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Developmental Biology

उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी (एचआरईएम) - प्रसंस्करण और दृश्यमान कार्बनिक सामग्री के लिए सरल और मजबूत प्रोटोकॉल

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

हम उच्च-संकल्प एपिसकोपिक माइक्रोस्कोपी पद्धति के साथ डिजिटल वॉल्यूम डेटा जनरेशन को अनुमति देने के लिए विभिन्न प्रजातियों के बायोप्सी सामग्री, बायोमेडिकल मॉडल जीवों के भ्रूण और अन्य जैविक ऊतकों के नमूनों के प्रसंस्करण के लिए सरल और मजबूत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।

Abstract

हम उच्च संकल्प एपिसकोपिक माइक्रोस्कोपी (एचआरईएम) विधि के साथ डिजिटल वॉल्यूम डेटा बनाने के लिए सरल प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एचआरईएम 1 x 1 x 1 और 5 x 5 x 5 माइक्रोन 3 के बीच विशिष्ट संख्यात्मक प्रस्तावों में 5 x 5 x 7 मिमी 3 तक की मात्रा के साथ जैविक सामग्री इमेजिंग करने में सक्षम है। नमूनों को मेथाक्रीलाट राल में एम्बेडेड किया गया है और एक सूक्ष्ममाणु पर अनुभाग किया गया है। प्रत्येक अनुभाग के बाद ब्लॉक की सतह की एक छवि को एक डिजिटल वीडियो कैमरा के साथ कब्जा कर लिया जाता है जो मिश्रित माइक्रोस्कोप हेड से जुड़े फोटोट्यूब पर बैठता है। ऑप्टिकल अक्ष हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) फ़िल्टर क्यूब से गुजरता है और एक स्थिति के साथ गठबंधन किया जाता है, जिस पर प्रत्येक खंड के बाद बॉक धारक आर्म आराम में आता है। इस तरह, स्वाभाविक संरेखित डिजिटल छवियों की एक श्रृंखला, बाद के ब्लॉक सतहों को प्रदर्शित करने का उत्पादन किया जाता है। ऐसी छवि श्रृंखला को तीन-आयामी (3 डी) विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर में लोड करना, डिजिटल वॉल्यूम डेटा में तत्काल रूपांतरण की सुविधा देता है, जो वर्चुअल एसविभिन्न orthogonal और तिरछे विमानों में खपत और मात्रा और सतह गाया कंप्यूटर मॉडल का निर्माण। हम तीन सरल, ऊतक विशिष्ट प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिनमें माउ, चिली, बटेर, मेंढक और ज़ेब्रा मछली भ्रूण, मानव बायोप्सी सामग्री, बिना कागज वाले कागज और त्वचा प्रतिस्थापन सामग्री शामिल हैं।

Introduction

जैविक और अकार्बनिक सामग्री का संरचनात्मक विश्लेषण उनके भौतिक गुणों और कार्यों को समझने में पहला कदम है। इस तरह के विश्लेषण का आधार अक्सर ऊतक वास्तुकला, सेल आकारिकी और टोपोलॉजी, आणविक संरचना और बायोमेनिकल गुण 1 का विवरण निकालने वाले विभिन्न सरल और परिष्कृत इमेजिंग विधियों के साथ हिस्टोलॉजिकल अनुभागों के सावधान अवलोकन द्वारा प्राप्त की गई दो-आयामी (2 डी) सूचना है । 2 , 3 हालांकि, 2 डी जानकारी स्थानिक जटिल परिस्थितियों के शोध के लिए उपयुक्त नहीं है। इसलिए विवो और पूर्व विवो विधियों की संख्या बढ़ रही है जो डिजिटल मात्रा डेटा तैयार करने की अनुमति देते हैं, पिछले 4 सालों में स्थापित की गई थीं और कई और भी विकास के अधीन हैं।

अधिकांश वॉल्यूम डेटा पीढ़ी के तरीकों का सिद्धांतिक सिद्धांत आभासी ढेर की पीढ़ी हैडिजिटल छवियों की एक वस्तु के आभासी या भौतिक सेक्शन द्वारा प्राप्त वर्गों को प्रदर्शित करता है। यदि अनुभाग छवियों को ठीक से गठबंधन किया गया है, तो यह एक मात्रा बनाता है, जिसे आभासी अनुभाग विमानों में फिर से विभाजित किया जा सकता है, या 3 डी की सतह और मात्रा गाया मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मनुष्यों और बड़े जैविक नमूनों को देखने के लिए लोकप्रिय तकनीक चुंबकीय अनुनाद टोमोग्राफी (एमआरटी), कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी), पॉज़िट्रॉन एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) और एकल फोटॉन उत्सर्जन कंपॉमेटेड टोमोग्राफी (एसपीईसीटी) हैं। छोटे नमूनों को आम तौर पर सूक्ष्म-चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (μMRI), ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (ओपीटी), ऑप्टिकल कॉन्सरेंस टोमोग्राफी (ओसीटी), फोटोकाउस्टिक टोमोग्राफी (पैट), हिस्टोलॉजिकल सेटेक्शन आधारित विधियों, कॉम्बोक्ल माइक्रोस्कोपी, और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी 5 , 6 का उपयोग करके देखा जाता है। , 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17

एक अपेक्षाकृत नई मात्रा डेटा पीढ़ी तकनीक, जो छोटे नमूनों और ऊतक ऊतक के नमूने के डिजिटल डेटा का उत्पादन करती है एचआरईएम विधि है, जिसे टिम मोहन 18 , 1 9 के साथ करीबी सहयोग में विकसित किया गया था। यह एक सरल सूक्ष्मदर्शी आधारित तकनीक है, जो राल एम्बेडेड सामग्री से डिजिटल वॉल्यूम डेटा जनरेट करता है जिसे माइक्रोोटॉम पर वर्गीकृत किया गया है। डेटा मध्यवर्ती प्रकाश सूक्ष्म स्तर पर ऊतक आर्किटेक्चर और सेल डिस्ट्रीब्यूशन के साथ-साथ छोटी विशेषताओं के मीट्रिक विश्लेषण के विस्तृत विश्लेषण की सुविधा देता है।

एचआरएम स्वाभाविक संरेखित डिजिटल छवियों के ढेर पैदा करता है, जो ई से कब्जा किए जाने के रूप में दिखाई देते हैंओएसिन सना हुआ हिस्टोलॉजिकल सेक्शन दृश्य के क्षेत्र के संबंध में ऊतक के विपरीत और डेटा संकल्प, μCT, माइक्रिया, और ओपीटी के साथ उत्पादित डेटा से अधिक है, लेकिन confocal, light sheet और electron microscopy 20 के साथ प्राप्त करने योग्य है। हालांकि, उत्तरार्द्ध के विपरीत, एचआरएम हिस्टोल की गुणवत्ता में 5 x 5 x 7 मिमी 3 के सापेक्ष बड़ी मात्रा के साथ नमूने देखने में सक्षम है। कई हालिया अध्ययनों में एक विस्तृत इजाजत तकनीक के फायदे और नुकसान के विस्तृत लक्षण वर्णन और तुलना की जाती है और, निष्पक्षता की खातिर, हम उन लोगों को उनकी सीमाओं और 4 , 21 , 22 , 23 , 24

यह अध्ययन एचआरईएम इमेजिंग पद्धति पर केंद्रित है और प्रदान करना हैकार्बनिक पदार्थों के व्यापक स्पेक्ट्रम के एचआरईएम डेटा के साथ-साथ उनके आवेदन के उदाहरणों को बनाने के लिए बहुत सरल प्रोटोकॉल। एचआरईएम डेटा बनाने के लिए कार्यप्रवाह सरल है और सभी सामग्रियों पर लागू होता है जो मेथाक्रीलाट राल ( चित्रा 1 ) में एम्बेड कर सकते हैं। फिर भी नमूना तैयार करने में ऊतक विशिष्ट मतभेद हैं, जिन्हें समझने की आवश्यकता है। इसलिए हम विभिन्न नमूने तैयार करने के लिए तीन मानक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एम्बेडिंग और डेटा जनरेशन प्रोटोकॉल चरण उन सभी के लिए समान हैं।

Protocol

विएना के मेडिकल विश्वविद्यालय में नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार सभी प्रक्रियाएं निष्पादित की गईं

1. नमूना तैयार करना

  1. भ्रूण और भ्रूण के ऊतकों की तैयारी (5 x 5 x 5 मिमी 3 तक )
    1. 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में भ्रूण या भ्रूण के कुछ हिस्सों को ठीक 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 16 - 24 घंटे लगातार कमाल के दौरान तय करें।
      नोट: कई प्रजातियों और विभिन्न विकास चरणों के भ्रूण का इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि 48-ज zebrafish, 19-एच लड़की और बटेर, और जन्म के पूर्व माउस भ्रूण, जो यहां इस्तेमाल किए गए थे ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)। नमूनों को कटाई के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में तब्दील कर दिया गया था, इससे पहले कि उन्हें लगाने में लगाया गया। यदि जरूरी हो तो, नमूने को सूक्ष्म कैंची या स्केलपेल के साथ एम्बेडिंग ढालना में फिट करने से पहले ट्रिम करें।
    2. स्थिरांक निकालें और पीबीएस में भ्रूण ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर लगातार चट्टान के नीचे धो लें24 घंटे के लिए जी (2-3 परिवर्तन)
    3. नमूनों को 70%, 80%, 90%, 96% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 2-3 घंटे प्रत्येक में डिहाइड्रेट करें। रोटेटर पर नमूनों युक्त ट्यूब्स रखें।
      नोट: छोटे नमूनों (<2 x 2 x 2 मिमी 3 ) के लिए, प्रत्येक एथेनॉल में एक नमूना का समय 60 मिनट तक घटाया जा सकता है। बड़े नमूनों (> 5 x 5 x 5 मिमी 3 ) के लिए, इसे 4 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है।
    4. सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए एक धूआं हुड के तहत निम्नलिखित घुसपैठ के चरणों को पूरा करें।
      1. 1.25 ग्राम बेंज़ोइल पेरोक्साइड (प्लास्टिसाइज्ड उत्प्रेरक) और 0.4 ग्राम ईोसिन को 100 मिलीलीटर समाधान ए (अधिक जानकारी के लिए, सामग्री की तालिका देखें) के द्वारा घुसपैठ समाधान तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस तक ईसीन और उत्प्रेरक पूरी तरह से भंग कर रहे हैं (2 - 3 एच) पर एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर बीकर में यह हलचल।
      2. घुसपैठ समाधान में 12 से 24 घंटे के लिए नमूने रखें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस के तहत लगातार रॉकिंग या रोटेशन में रखें। घुसपैठ समाधान 3 और 12 के बाद ताजा समाधान के साथ बदलेंएच।
        नोट: बड़े भ्रूणों (> 1 सेमी मुकुट / दुम की लंबाई) के लिए घुसपैठ का समय 48 घंटे तक बढ़ाएं।
  2. वयस्क ऊतकों के नमूने तैयार करना (5 x 5 x 7 मिमी 3 तक )
    1. 2% पीएफए ​​/ पीबीएस में ऊतकों को ठीक करें, 4% कार्बोलिक एसिड युक्त 4 डिग्री सेल्सियस कम से कम 3 दिनों के लिए।
      नोट: त्वचा, जिगर, अग्न्याशय, किडनी, थायरॉयड, हृदय, धारीदार मांसपेशियों, मस्तिष्क, नसों और कई नवजात और वयस्क मानव, कृन्तकों, सूअरों, फल मक्खियों, और ज़ेबरा मछलियों के ट्यूमर मॉडल से उत्पन्न ऊतक नमूना इस समाधान में तय किया जा सकता है और फिर एचआरईएम इमेजिंग के लिए संसाधित (हम नमूने के फिक्सिंग का प्रदर्शन करते हैं; प्रतिनिधि परिणाम देखें)। स्केलपेल, कैंची या बायोप्सी घूंसे के साथ ऊतक के नमूनों को एक्साइज करें और उन्हें ठीक से लगाये रखें। तंत्रिका ऊतक के निर्धारण के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस का उपयोग करें।
    2. लगानेवाला निकालें और 3-6 घंटे के लिए नल का पानी चलाने के दौरान ऊतक को धो लें।
    3. बाद में पीएलए द्वारा नमूनों को निर्जलीकरणउन्हें 70%, 80%, 90%, 96% इथेनॉल में मिलाया, प्रति 100 एमएल प्रति 0.4 ग्राम ईोसिन (2-3 एच प्रत्येक) के साथ मिलाया गया। नमूनों के साथ समाधान 4 डिग्री सेल्सियस के तहत लगातार कमाल या एक चक्कर पर रखें।
      नोट: छोटे नमूनों (<2 x 2 x 2 मिमी 3 ) के लिए, प्रत्येक एथेनॉल में एक नमूना का समय 60 मिनट तक घटाया जा सकता है। बड़े नमूनों (> 5 x 5 x 5 मिमी 3 ) के लिए, इसे 4-8 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है।
    4. सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए एक धूआं हुड के तहत सभी निम्नलिखित घुसपैठ के चरणों को पूरा करें।
      1. 1.25 ग्राम बेंज़ोइल पेरोक्साइड (प्लास्टाइज्ड उत्प्रेरक) और 0.4 ग्राम ईोसिन को 100 एमएल का समाधान ए (अधिक जानकारी के लिए, सामग्री की तालिका देखें) द्वारा घुसपैठ समाधान तैयार करें। ईसीन और उत्प्रेरक पूरी तरह से भंग हो जाने तक (2-3 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस पर चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर बीकर में हलचल।
      2. 24 - 36 घंटे के लिए घुसपैठ समाधान में नमूने रखें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस के तहत लगातार रॉकिंग या रोटेशन में रखें। 3 और बाद में ताजा समाधान के साथ घुसपैठ समाधान बदलें12 घंटे
        नोट: बड़े नमूनों (> 5 x 5 x 5 मिमी 3 ) के लिए घुसपैठ का समय 48 घंटे तक बढ़ाएं।
  3. अन्य जैविक सामग्री की तैयारी
    नोट: साधारण कैंची के साथ वांछित आकार में त्वचा का विकल्प और पेपर छाँटो। कोई निर्धारण की आवश्यकता नहीं है।
    1. निर्धारण, धोने और निर्जलीकरण चरणों को छोड़ें
    2. सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए एक धूआं हुड के तहत सभी निम्नलिखित घुसपैठ के चरणों को पूरा करें।
      1. 1.25 ग्राम बेंज़ोइल पेरोक्साइड (प्लास्टाइज्ड उत्प्रेरक) और 0.4 ग्राम ईोसिन को 100 एमएल का समाधान ए (अधिक जानकारी के लिए, सामग्री की तालिका देखें) द्वारा घुसपैठ समाधान तैयार करें। एक बीकर में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय सरगर्मी प्लेट पर हलचल जब तक ईोसिन और उत्प्रेरक पूरी तरह से भंग कर रहे हैं (2 - 3 एच)।
      2. 3 - 12 घंटे के लिए घुसपैठ समाधान में नमूने रखें इसे 4 डिग्री सेल्सियस के तहत लगातार रॉकिंग या रोटेशन में रखें। 1 और 2 - 4 घंटे के बाद नए समाधान के साथ घुसपैठ समाधान बदलें।
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2. एम्बेडिंग

नोट: सुरक्षात्मक दस्ताने पहने हुए एक धूआं हुड के तहत सभी चरणों को पूरा करें

  1. ऊपर वर्णित ताजा घुसपैठ समाधान तैयार करें (चरण 1.1.4.1)। एम्बेडिंग समाधान तैयार करने के लिए 4 एमएल समाधान बी (विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें) को 100 एमएल घुसपैठ समाधान में जोड़ें।
    नोट: यदि एम्बेडिंग ढालना में नमूना का सटीक अभिविन्यास आवश्यक है और समानांतर में कई नमूनों को एम्बेड करने की अनुमति देने के लिए, बीकर को बर्फ-स्नान में डालकर स्टॉक समाधान के बहुलकण को ​​धीमा कर दें।
  2. 6 x 8 x 5 मिमी 3 या 13 x 19 x 5 मिमी 3 या 8 x 10 x 15 मिमी की मात्रा के साथ कस्टमाइज्ड ढालना के ढलाई के साथ मोल्डिंग कप ट्रे (विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें 3 ( चित्रा 2 )।
  3. मोल्ड को एम्बेडिंग समाधान के साथ भरें और नमूना को मोल्ड में स्थानांतरित करेंएक चम्मच। स्थानान्तरण के दौरान यह सुनिश्चित करना कि नमूना हवा के फंसाने से बचने के लिए पूरी तरह से एम्बेडेड समाधान के साथ कवर किया गया है।
    नोट: यह कमरे के तापमान पर किया जा सकता है, अगर रेफ्रिजरेटर से नमूनों को इकट्ठा करने और एम्बेडिंग समाधान के तुरंत बाद शुरू किया जाए।
    1. सुई या संदंश का उपयोग करके मोल्ड के अंदर नमूना ओरिएंट।
    2. जैसे ही एम्बेडिंग समाधान चिपचिपा बनना शुरू हो जाता है, ब्लॉक के शीर्ष पर एक ब्लॉक धारक (देखें सामग्री की सामग्री देखें) और ब्लॉक धारक के केंद्रीय छेद के माध्यम से एम्बेडिंग समाधान जोड़ दें जब तक कि ब्लॉक धारक का आधार 1-3 एम्बेडिंग समाधान का मिमी
    3. मोल्डिंग कप ट्रे को तरल पैराफिन मोम के साथ कवर करके सील करें और जब तक कठोर न हो जाए तब तक प्रतीक्षा करें। वैकल्पिक रूप से नमूनों के साथ मोल्डिंग कप ट्रे पर एक दूसरे मोल्डिंग कप ट्रे को ऊपर की तरफ रखें और चिपकने वाली टेप से वायु-सबूत के लिए इसे मुहरें।
  4. ब्लॉकों को मोहरबंद मोल्डिंग कप ट्रे के भंडारण के द्वारा पॉलिमराइजेशन समाप्त करने की अनुमति दें 1 -कमरे के तापमान पर 2 दिन
  5. पोस्ट-पॉलीमिराइज़ेशन प्रसंस्करण के लिए, एक मानक प्रयोगशाला ओवन में बहुलकीकृत ब्लॉकों के साथ मोल्डिंग कप ट्रे डालें और 70-80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1-3 दिनों तक सेंकना करें जब तक कि वे गहरे लाल न हो जाए। ओवन से ट्रे ले लीजिए और मोल्ड से ब्लॉकों को हटा दें।
    नोट: पाक सामान्य पर्यावरण शर्तों के तहत किया जा सकता है। कवर मोल्डिंग कप ट्रे, जो एम्बेडिंग के बाद पहले चरण में वायुरोधी सील को सुनिश्चित करता है, को 10 घंटे के बाद राल के रंग की जांच करने के लिए निकाला जा सकता है। पकाने के तुरंत बाद, राल नरम है और ब्लॉकों को मोल्डिंग कप ट्रे से आसानी से हटाया जा सकता है। 2 से 3 घंटे के भीतर वे कठिन हैं और कई महीनों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. डेटा जनरेशन

नोट: यहां इस्तेमाल किए गए HREM प्रोटोटाइप 18 , 25 में निम्नलिखित आइटम शामिल हैं: (i) ब्लॉक धारक के साथ रोटरी माइक्रोोटॉमजो उसके ऊपरी मोड़ पर प्रत्येक कटौती के बाद बंद हो जाता है (Ii) मानक, गैर-डिस्पोजेबल माइक्रोोटॉम चाकू, हार्ड मेटल, प्रोफाइल डी (विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें)। (Iii) ऑब्जेक्टिव रिवॉल्वर और जीएफ़पी-फिल्टर क्यूब (उत्तेजना 470/40; उत्सर्जन फ़िल्टर 525/50) के ऑप्टिकल अक्ष में प्रतिदीप्ति परिसर माइक्रोस्कोप का प्रमुख ऑप्टिकल अक्ष को सूक्ष्ममाणु पर लगाए गए एक ब्लॉक के ताजा कट सतह पर लंबवत व्यवस्थित किया जाता है और यह डिवाइस द्वारा आयोजित किया जाता है जो ऊपर और नीचे की ओर आंदोलन की अनुमति देता है। (Iv) माइक्रोट्रॉम वाला मोटरमाइड क्रॉस टेबल मेज ऑप्टिकल अक्ष की दिशा में और बाद में स्थानांतरित किया जा सकता है (V) फ्लोरोसेंट मिश्रित माइक्रोस्कोप से जुड़ी डिजिटल वीडियो कैमरा (Vi) मोनोक्रोम प्रकाश स्रोत (470 एनएम) (Vii) कंप्यूटर से जुड़ा कंप्यूटर, डाटा पीढ़ी सॉफ्टवेयर के साथ (विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें)।

  1. प्रक्रिया
    1. रुचि के क्षेत्र को इंगित करें
      1. मानक प्रयोगशाला ली का उपयोग करेंब्लॉक की सतह पर सफेद प्रकाश को आंशिक निर्देशित करने के लिए ght स्रोत ( सामग्री की तालिका देखें)
      2. एम्बेडेड सामग्री की रूपरेखाओं को पहचानें, क्योंकि यह ब्लॉक की सतह पर प्रोजेक्ट करती है। एक पेन या रेजर ब्लेड के द्वारा ब्लॉक की सतह पर ब्याज के क्षेत्र और बाद के क्षेत्र का दृश्य बताएं।
        नोट: सेक्शनिंग से पहले दृश्य के क्षेत्र की सीमा को परिभाषित करने के लिए यह कदम अनिवार्य है।
    2. दृश्य के क्षेत्र को परिभाषित करें
      1. माइक्रोटम पर नमूना के साथ राल ब्लॉक माउंट।
      2. ब्लॉक धारक को इसकी रोक स्थिति (ब्लॉक धारक भ्रमण के ऊपरी मोड़) पर ले जाएं।
      3. डिजिटल कैमरा और डेटा पीढ़ी सॉफ्टवेयर शुरू करें, और एक लाइव छवि प्राप्त करें
      4. ब्लॉक की सतह पर दर्शाए गए ब्याज के क्षेत्र को कवर करने के लिए एक उपयुक्त लेंस चुनिए।
        नोट: 0.07 और 0.40 के बीच 2.5 एन, 5 एक्स, 10 एक्स, 20 एक्स और अंकीय एपर्चरों के विस्तार के साथ सामान्यतः उपयोग किया जाता है। ऑप्टिक अप-डाउन और माइक्रोटॉम को बाद में मोटर क्रॉस टेबल का उपयोग करके ले जाएं जब तक कि कम्प्यूटर स्क्रीन पर दिखाई देने वाले क्षेत्र के साथ दिलचस्पी के क्षेत्र में मिलान न हो।
    3. ध्यान दें।
      1. नमूना बनने के पहले संरचनाओं को दिखाई देने तक चरण मैनुअल सेक्शनिंग द्वारा चरणबद्ध करें।
      2. ऑप्टिक अक्ष की दिशा में माइक्रोोटॉम को स्थानांतरित करके ऑप्टिक के फ़ोकस प्लेन में ब्लॉक की सतह को व्यवस्थित करें।
      3. अनुभाग मोटाई चुनें; अनुभाग मोटाई 0.5 से 5 सुक्ष्ममापी की सिफारिश की जाती है।
  2. डाटा पीढ़ी और प्रसंस्करण
    1. स्टार्ट्यूलमेंट रूटीन शुरू करें जो सेक्शनिंग और छवि कैप्चरिंग करता है। इमेजिंग कैप्चरिंग सॉफ़्टवेयर के दस्तावेज अनुदेश का पालन करें
    2. सॉफ़्टवेयर नियति को रोकें और ब्लॉक की सतह के सामने एक स्केलिंग स्लाइड डाल दें जैसे ही नमूना पूरी तरह से विभाजित हो।
    3. बाद में कैलीब्रा के लिए इंटरैक्टिव रूप से एक चित्र कैप्चर करेंtion।
      नोट: यह हर बार किया जाना चाहिए जब किसी नए व्यवस्थित सेट में एक उद्देश्य का उपयोग किया जाए।
    4. छवि श्रृंखला को 8 बिट ग्रे-स्केल छवियों में कनवर्ट करें in.jpg प्रारूप।
    5. छवि श्रृंखला को 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर में लोड करें और विरोधाभासों को समायोजित करें।
      नोट: छवि रूपांतरण और 3 डी विज़ुअलाइजेशन संबंधित सॉफ्टवेयर के निर्देशों के बाद, विभिन्न वाणिज्यिक या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध मानक सॉफ़्टवेयर संकुल के साथ किया जा सकता है।

Representative Results

एचईआरएम स्वाभाविक संरेखित डिजिटल छवियों की श्रृंखला उत्पन्न करती है, जिसमें हेमटॉक्साइलिन / ईओसिन सना हुआ ऊतक वर्ग के चित्रों के समान विरोधाभास हैं। 2 डी खंड की छवियों के विपरीत, एचआरएम छवियों के ढेर 3 डी में जैविक सामग्री की व्यापक विविधता के ऊतक आर्किटेक्चर, आकृति विज्ञान, और टोपोलॉजी के विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। उच्च विपरीत अक्सर सतह प्रदान की जाने वाली मॉडल की पीढ़ी के लिए मात्रात्मक कंप्यूटर मॉडल और अर्ध स्वचालित समोच्च निष्कर्षों की त्वरित और सरल 3D विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है।

एचईआरएम डेटा का आकार कैमरा लक्ष्य के आकार के अनुसार, छवि कैप्चरिंग मोड (8, 12, 16 बिट, ग्रे स्केल, रंग) और एकल ब्लॉक फेस छवियों की संख्या के अनुसार भिन्न होता है। 1,000 8-bit.jpg के छोटे डेटा सेट 2,048 पिक्सेल x 2,048 पिक्सेल के ग्रे स्केल छवियों का आकार लगभग 900 एमबी है। 4,000 9 पी के ग्रे स्केल चित्रों के 3,000 8-bit.jpg के बड़े डेटा सेटIxel x 4,096 पिक्सेल में लगभग 20 जीबी की मात्रा है

प्रदान किए गए प्रोटोकॉल सरल और मजबूत होते हैं, और पिछले दशक के दौरान, वे कई अलग-अलग नमूनों के एचआरईएम आंकड़े पैदा करने के लिए कार्यरत थे। प्रोटोकॉल खंड 1.1 को बायोमेडिकल मॉडल जीवों के पूरे भ्रूण को प्रोसेस करने के लिए अनुकूलित किया गया था जिसमें 1 सेमी तक की लंबाई और भ्रूण टिशू के नमूनों के साथ 5 x 5 x 5 मिमी 3 के आयाम के साथ; हम निम्न प्रजातियों के भ्रूणों के एचआरईएम डेटा का उत्पादन करने के लिए इस विधि का इस्तेमाल करते हैं: माउस ( मैसस्कूलुस) , चिकी ( गैलस गैट्स ), ज़ेब्रा मछली ( दानियो रीयियो) , बटेर ( कोटिनिक्स कोटिनिक्स) , अफ्रीकी पंजे वाला मेंढक ( एक्सनोपस लाईविस ), घोड़ा ( इक््यूस फेरस कैबेलस ), मिल्कवेड बग ( ओंकोप्लेल्टस फसीसीटस ), मगरमच्छ ( क्रोकोडालिया ), और ऑक्टोपस ( ऑक्टोपस वुल्गारिस )। सभी प्रजातियों का आंकड़ा उत्कृष्ट गुणवत्ता का था ( जैसे , चित्रा 3 )

3 तक के आयाम के साथ किशोर और वयस्क ऊतक नमूनों के संसाधित करने के लिए अनुकूलित किया गया था और वे ऊतक के नमूनों को देखने के लिए नियोजित थे त्वचा, यकृत, अग्न्याशय, गुर्दा, थायरॉयड, हृदय, धारीदार मांसपेशियों, मस्तिष्क, नसों और ट्यूमर के मॉडल मानव ( होमो सेपियंस ), चूहों ( मस्तिष्क का मांस ), चूहों ( रत्तुस नर्सगिकस ), सूअर ( सस स्कोरोफा डोमेस्टिका ) फेर्रेट ( मुस्टला फरो ), फ्लाइट फ्लाई ( ड्रोसोफिला मेलानोगस्टर ), और ज़ेब्रा फिश ( दानियो रीयो )। हालांकि परिणाम अधिकांश नमूनों ( जैसे , चित्रा 4 , एनीमेशन 1 ) के साथ उत्कृष्ट थे, त्वचा के बहुत केंद्रीय हिस्सों (एपिडर्मिस के साथ) और मस्तिष्क के नमूने 3 x 3 x 3 मिमी 3 से बड़े होते हैं क्योंकि ईोसिन के अपर्याप्त प्रवेश के कारण अक्सर अस्थिरता बनी रहे इन ऊतकों

प्रोटोकॉल एसएक्शन 1.3 को तंतुमय कार्बनिक सामग्री प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित किया गया था और लेपित पेपर, अनकोएटेड पेपर, देशी त्वचा संबंधी सामग्री और स्टेम सेल वरीकृत त्वचीय स्थानापन्न सामग्री के फाइबर आर्किटेक्चर को देखने के लिए नियोजित किया गया था। ये नमूनों को प्रक्रिया में आसान और त्वरित किया गया था Uncoated कागज और सबसे त्वचा विकल्प का डेटा अच्छी गुणवत्ता के थे ( चित्रा 5 , एनीमेशन 2 )। लेपित कागज को संसाधित करने में समस्याएं हुईं, जब अकार्बनिक पदार्थ ईोसिन के प्रवेश में बाधा पहुंचा। एक अन्य मुद्दा तब होता है जब त्वचा के विकल्प के आधार पर अगर का उपयोग होता है क्योंकि वे घुसपैठ समाधान द्वारा आंशिक रूप से पच जाते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: वर्कफ़्लो लाल बक्से में दिखाए गए कदमों को नमूना विशेषताओं के अनुसार संशोधनों की आवश्यकता होती है। हरे रंग के बक्से के चरण उन हैं जोसभी नमूनों में समान हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: अनुकूलित ढालना मोल्ड को एक छेद को मूल मोल्ड में काटने के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है, पाश्चर pipet का बल्ब डालना और उसे मॉडलिंग सामग्री के साथ सील करना। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: विशेष रूप से विज़ुअलाइज्ड भ्रूण (ए, बी) भ्रूण के दिन में पैदा हुए माउस भ्रूण, ई = 9.5 HREM अनुभाग छवि (ए) में दिखाया गया है (बी) में दिखायी गई है (सी) एक ई 15.5 माउस भ्रूण के गर्दन के एक मात्रा गाया मॉडल के माध्यम से आभासी बाण का खंड। (डी) विकासात्मक हैमबर्गर हैमिल्टन (एचएच) चरण 18 में चिकी भ्रूण। हृदय संबंधी घटकों के लुमिना के भूतल मॉडल, जो सभी भ्रूण के ऊतकों की मात्रा रेंडरिंग के साथ जोड़ता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: विशेष रूप से विज़ुअलाइज्ड वयस्क टिशू नमूने। (ए) एक मानव तंत्रिका के माध्यम से एक HREM अनुभाग छवि का हिस्सा जड़ना छवि का एक भाग अधिक विस्तार से दिखाता है। (बी) पोर्किन यकृत के माध्यम से एक एचआरईएम अनुभाग छवि का हिस्सा। एन नोट करेंuclei। (सी) मानव लसीका ऊतक की एक HREM अनुभाग छवि का हिस्सा (डी, ई) एक मानव अंगूठे पैड की मोटी त्वचा पूरे बायोप्सी के वॉल्यूम ने 3 डी मॉडल प्रस्तुत किया (डी) एचआरईएम डेटा (ई) के माध्यम से एक आभासी लपट के सामने धमनियों, नसों और तंत्रिकाओं के भूतल प्रदान किए गए मॉडल। (एफ) वयस्क माउस टिश्यू में प्रायोगिक ट्यूमर। एचआरईएम डेटा के माध्यम से तीन आभासी वर्गों के सामने वॉल्यूम ने 3 डी मॉडल पेश किया नेक्रोटिक भागों (एरोहेड्स) को नोट करें स्केल बार = 200 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: उदाहरण के तौर पर तंतुमय सामग्री का विज़ुअलाइज़ किया गया। (ए, बी) एचआरईएम खंड अनचाहे, भूरे रंग के पेपर की छवि (बी) (ए) के एक भाग से पता चलता है फाइबर और उनके लुमेन पर ध्यान दें (सी) लेपित कागज के एचआरईएम अनुभाग ध्यान दें कि फाइबर अस्थिर रहता है (डी) वॉल्यूम मूल त्वचीय स्थानापन्न सामग्री का मॉडल प्रस्तुत किया। विभिन्न कैलिबर और फाइबर का रूप ध्यान दें। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

मूवी 1
एनीमेशन 1: वॉल्यूम एक मानव अंगूठा पैड के मोटी त्वचा की रेडर्ड मॉडल ऊतक ब्लॉक का आकार लगभग 4.2 x 2.7 x 2.7 मिमी 3 है वोक्सल का आकार 1.07 x 1.07 x 2 माइक्रोन 3 है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)


एनीमेशन 2: वॉल्यूम रैंडर्ड मॉडल ऑफ़ नेटिव डायमल ऑब्सटिटियल मटेरियल। नमूना का आकार लगभग 1.2 x 0.85 x 0.4 मिमी 3 है । वोक्सल का आकार 0.54 x 0.54 x 2 माइक्रोन 3 है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें।)

Discussion

एचआरईएम एक बेहद मजबूत माइक्रोस्कोपिक पद्धति है जो बायोमेडिसिन और उद्योग 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 में इस्तेमाल किए जाने वाले कार्बनिक पदार्थों के व्यापक स्पेक्ट्रम को देखने के लिए आदर्श है। , 38 , 39 , 40 इसे एक विशेष इमेजिंग साधन के रूप में नियोजित किया जा सकता है, क्योंकि वर्तमान में विकास संबंधी विकारों (डीएमडीडी) के कार्यक्रम 41 , 42 43 , 44 या मल्टीमॉडल इमेजिंग पाइपलाइन 45 के एक एकीकृत भाग के रूप में।

एक पूरी तरह से कामकाजी एचआरईएम डाटा पीढ़ी के उपकरण को पारंपरिक प्रयोगशाला घटकों से इकट्ठा किया जा सकता है और इसमें मोटर चालित माइक्रोोटॉम, माइक्रोस्कोप, मोटर क्रॉस टेबल और उपयुक्त कंप्यूटर 25 वाला कंप्यूटर शामिल है। एक ब्लॉक धारक से लैस एक माइक्रोोटिम का प्रयोग करना महत्वपूर्ण है, जो प्रत्येक अनुभाग के बाद एक निर्धारित स्थिति और ऑप्टिकल मार्ग के अंदर GFP फ़िल्टर क्यूब्स पर पुनप्रश्लेषित रूप से बंद हो जाता है। हालांकि, सर्व-समेकित समाधानों को पूरी तरह से कार्य करना इंडिगो सर्किट जैसे कंपनियों से खरीदा जा सकता है।

एचआरईएम सभी हिस्टोलॉजिकल तकनीकों के समान सीमाओं का सामना करते हैं, सिवाय इसके कि अनुभागिंग या अनुभाग बढ़ते दौरान कोई कलाकृतियों को पेश नहीं किया जाता है। हालांकि, सीमाएं हैं, जो सेक्शनिंग से पहले नमूने की आवश्यकता से दाग़ करने के लिए आवश्यक है औरएम्बेडिंग सामग्री की विशेषताओं से पर्याप्त टिशू विरोधाभास प्राप्त करने के लिए पूरे नमूना के माध्यम से ईओएसिन का प्रवेश आवश्यक है; बहुत घने सामग्री, वसा ऊतकों और अकार्बनिक पदार्थ प्रभावी ढंग से ईोसिन पैठ में बाधा डालते हैं और ऑब्जेक्ट्स के केंद्र में अस्थिर ऊतकों में यह परिणाम होता है। स्पेशल फिक्सिस्टिक्स का इस्तेमाल त्वचा के नमूनों को दागने में मदद करता है, लेकिन समस्या पर पूरी तरह से निपटने के लिए अभी कोई उचित तरीका नहीं है। एक और सीमा यह है कि रेजिन जो सेक्शनिंग के दौरान 2 सेमी से अधिक ब्लॉक को तोड़ते हैं। यह अलग-अलग नमूने और प्रसंस्करण भागों को काटने से आंशिक रूप से बचा जा सकता है।

एम्बेडिंग के दौरान मोल्ड में अनियमित सतहों के साथ छोटे नमूनों या नमूनों की सही स्थिति अक्सर समस्याग्रस्त होती है। Agarose के साथ नमूनों को कवर करना और प्रोटोकॉल में वर्णित agarose ब्लॉकों के प्रसंस्करण आमतौर पर इस समस्या को हल करता है 19 । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, जो भी मदद करता है यदि ब्लॉक को बीच में बिखरेऑनिंग, पहले से कड़े ब्लॉक को अपने धारक से निकालने और इसे एम्बेड किया गया है, वर्णित एम्बेडिंग प्रक्रिया के बाद।

एक सामान्य एचआरईएम डेटा सेट में 500 से 3,000 सिंगल इमेजेस शामिल हैं। इसका संख्यात्मक संकल्प क्रमिक छवियों ( यानी , अनुभाग मोटाई के अनुसार), कैमरा लक्ष्य की विशेषता, और उपयोग किए गए प्रकाशिकी के गुणों के बीच की दूरी से निर्धारित होता है। हमने 1 माइक्रोन और 5 माइक्रोन के बीच अनुभाग मोटाई का इस्तेमाल किया और अच्छे परिणाम प्राप्त किए, हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल 20 , 46 कलाकृतियों से चमचमाते नहीं हैं। इन कलाकृतियों ब्लॉक के अंदर गहरे स्थित गहन ऊतकों के कारण होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप ब्लॉक सतहों पर ऊतक की जानकारी को धुंधला हो जाता है।

कैमरों में 2,560 x 1,920 पिक्सल 2 , 2,048 x 2,048 पिक्सल 2 , और 4,0 9 6,04 पिक्सेल 2 के लक्ष्य के आयाम थे और कॉम्पी थे1.25 एक्स, 2.5 एक्स, 5 एक्स, 10 एक्स, और 20 एक्स उद्देश्य लेंस के साथ इसके परिणामस्वरूप 0.18 x 0.18 माइक्रोन 2 और 5.92 एक्स 5.92 माइक्रोन 2 के बीच संख्यात्मक पिक्सेल आकार मिला, जो टिशू आर्किटेक्चर और सेल आकृतियों के 3 डी विश्लेषण के लिए पर्याप्त साबित हुआ और यहां तक ​​कि नाभिक देखने के लिए भी। उच्च संख्यात्मक संकल्प को देखते हुए, अन्य सेल ऑर्गेनेल भी दृश्यमान होना चाहिए। सरल ईोसिन धुंधला होने के कारण अपर्याप्त विरोधाभास, और उद्देश्यों के ऑप्टिकल गुणों ने नाटकीय संरचनाओं को भेदभाव करने की संभावना को कम कर दिया है। HREM डेटा का अधिकतम वास्तविक रिज़ॉल्यूशन, जो संख्यात्मक एपर्चर लेता है, लगभग 1 x 1 x 1 माइक्रोन 3 है , और इसलिए केवल 3 x 3 x 3 माइक्रोन 3 से बड़े संरचनाओं के प्रभावी भेदभाव की अनुमति देता है।

सभी डिजिटल इमेजिंग तकनीकों के लिए आम समस्या दृश्य के क्षेत्र के आकार के बीच का व्यवहार है, जो कि नमूने के भाग को परिभाषित करती है जिसे प्रदर्शित किया जा सकता हैडी कैमरा लक्ष्य पर, और छवि का संख्यात्मक समाधान। दृश्य के क्षेत्र में जितना बड़ा होगा, अधिकतम अधिकतम संख्यात्मक संकल्प 46 यहां इस्तेमाल की गई एचआरईएम सेटअप, एचआरईएम डेटा की पीढ़ी को 0.74 x 0.74 मिमी 2 ( 20 एक्स उद्देश्य) के बीच में प्रदर्शित किए जाने वाले 0.18 x 0.18 माइक्रोन 2 और 12.12 एक्स 12.12 मिमी 2 (1.25 एक्स उद्देश्य) में एक संख्यात्मक संकल्प में प्रदर्शित की अनुमति देता है। 2.96 x 2. 9 6 माइक्रोन 2 के एक संख्यात्मक संकल्प वैकल्पिक, व्यावसायिक सेट-अप दृश्यों के बड़े क्षेत्रों को प्रदान कर सकते हैं, लेकिन वास्तविक रिज़ॉल्यूशन की लागत पर। इसके बावजूद, वे डीएमडीडी कार्यक्रम 47 के होमपेज पर प्रदर्शित डेटा से स्पष्ट रूप से उत्कृष्ट परिणाम प्रदान करते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने नमूनों को प्रदान करने के लिए एचआरईएम और पेट्रा हेफ़ेटर के विकास में उनके अन्वेषण योगदान के लिए टिम मोहन का धन्यवाद किया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

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References

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Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

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