubo não dadas aqui também podem ser formadas pela adição ou subtração de vertentes acompanhado pela de acordo com ciclização de vertente n com U1.
Figura 1: tubo de montagem e arquitetura. (A) esquemático do assembly de um 4HT formado de quatro distintas 42-mers. Adjacentes de single-stranded DNA cruzar através de domínios alternados contínuos das bases de 10-11, indicados por carrapatos pretos longo (os carrapatos pretos curtos indicam unhybridized bases). Este motivo meia-cambaleou apresenta extremidades pegajosas em ambos os lados ao longo do eixo, permitindo o crescimento axial, indicado pela seta. As vertentes de limite U1 e T4 também apresentam domínios complementares e, portanto, formam um anel fechado, conforme indicado pela seta para a direita. Note que este desenho é uma representação 2D; no estado hibridizado, os fios formam Hélices duplas e todas as bases estão emparelhadas. (B) esquema de Quasi-3D de um tetrâmero 4HT com duas hélices dobro coberto na camada sombreada distante. Hélices duplas formam para domínios complementares e estão ligados a ambas as hélices duplo adjacentes do tubo uma vez por elemento de comprimento de unidade. Uma vertente do U2 é desenhado mais grosso para maior clareza. (C) exemplos de sete tubo diferentes arquiteturas são dadas, com números de vertente que variam de 4 HT para 14 HT e lp variando de 1,2 a 26 µm. (D e E) imagens de Epi-fluorescente de Cy3-rotulados, adsorvido 5 HT e 10 HT ilustram as diferentes stiffnesses através de contornos curvos de forma diferente. A cobertura vermelha é o contorno de filamento encontrado através de análise de imagem, com distância de-to-end R e l comprimento do contornoC. Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: rampa de temperatura e assembly correspondente de DNA nanotubos. (A) DNA nanotubos são montados em um thermocycler através de um protocolo contendo que temperatura distinta vários passos sobre aproximadamente 11 h. (B) em um sistema PCR quantitativo em tempo real, a mudança relativa do sinal fluorescente de fios manchados é uma medida para DNA de cadeia dupla recém formada ao atravessar a rampa de temperatura. Dependendo do tipo de nanotubos de DNA, pode diferir da taxa de montagem. O mais complexo, o formando estrutura, a mais ampla assembleia, presumivelmente desde vertentes mais (e, portanto, de mais segmentos com sequências distintas e temperaturas de recozimento locais) precisa cruzar as posições adequadas, um processo que é conduzido por flutuações térmicas estocásticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagem de AFM representante de uma rede de emaranhados de 8HTs a 4 µM. O perfil de altura de uma rede pré-formadas de 8HTs absorvida a uma superfície de mica foi gravado usando o modo de bater no ar. Imagens AFM Visualizar uma projeção 2D da rede, mas não permitem a extração confiável de dados (por exemplo, o tamanho de engranzamento) para o caso 3D desde os tubos, bem como as redes são compactadas em uma configuração 2D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: gama Linear. Medições de tensão (G' = 1 Hz) revelam um amplo platô elástico linear, sem sinais de reticulação efeitos tais como o comportamento não-linear, manifestando como estirpe endurecimento. Acima de uma tensão característica (diferente para cada nHT), o módulo elástico planalto rompe irreversivelmente. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: dependência de frequência típica de uma rede de emaranhados 6HT. Redes de tubos de DNA mostram um platô amplo elasticidade durante quatro ordens de magnitude, dependendo da frequência aplicada. Conforme o esperado para uma rede de polímero, a parte elástica (G') a distorcer complexo módulo é significativamente maior do que a parte viscosa (G'). Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Sem efeitos de interface líquido-ar. Varreduras de frequência (f-varreduras; γ = 5%) de 8HT amostras em 8 µM revelaram que a influência dos efeitos da evaporação e da gelificação na interface ar-água são negligenciáveis. Vezes de equilibração diferentes, bem como dois métodos conhecidos para reduzir drasticamente a proteína de clustering na interface (surfactantes e lipídios), foram utilizados. Independente do método, nenhuma indicação de influências drásticas por evaporação ou superfície elasticidade foram gravadas. Aqui, G' representa o módulo de elasticidade e G ' representa o módulo viscoso (linhas tracejadas). Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: nenhuma influência da modificação final. O módulo elástico planalto permanece constante quando tampando as extremidades livres pegajosas da 8HTs com suas respectivas sequências complementares. Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: redes de influência dos procedimentos de manipulação do DNA pré-formada na medição. Dependendo de como as redes pré-formados são tratadas após a hibridização, as medições podem ser diferentes. Neste exemplo, o fluxo de cisalhamento durante a pipetagem de nanotubos o DNA tem sido variado drasticamente e tubos quebraram se tratado demasiado aproximadamente. Ruptura leva a interações indesejáveis entre expostos, single-costas complementares, correlacionando a segmentos quebrados ou danificados, que leva a um aumento na elasticidade e induz efeitos não-lineares, such como tensão de endurecimento (aumento da elasticidade para curva de grandes tensões, verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Nanotubos de DNA permitem o estudo de lp dependências. (A) estudar redes de polímeros semiflexível com nHTs permite a investigação da resposta mecânica do sistema com o aumento da concentração (varredura de concentração), análoga aos estudos baseados em biopolímeros tais como actina. (B) além disso, as diferentes arquiteturas dos tubos facilitam a determinação da resposta mecânica com relação a variação de lp dos filamentos subjacentes, que é inviável com ocorrência natural semiflexível polímeros. Para este efeito, os dados de A é replotted para abordar o dimensionamento do módulo elástico do Planalto em relação a lp. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: tamanho de engranzamento e Reptation. Imagens de fluorescência gravação de filamentos reptating (com rótulo único DNA 8HT incorporado em uma rede sem rótulo; c = 14 µM) pode ser usado para verificar a natureza emaranhada de filamentos na rede. Quaisquer efeitos de reticulação impediria esta difusão unidimensional. Baixo-relevo: Análise de Reptation pode ser usado para determinar o tamanho de engranzamento dimensionamento com concentrações, que compara bem com medições de actina e de acordo com predições teóricas30. As barras de erro cada representam o desvio padrão da média das medições realizadas. Figura adaptada de Schuldt et al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para obter corretamente formadas redes, reunir os nanotubos de DNA é um passo crucial. Erros durante o processo de síntese impactar negativamente a qualidade do tubo; Portanto, é recomendável que ser usado para purificar os oligonucleotides HPLC ou um processo mais rigoroso. Desde que a formação de discretos ao invés de agregados nanotubos de DNA, bem como sua distribuição de comprimento, depende da estequiometria equimolar dos oligonucleotides constituintes n dentro do conjunto, é necessário para remeasure as concentrações de fios comprados, desde dado valores pode variar substancialmente a concentração real. Isso pode ser realizada, por exemplo, por espectroscopia de UV-Vis em um comprimento de onda de absorbância de 260 nm. Gostaríamos de salientar que os pesos moleculares e coeficientes de extinção variam entre as diferentes sequências; Portanto, os valores para traduzir a absorvância em concentração devem ser determinados para cada do oligonucleotide DNA. Quando utilizar equipamento otimizado para volumes de amostra pequena, como um NanoDrop, cada ponto de medição deve ser tomado várias vezes e em média. Estar em conformidade com a escala linear da deteção do espectrómetro. Dilua a fração utilizada para a determinação da concentração, se necessário. Imprecisões ligeiras podem ter um grande impacto sobre a estequiometria correta e a qualidade da formação do tubo; Portanto, a pipetagem das vertentes única deve ser tão precisa quanto possível. Posteriormente, a solução da amostra final deve ser misturada completamente pipetando lentamente a amostra acima e para baixo antes de colocá-lo no thermocycler. Se os fios foram modificados com corantes fluorescentes para visualização, todas as etapas devem ser executadas em um ambiente protegido da luz direta e a posterior adição de agentes antibranqueamento estabelecidas (i.e., oxigénio eliminação sistemas, tais como glicose oxidase/catalase) é recomendado. Depois que as únicas costas foram misturadas nas condições certa reserva, uma rampa de temperatura é aplicada para cruzar as estruturas (Figura 2A). Este padrão de temperatura segue a temperatura previamente determinado crítico hibridização, onde o DNA dupla forma de hélices. Vários métodos foram desenvolvidos para analisar a cinética de hibridização de DNA (ou seja, nativos DNA UV absorvância31, Calorimetria32ou corantes fluorescentes33). No último método, corantes intercalam em DNA dupla hélices, formando complexos altamente fluorescentes mais brilhante do que as tinturas não acopladas. Eles se ligam parcialmente double-stranded, mas não single-stranded DNA34. Portanto, tais corantes foram aplicadas para monitorar DNA nanostructure Self-assembly no sistema35 e podem ser usados para identificar as condições de montagem ideal.
Inicialmente, qualquer DNA dupla-hélice dentro da amostra, tais como duplex predefinidos e imprevisíveis, são desnaturadas em alta temperatura (90 ° C) para evitar o emparelhamento de base não intencionais. Uma posterior diminuição gradual da temperatura (semelhante a Figura 2A) reduz o movimento térmico dos fios de DNA, permitindo eventos base emparelhamento. Devido a minimização da energia livre, de DNA preferencialmente cruzar em suas sequências complementares. Quando é aplicado um corante intercalante dsDNA específica, o brilho aumenta com a formação de complexos altamente fluorescentes, que por sua vez é uma medida quantitativa para recém-formado double-stranded DNA34. A mudança relativa do sinal de fluorescência para a formação de 4HTs e 8HTs é plotada na Figura 2B. Esta mudança relativa é calculada pela média da intensidade de fluorescência para cada temperatura e posteriormente, subtraindo o valor médio da temperatura anterior. Com a diminuição da temperatura, uma elevada fluorescência pode ser detectada (Figura 2B), e o pico desta curva destaca a temperatura onde ocorrem eventos de hibridação massiva. A queda das curvas refere-se a valores de intensidade atingindo um platô. Dependendo da construção de DNA e sua complexidade (por exemplo, um conjunto de pequeno ou grande de DNA costas), o pico pode ser afiado (Figura 2B, curva azul) ou largo (Figura 2B, curva verde). Quando possível, esta deve ser testada para cada estrutura recentemente projetada assegurar que a porção gradualmente decrescente da rampa de temperatura contém o intervalo onde a formação de tubos através da formação dos segmentos de dsDNA hibridizadas está ocorrendo. Após a temperatura apropriada é determinado regime, nanoestruturas podem ser montadas com êxito em intervalos de temperatura muito estreita (Figura 2B, curva azul), ou até mesmo isothermally35. Note-se que a hibridação de DNA várias vertentes em grades periódicas induz cooperativa recozimento efeitos35,36, que suportam mais DNA recozimento. É preciso considerar que corantes intercalante esticar hélices de DNA, além de seus pares de base padrão 10,5 por curva helicoidal configuração, alterando assim a geometria global dos tubos. Portanto, não é aconselhável aumentar a concentração de corante ao longo de uma molécula por 900 pares de bases de DNA35. Além disso, a temperatura de montagem de pico pode desviar a real temperatura do recozimento ideal. Para alcançar alta precisão e para determinar a melhor condição para a formação do tubo, hibridização de DNA deve ser investigada durante muitas etapas de temperatura mudando lentamente, que devem ser verificação dupla com eletroforese em gel de agarose. Para o caso dos nanotubos de DNA, estabelecemos um protocolo de três passos. Primeiro, a amostra é aquecida a 90 ° C para desnaturar o ADN em cadeias simples. Posteriormente, uma escala de temperatura larga (em volta do pico de montagem do sinal de fluorescência) é coberta. No nosso caso, um intervalo de 10 ° C é coberto, variando de 65 ° C a 55 ° C, com um passo de-0,50 ° C cada 30 min. Na etapa final, a temperatura deve cair rapidamente à temperatura ambiente - ou, como no nosso caso, a 20 ° C - para evitar quaisquer interacções desfavoráveis em temperaturas intermediárias (Figura 2A). Geralmente, thermocyclers aquecer as amostras de temperaturas mais frias. Portanto, é importante ajustar a temperatura da tampa de acordo para limitar a evaporação do líquido da amostra durante a montagem, o que aumenta a concentração da amostra final.
Se o nHTs é formados adequadamente, organizam em redes puramente emaranhadas (Figura 3), sem interações, causando efeitos de reticulação entre tubos distintos. As referências cruzadas presumivelmente resultaria de segmentos de DNA não pareados estendendo-se de defeitos ao longo de um tubo ou nas extremidades pegajosas, que estariam livres para emparelhar com segmentos de single-stranded complementares nos tubos vizinhos. Estes efeitos induziria Propriedades não-lineares, tais como o endurecimento de estirpe (aumento de G' para tensões maiores), mas estão ausentes no emaranhado de redes (Figura 4). As γ-varreduras exibidas também revelam os regimes de tensão linear adequado para medições reológicas em geral. Acima de um certo limite, a rede rompe ou perde o contato com as placas do rheometer, que danifica irreversivelmente o sistema. Portanto, as tensões aplicadas devem ser no regime linear para obter dados fiáveis. Normalmente, uma tensão de 5% é suficiente para produzir dados bem acima do regime de ruído. Cepas maiores podem ser aplicadas; no entanto, que facilmente se aproximam do limite de ruptura, e os resultados podem ser falsifiEd devido a medição no regime não-linear.
Medições reológicas requerem uma preparação cuidadosa, consistente da amostra e cuidadosamente considerados protocolos de medição para obter resultados reprodutíveis e interpretáveis. O ponto central é estabelecer uma rede completamente aleatória, isotrópica entre as placas rheometer desde que estas redes são principalmente a estrutura só pode ser reproduzida. Assim, tempos de equilibração bastante longo (normalmente por volta das 2h, às vezes até mais) são necessários para dispersar qualquer ordenação efeitos que ocorrem devido ao alinhamento induzida por cisalhamento durante a pipetagem da amostra. Pré-teste experimentos são recomendados para gravação a evolução temporal (varredura de tempo) do sistema durante a equilibração, a fim de determinar o período de tempo necessário. Uma vez que os sinais atingir platôs sem mais alterações, o sistema é equilibrado. Uma vez equilibração condições foram determinadas, os testes desejados, tais como uma estirpe rampa ou f - ou γ-varre, pode ser executado. Testar um amplo espectro de cepas, finalmente, pode destruir a rede ou a conexão para as placas. No entanto, se os testes limitam-se a tensões abaixo do limite de ruptura, rampas de tensão e varre pode ser iterativamente repetido investigar potenciais efeitos de envelhecimento ou histerese. No caso do f-varre, tempos de medição podem variar substancialmente. Testes de baixas frequências dramaticamente prolongam as experiências, desde que uma oscilação pode levar alguns minutos. Note-se que, no caso de nHTs, f-varreduras revelam que o módulo de elasticidade G' excede o módulo viscoso G' por aproximadamente uma ordem de magnitude, que ilustra a resposta elástica predominante destes sistemas ( Figura 5). Geralmente, os diferentes tipos de experimentos podem ser acompanhados de curto f-varreduras antes e após a experiência principal para verificar que o sistema permaneceu intacta pela medição em si. No entanto, algumas máquinas têm que mudar o modo de motor subjacente para os diferentes tipos de medições, especialmente quando se muda de experimentos dinâmicos (por exemplo, oscilações para f-varre) para uma rampa de tensão estática. Esta mudança é muitas vezes acompanhada por cepas grandes espontâneas, destruindo a rede e medições posteriores de têmpera. Assim, é aconselhável verificar as especificações do rheometer usado.
Experiências de reologia em sistemas baseados em actina revelam um efeito dramático de desnaturação de proteínas que ocorrem na interface ar-água do sistema. Proteínas desnaturadas aderirem unspecifically uns aos outros, formando um gel denso que altamente pode dominar as propriedades mecânicas de todo o sistema. Para evitar o contato direto da amostra com o ar circundante, técnicas de passivação que também suprimem a evaporação do teor de água da amostra podem ser usadas. Três métodos possíveis são: (i) em torno da câmara de amostra com a mesma reserva como a amostra; (ii) utilização de surfactantes para cobrir a interface devido a seus domínios hidrofílicos e hidrofóbicos (deve ter cuidado, pois alguns surfactantes interferem com conformações de polímero); ou (iii) empregando lipídios mais biologicamente compatíveis, com efeitos semelhantes, como surfactantes. Deve notar-se que nHTs não estavam a ser sujeitas a efeitos de desnaturação na interface, e os resultados são independentes do método do passivation (Figura 6), que elimina uma importante fonte potencial de erro. Geralmente, a câmara de amostra sempre deve ser selada com um tampão, que pode ser equipado com esponjas úmidas para aumentar a umidade na câmara, suprimindo a evaporação.
Como brevemente descrito anteriormente, uma potencial fonte de erro em sistemas baseados em DNA é unhybridized DNA, tais como DNA de cadeia simples não pareado saliências em defeitos ou nas extremidades dos nanotubos, que podem causar efeitos adicionais de reticulação. Para investigar e/ou eliminar esta possibilidade, costas complementares curtas podem ser usadas para tampar essas extremidades pegajosas. No entanto, nossas próprias investigações mostraram que a adição de tampar vertentes teve nenhum efeito sobre o introduzido nHTs e o comportamento das redes emaranhados permaneceu inalterado (Figura 7). No entanto, tampar extremidades pegajosas com sequências complementares pode ser útil para outros sistemas baseados em DNA (e mais complexos) suprimir as interações indesejáveis. Além disso, amostras de HTs ndevem ser pipetadas cuidadosamente (por exemplo, para as etapas de diluição e preparação da amostra) para evitar qualquer quebrando ou outros danos aos tubos. Se a solução é pipetada demasiado aproximadamente, os tubos quebrar incontrolavelmente, expondo-se um grande número de extremidades pegajosas em pontos de defeito, levando a indesejada interações entre os tubos e reticulação potencial no sistema. Isto interfere com o sinal e conduz a efeitos de reforço, bem como efeitos não-lineares tais como endurecimento de estirpe, que se torna visível em varreduras de γ (Figura 8). Assim, pipetar a emaranhados solução só deve ser feita lentamente e usando pontas de pipetas com um diâmetro bastante grande (corte a extremidade de uma ponta da pipeta é aconselhável) para reduzir a distorcer as forças nos tubos.
Em conclusão, DNA nHTs são um sistema de modelo apropriado e altamente adaptável para estudar os polímeros semiflexível e redes formadas a partir destes filamentos, que representa uma nova classe de hidrogel mecanicamente ajustáveis a granel. Se os tubos são preparados cuidadosamente, eles podem ser usados para testar o impacto do lp dos filamentos em vários casos. A medição reológica granel do emaranhado de redes, por exemplo, revela que as dependências teoricamente previstas o módulo elástico com concentração e lp de são inconsistentes com a escala derivada experimentalmente legislação (Figura 9)9. Este estudo enfatiza que a elasticidade de uma rede pode ser aumentada, aumentando a rigidez dos polímeros subjacentes. Tradicionalmente, aumentando a rigidez de um hidrogel foi conseguido pela adição de polímeros mais para a solução ou através da indução de ligações cruzadas (físicas ou químicas) entre vizinhos polímeros37,38. No entanto, um maior teor molecular também está associado com uma malhagem reduzida, que pode limitar aplicações tais como a cultura de células 3D. As referências cruzadas, por outro lado, podem induzir mudanças morfológicas complexas dentro a arquitetura de rede subjacente, o que complica ainda mais o ajuste preciso das propriedades mecânicas de39. Usando redes de nHTs, entretanto, permite uma dissociação total desses parâmetros, segundo a qual os efeitos de enrijecimento podem ser induzidos por unicamente mudando a rigidez dos filamentos subjacentes, deixando a malhagem inalteradas. Além disso, as arquiteturas de tubo podem ser alteradas especificamente para integrar seletivamente efeitos adicionais tais como de reticulação, que, da mesma forma nas redes emaranhadas, cria novas possibilidades para testar experimentalmente predições teóricas para parâmetros tais comol tamanho p ou crosslink e força para as redes. Em geral, a arquitetura programável amplia o escopo das aplicações, permitindo o estudo de lp-efeitos dependentes não só no volume, mas também no nível único-molécula. Tubos etiquetados podem ser incorporados na rede para estudar, por exemplo, a dependência de lp no movimento unidimensional de um filamento em confinamento de tubo, comumente referido reptation (Figura 10)9. Se este movimento difusiva é visível, ele também verifica a natureza emaranhada da rede, desde que isso iria ser suprimido por efeitos de reticulação. Analisando a dinâmica subjacente também revela a malhagem da rede. Além disso, estes tubos podem ser usados para investigar a dependência entre a rigidez e quiralidade dos tubos subjacentes sobre a formação de feixes40,41,42,43, 44 , estruturas de 45 ou de ordem superior, tais como estrela como ásteres46,47,48,49,50, que pode ser induzida por efeitos de reticulação ou através ambientes aglomerados molecularmente27.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Reconhecemos que o financiamento pelo DFG (1116/17-1) e da escola de Leipzig de ciências naturais "BuildMoNa" (GSC 185). Este trabalho foi apoiado através do projeto de Fraunhofer atrair 601 683. T. H. reconhece que o financiamento do Fundo Social Europeu (FSE-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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