Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Епископская микроскопия высокого разрешения (HREM) - Простые и надежные протоколы для обработки и визуализации органических материалов

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

Мы предоставляем простые и надежные протоколы для обработки биопсийного материала различных видов, эмбрионов биомедицинских модельных организмов и образцов других органических тканей, чтобы обеспечить генерацию цифровых объемных данных с помощью метода эпископической микроскопии высокого разрешения.

Abstract

Мы предоставляем простые протоколы для генерации цифровых данных объема с помощью метода эрископической микроскопии высокого разрешения (HREM). HREM способен отображать органические материалы с объемами до 5 × 5 × 7 мм 3 в типичных числовых разрешениях между 1 x 1 x 1 и 5 x 5 x 5 мкм 3 . Образцы встроены в метакрилатную смолу и секционированы на микротоме. После каждой секции изображение поверхности блока захватывается цифровой видеокамерой, которая сидит на фотобуфе, подключенной к головке составного микроскопа. Оптическая ось проходит через куб фильтра зеленого флуоресцентного белка (GFP) и выровнена с положением, при котором рычаг держателя бока опускается после каждой секции. Таким образом, производится серия неотъемлемых цифровых изображений, отображающих последующие поверхности блоков. Загрузка такой серии изображений в трехмерное (3D) программное обеспечение визуализации облегчает немедленное преобразование в цифровые данные тома, которые позволяют виртуальнымВ различных ортогональных и наклонных плоскостях и создании объемных и поверхностных компьютерных моделей. Мы представляем три простых, специфичных для ткани протоколов для обработки различных групп органических образцов, включая мыши, цыплят, перепелов, эмбрионов лягушки и зебры, материал для биопсии человека, материал без покрытия и материал для замены кожи.

Introduction

Структурный анализ органических и неорганических материалов является первым шагом в понимании их физических свойств и функций. Основой для такого анализа часто является двумерная (2D) информация, полученная путем тщательного наблюдения гистологических разделов, с использованием множества простых и сложных методов визуализации, которые извлекают детали тканевой архитектуры, морфологии клеток и топологии, молекулярного состава и биомеханических свойств 1 , 2 , 3 . Однако двумерная информация не подходит для исследования пространственно сложных схем. Следовательно, в последние десятилетия было установлено все большее число методов in vivo и ex vivo, которые позволяют генерировать цифровые данные о объемах 4 и многие другие.

Методическим принципом большинства методов генерации данных объема является создание виртуальных стековЦифровых изображений, отображающих разделы, полученные виртуальным или физическим разделением объекта. Если изображения разделов правильно выровнены, это создает громкость, которую можно перерезать в плоскостях виртуальных секций или использовать для создания 3D-моделей с объемным изображением. Популярными методами визуализации людей и более крупных биологических образцов являются магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ). Малые образцы обычно визуализируются с использованием микромагнитного резонансного изображения (μMRI), оптической проекционной томографии (OPT), оптической когерентной томографии (ОКТ), фотоакустической томографии (PAT), методов гистологического секционирования, конфокальной микроскопии и электронной томографии 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Относительно новая технология генерации объемных данных, которая производит цифровые данные образцов малых образцов и гистологических тканей, представляет собой метод HREM, который был разработан в тесном сотрудничестве с Тимом Мохун 18 , 19 . Это простой метод микроскопа, который генерирует цифровые данные объема из смоляного материала, который разделен на микротоме. Данные облегчают детальный анализ структуры тканей и клеточных распределений, а также метрический анализ небольших признаков на промежуточном световом микроскопическом уровне.

HREM создает стеки неотъемлемо выровненных цифровых изображений, которые выглядят как захваченные с eОсин окрашенные гистологические разделы. Контрастность тканей и разрешение данных в отношении поля зрения превосходят контрастность данных, полученных с помощью μCT, μMRI и OPT, но ниже, чем достижимые с помощью конфокальной, легкой и электронной микроскопии. Однако, в отличие от последнего, HREM способен визуализировать образцы с относительными большими объемами до 5 × 5 × 7 мм 3 по гистологическому качеству. Ряд недавних исследований дает подробные характеристики и сравнение преимуществ и недостатков методов одиночной визуализации, и для объективности мы ссылаемся на те, которые содержат дополнительную информацию об их ограничениях и потенциальных областях применения 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

В этом исследовании основное внимание уделяется методу визуализации HREM иОчень простые протоколы для генерации данных HREM из широкого спектра органических материалов, а также примеры их применения. Рабочий процесс для создания данных HREM прост и применяется ко всем материалам, которые могут внедряться в метакрилатную смолу ( рис. 1 ). Тем не менее существуют специфические различия в тканях в образце, которые необходимо учитывать. Поэтому мы предлагаем три стандартных протокола для подготовки различных образцов. Шаги протокола внедрения и формирования данных идентичны для всех из них.

Protocol

Все процедуры были выполнены в соответствии с этическими принципами в Венском медицинском университете.

1. Подготовка образца

  1. Подготовка эмбрионов и тканей эмбрионов (до 5 х 5 х 5 мм 3 )
    1. Закрепите эмбрионы или части эмбрионов в 4% PFA / PBS или фиксаторе Буина при 4 ° C в течение не менее 16-24 часов при постоянном качании.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Можно использовать эмбрионы нескольких видов и различные стадии развития, такие как 48-часовая рыбка данио, 19-часовая цыплята и перепелка, а также эмбрионы пренатальной мыши, которые использовались здесь (см. Представительские результаты ). Образцы собирали и переносили в PBS при комнатной температуре для постановки, до того, как их ввели в фиксацию. При необходимости обрезать образцы с помощью микро-ножниц или скальпелей до фиксации, чтобы вписаться в формы для формования.
    2. Удалите фиксатор и промойте ткань эмбриона в PBS при 4 ° C под постоянным скалистомГ в течение 24 ч (2-3 изменения).
    3. Обезвоживают образцы в 70%, 80%, 90%, 96% этаноле при 4 ° С в течение 2-3 часов каждый. Поместите пробирки, содержащие образцы на ротаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для небольших образцов (<2 x 2 x 2 мм 3 ) время пребывания образца в каждом этаноле может быть уменьшено до 60 минут. Для больших образцов (> 5 x 5 x 5 мм 3 ) его можно продлить до 4 часов.
    4. Выполните следующие шаги инфильтрации под защитным кожухом из вытяжного шкафа.
      1. Подготовьте инфильтрационный раствор, добавив 1,25 г бензоилпероксида (пластифицированный катализатор) и 0,4 г эозина в 100 мл раствора А (более подробно см. Таблицу материалов ). Перемешать это в стакане на магнитной мешалке при 4 ° С до полного растворения эозина и катализатора (2-3 часа).
      2. Поместите образцы в течение 12-24 ч в раствор для инфильтрации. Держите его при температуре 4 ° C при непрерывном качании или вращении. Замените раствор инфильтрации свежим раствором после 3 и 12час
        ПРИМЕЧАНИЕ. Увеличьте время инфильтрации до 48 ч для крупных эмбрионов (> 1 см длины короны / крупинки).
  2. Подготовка образцов тканей для взрослых (до 5 х 5 х 7 мм 3 )
    1. Закрепите ткани в 2% PFA / PBS, содержащей 4% карболовой кислоты, при 4 ° C в течение не менее 3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В этом решении можно зафиксировать образец ткани, состоящий из кожи, печени, поджелудочной железы, почек, щитовидной железы, сердца, полосатой мышцы, мозга, нервов и опухолевых моделей нескольких неонатальных и взрослых людей, грызунов, свиней, плодовых мушек и зебр. А затем обрабатывается для визуализации HREM (мы демонстрируем фиксацию образцов, см. Представительские результаты ). Акцизируйте образцы тканей скальпелями, ножницами или ударами биопсии и перенесите их в фиксацию. Для фиксации нервной ткани используют 4% PFA / PBS.
    2. Удалите фиксатор и промойте ткань под проточной водой в течение 3-6 часов.
    3. Обезвоживают образцы путем последующегоВ них 70%, 80%, 90%, 96% этанола, смешанные с 0,4 г эозина на 100 мл (по 2-3 часа каждый). Храните растворы с образцами при 4 ° C при постоянном качании или на ротаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для небольших образцов (<2 x 2 x 2 мм 3 ) время пребывания образца в каждом этаноле может быть уменьшено до 60 минут. Для больших образцов (> 5 x 5 x 5 мм 3 ) он может быть увеличен до 4-8 часов.
    4. Выполните все следующие шаги инфильтрации под защитным кожухом дымохода.
      1. Подготовьте инфильтрационный раствор, добавив 1,25 г бензоилпероксида (пластифицированный катализатор) и 0,4 г эозина в 100 мл раствора А (более подробно см. Таблицу материалов ). Перемешать в стакане на магнитной мешалке при 4 ° С до полного растворения эозина и катализатора (2-3 часа).
      2. Поместите образцы в раствор для инфильтрации в течение 24 - 36 часов. Держите его при температуре 4 ° C при непрерывном качании или вращении. Замените раствор инфильтрации свежим раствором после 3 и12 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Для больших образцов (> 5 x 5 x 5 мм 3 ) время инфильтрации увеличивается до 48 часов.
  3. Подготовка других органических материалов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Обрежьте заменители и бумагу нужного размера обычными ножницами. Никакой фиксации не требуется.
    1. Пропустить шаги фиксации, стирки и обезвоживания.
    2. Выполните все следующие шаги инфильтрации под защитным кожухом дымохода.
      1. Подготовьте инфильтрационный раствор, добавив 1,25 г бензоилпероксида (пластифицированный катализатор) и 0,4 г эозина в 100 мл раствора А (более подробно см. Таблицу материалов ). Перемешать в стакане при 4 ° С на магнитной мешалке до тех пор, пока эозин и катализатор не будут полностью растворены (2-3 часа).
      2. Поместите образцы в раствор для инфильтрации в течение 3 - 12 часов. Держите его при температуре 4 ° C при непрерывном качании или вращении. Замените раствор инфильтрации свежим раствором через 1 и 2 - 4 часа.
      </ Li>

2. Встраивание

ПРИМЕЧАНИЕ. Выполняйте все действия под защитным перчатком с вытяжкой.

  1. Подготовьте раствор свежей инфильтрации, как описано выше (шаг 1.1.4.1). Добавить 4 мл раствора B (подробности см. В таблице материалов ) в 100 мл инфильтрационного раствора для приготовления раствора для встраивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Если требуется точная ориентация образца в формовочных формах и возможность одновременного встраивания нескольких образцов, замедлите полимеризацию исходного раствора, поставив стакан в ледяную баню.
  2. Используйте литейные поддоны (подробнее см. Таблицу материалов ) с формами, имеющими обычный объем 6 x 8 x 5 мм 3 или 13 x 19 x 5 мм 3 , или индивидуальные формы с объемами до 8 x 10 x 15 мм 3 ( рисунок 2 ).
  3. Заполните пресс-формы раствором для заливки и перенесите образец в форму, используяложка. Во время переноса убедитесь, что образец полностью покрыт раствором для внедрения, чтобы избежать захвата воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это можно сделать при комнатной температуре, если сразу же после сбора образцов и раствора для встраивания из холодильника.
    1. Ориентируйте образец внутри формы с помощью игл или пинцетов.
    2. Как только раствор для вложения начинает становиться вязким, поместите держатель блока (см. Таблицу материалов ) поверх формы и добавьте раствор для заливки через центральное отверстие держателя блока до тех пор, пока основание держателя блока не будет покрыто 1 - 2 Мм раствора для встраивания.
    3. Запечатайте лоток для литьевой чашки, накрыв его жидким парафином и подождите, пока он не затвердеет. В качестве альтернативы поместите второй лоток для формовочной машины вверх дном на лоток для формовочной чашки с образцами и заклейте его липкой лентой на герметичность.
  4. Позвольте блокам закончить полимеризацию, сохранив запечатанные лотки для литьевых чашек для 1 -2 дня при комнатной температуре.
  5. Для обработки после полимеризации поместите лотки для формовочной машины с полимеризованными блоками в стандартную лабораторную печь и запекайте при температуре 70-80 ° C в течение минимум 1 - 2 дней, пока они не станут темно-красными. Соберите лотки из печи и удалите блоки из формы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выпечка может проводиться в нормальных условиях окружающей среды. Лоток для литья под давлением, который обеспечивает герметичное уплотнение на первой фазе после встраивания, можно удалить, чтобы можно было проверить цвет смолы через 10 часов. Сразу после выпечки смола мягкая, и блоки могут быть легко удалены из лотка формовочной чашки. В течение 2 - 3 часов они твердые и могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

3. Генерация данных

ПРИМЕЧАНИЕ. Используемый здесь прототип 18 , 25 HREM содержит следующие элементы: (i) вращающийся микротом с держателем блокаКоторый останавливается после каждого разреза в верхней точке поворота. (Ii) Стандартный, одноразовый микротомный нож, твердый металл, профиль D (подробности см. В таблице материалов ). (Iii) головка микроскопа с флуоресцентным соединением с объективным револьвером и кубом GFP-фильтра (возбуждение 470/40, эмиссионный фильтр 525/50) на его оптической оси. Оптическая ось расположена перпендикулярно свежесрезанной поверхности блока, установленного на микротоме, и удерживается устройством, которое допускает движение вверх и вниз. (Iv) Моторизованный кросс-стол с микротомом. Таблица может быть сдвинута в направлении оптической оси и сбоку. (V) Цифровая видеокамера, прикрепленная к микроскопу с флуоресцентным соединением. (Vi) Монохромный источник света (470 нм). (Vii) Компьютер, подключенный к камере, с программным обеспечением для создания данных (подробности см. В таблице ).

  1. Процедура
    1. Укажите регион интереса.
      1. Использовать стандартную лабораторию liGht (см. Таблицу материалов ) для направления белого света наклонно к поверхности блока.
      2. Определите контуры внедренного материала при его проектировании на поверхность блока. Укажите область интереса и более позднюю область обзора на поверхности блока, используя ручку или лезвие бритвы.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг является обязательным для определения степени поля обзора до секционирования.
    2. Определите поле обзора.
      1. Установите блок смолы с образцом на микротоме.
      2. Переместите держатель блока в его положение остановки (верхняя точка поворота для отклонения держателя блока).
      3. Запустите программное обеспечение для цифровой камеры и создания данных и приобретите живое изображение.
      4. Выберите объектив с соответствующим увеличением, чтобы охватить область интереса, указанную на поверхности блока.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно используются цели с увеличением 2.5X, 5X, 10X, 20X и числовые апертуры между 0,07 и 0,40. Переместите оптику вверх и вниз, а микротома в поперечном направлении - с помощью моторизованного кросс-стола, пока область интереса не совпадает с полем зрения, отображаемым на экране компьютера.
    3. Фокус.
      1. Выполняйте пошаговое ручное разделение до тех пор, пока не станут видны первые структуры образца.
      2. Расположите поверхность блока в плоскости фокусировки оптики, перемещая микротом в направлении оптической оси.
      3. Выберите толщину секции; Рекомендуется толщина секции от 0,5 до 5 мкм.
  2. Генерация и обработка данных
    1. Запустите программную процедуру, которая организует секционирование и захват изображений. Следуйте документированной инструкции программного обеспечения для захвата изображений.
    2. Остановите программу программного обеспечения и поместите скользящий слайд перед поверхностью блока, как только образец будет полностью разделен.
    3. Захват изображения в интерактивном режиме для последующей калибровкиТион.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это необходимо делать каждый раз, когда цель используется в новой конфигурации.
    4. Преобразуйте серию изображений в 8-битные серые изображения in.jpg.
    5. Загрузите серию изображений в программное обеспечение 3D-визуализации и настройте контрасты.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Преобразование изображений и трехмерную визуализацию можно выполнять с помощью различных коммерческих или свободно доступных стандартных пакетов программного обеспечения в соответствии с инструкциями соответствующего программного обеспечения.

Representative Results

HREM генерирует ряд неотъемлемо выровненных цифровых изображений с контрастами, подобными изображениям гистологических разделов, покрытых гематоксилином / эозином. В отличие от изображений 2D-секций, стопки изображений HREM позволяют визуализировать и анализировать структуру ткани, морфологию и топологию широкого разнообразия органических материалов в 3D. Высокая контрастность часто облегчает быструю и простую трехмерную визуализацию объемно-отображаемых компьютерных моделей и полуавтоматические результаты контура для создания моделей, созданных на поверхности.

Размер данных HREM варьируется в зависимости от размера цели камеры, режима захвата изображения (8, 12, 16 бит, шкалы серого, цвета) и количества изображений с одним блоком. Меньшие наборы данных из 1000 изображений 8-бит.jpg с серой шкалой размером 2048 пикселей x 2048 пикселей имеют размер около 900 МБ. Большие наборы данных из 3000 изображений с 8-бит.jpg серой шкалой 4096 pXix x 4096 пикселей имеют объемы около 20 ГБ.

Представленные протоколы просты и надежны, и в течение последнего десятилетия они были использованы для генерации данных HREM многих разных образцов. Секция протокола 1.1 была оптимизирована для обработки целых эмбрионов биомедицинских модельных организмов длиной до 1 см и образцов эмбриональной ткани размером до 5 × 5 × 5 мм 3 ; Мы использовали этот метод для получения данных HREM эмбрионов следующих видов: мыши ( Mus musculus) , цыпленка ( Gallus gallus ), рыбы зебры ( Danio rerio ), перепела ( Coturnix coturnix) , африканской когтистой лягушки ( Xenopus laevis ), лошади ( Equus ferus caballus ), молочная ошибка ( Oncopeltus fasciatus ), крокодил ( крокодил ) и осьминог ( Octopus vulgaris ). Данные всех видов были превосходного качества ( например , рис. 3 )

3 и использовался для визуализации образцов ткани Кожи, печени, поджелудочной железы, почек, щитовидной железы, сердца, полосатой мышцы, мозга, нервов и опухолевых моделей, собранных у людей ( Homo sapiens ), мышей ( Mus musculus ), крыс ( Rattus norvegicus ), свиней ( Sus scrofa domestica ) Фуро ), фруктовая муха ( Drosophila melanogaster ) и зебра ( Danio rerio ). В то время как результаты были превосходными с большинством образцов ( например , Рисунок 4 , Анимация 1 ), очень центральные части кожи (с эпидермисом) и образцы головного мозга размером более 3 х 3 х 3 мм 3 часто оставались неокрашенными из-за недостаточного проникновения эозина через Эти ткани.

Протокол sEction 1.3 была оптимизирована для обработки волокнистого органического материала и использовалась для визуализации структуры волокна из мелованной бумаги, бумаги без покрытия, природного дермального материала-заменителя и материала, заменяемого дермальным заменителем. Эти образцы были легко и быстро обработаны. Данные непокрытой бумаги и большинства заменителей кожи были хорошего качества ( рисунок 5 , анимация 2 ). Возникли проблемы при обработке бумаги с покрытием, когда неорганический материал препятствовал проникновению эозина. Другая проблема возникала при обработке заменителей кожи на основе агара, потому что они частично усваивались инфильтрационным раствором.

Рисунок 1
Рисунок 1: Рабочий процесс. Шаги, показанные в красных ящиках, требуют модификаций в соответствии с характеристиками образца. Шаги в зеленых коробках - это те, которыеОдинаковы во всех образцах. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Индивидуальные формы. Формы можно адаптировать, разрезав отверстие в исходную форму, вставив колбу пипетки Пастера и запечатав ее с помощью модельного материала. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Примерно визуализированные эмбрионы. (A, B) Мышечный эмбрион, собранный в эмбриональный день, E = 9,5. Изображение раздела HREM показано в (A) (B) . (C) Виртуальный сагиттальный разрез через объемную модель шейки эмбриона мыши E15.5. (D) Зародыш цыплят на стадии развития Гамбургер Гамильтон (HH) 18. Поверхностная модель люмина сердечно-сосудистых компонентов в сочетании с объемной визуализацией всех тканей эмбрионов. Шкала шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Примерные визуальные образцы для взрослых тканей. (A) Часть изображения раздела HREM через человеческий нерв. Inlay более подробно показывает часть изображения. (B) Часть изображения раздела HREM через свиную печень. Обратите внимание на nuclei. (C) Часть изображения раздела HREM человеческой лимфатической ткани. (D, E) Толстая кожа человеческого пальца. Объем 3D-модели всей биопсии. (D) Поверхностные модели артерий, вен и нервов перед виртуальной резекцией через данные HREM (E) . (F) Экспериментальная опухоль во взрослой ткани мыши. Объем визуализировал 3D-модель перед тремя виртуальными разделами через данные HREM. Обратите внимание на некротические части (наконечники стрел). Шкала шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5: Примерно визуализированный волокнистый материал. (A, B) изображение раздела HREM без покрытия, коричневая бумага. (В) (A) . Обратите внимание на волокна и их просвет. (C) секции HREM бумаги с покрытием. Обратите внимание, что волокна остаются неокрашенными. (D) Объемная модель местного дермального заменителя. Обратите внимание на различный калибр и форму волокон. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1
Анимация 1: Объемная модель толстой кожи человеческого пальца. Размер блока ткани составляет приблизительно 4,2 x 2,7 x 2,7 мм 3 . Размер Voxel составляет 1,07 x 1,07 x 2 мкм 3 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)


Анимация 2: Объемная модель родного дермального заменителя. Размер образца составляет примерно 1,2 х 0,85 х 0,4 мм 3 . Размер Voxel составляет 0,54 x 0,54 x 2 мкм 3 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Discussion

HREM представляет собой высокопрочный микроскопический метод, который идеально подходит для визуализации широкого спектра органических материалов, используемых в биомедицине и промышленности 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Его можно использовать в качестве эксклюзивного метода визуализации, который в настоящее время используется программой 41 Механизмы развития нарушений (DMDD) 43 , 44 или как интегральная часть мультимодальных конвейеров изображений 45 .

Полностью функционирующее устройство генерации данных HREM может быть собрано из обычных лабораторных компонентов и содержит моторизованный микротом, микроскоп, поперечный стол с механическим управлением и компьютер с соответствующим программным обеспечением 25 . Крайне важно использовать микротом, снабженный держателем блока, который воспроизводимо останавливается после каждой секции в определенном положении и кубиков фильтра GFP внутри оптического пути. Тем не менее, полностью функционирующие всеохватывающие решения можно приобрести у таких компаний, как Indigo Scientific.

HREM сталкивается с теми же ограничениями, что и все гистологические методы, за исключением того, что артефакты не вводятся при секционировании или разделении. Однако существуют ограничения, которые являются следствием необходимости окрашивания образцов перед разделением иОт характеристик материала погружения. Проникновение эозина по всему образцу требуется для получения достаточного контраста ткани; Очень плотный материал, жировые ткани и неорганические вещества эффективно препятствуют проникновению эозина, что приводит к образованию неокрашенных тканей в центре объектов. Использование специальных фиксаторов помогает окрашивать образцы кожи, но до сих пор нет надлежащего метода для полного преодоления проблемы. Другим ограничением является то, что смолы, которые блокируют более 2 см, как правило, ломаются во время секционирования. Этого можно частично избежать, разрезая образцы и обрабатывающие детали по отдельности.

Правильное позиционирование небольших образцов или образцов с нерегулярными поверхностями в формах во время внедрения часто является проблематичным. Покрытие образцов агарозой и обработка блоков агарозы, как описано в протоколе, обычно решает эту проблему 19 . Альтернативный подход, который также помогает, если блоки прерываются во время сектыЧтобы удалить уже затвердевший блок из своего держателя и вставить его заново, следуя описанной процедуре внедрения.

Типичный набор данных HREM содержит от 500 до 3000 одиночных изображений. Его численное разрешение определяется расстоянием между последовательными изображениями ( т. Е. Толщиной раздела), характеристикой цели камеры и свойствами используемой оптики. Мы использовали толщину сечения от 1 до 5 мкм и добились хороших результатов, хотя представленные протоколы не полностью устраняют блеск от артефактов 20 , 46 . Эти артефакты вызваны сильно окрашенными тканями, расположенными глубоко внутри блока, что приводит к размыванию информации о ткани на поверхности блока.

Камеры имели целевые размеры 2,560 x 1,920 пикселей 2 , 2,048 x 2,048 пикселя 2 и 4096 x 4096 пикселей 2 и были комбинированнымиС объективами 1.25X, 2.5X, 5X, 10X и 20X. Это привело к тому, что числовые размеры пикселей составляли от 0,18 до 0,18 мкм 2 и 5,92 х 5,92 мкм 2 , что оказалось достаточным для трехмерного анализа структуры ткани и форм ячеек и даже для визуализации ядер. Учитывая высокое числовое разрешение, следует также видеть другие клеточные органеллы. Недостаточные контрасты благодаря простому окрашиванию эозином и оптическим свойствам целей значительно уменьшают возможность дискриминации структур. Максимальное истинное пространственное разрешение данных HREM, которое учитывает числовую апертуру, составляет приблизительно 1 x 1 x 1 мкм 3 и, следовательно, допускает эффективную дискриминацию структур, превышающих приблизительно 3 x 3 x 3 мкм 3 .

Общей проблемой для всех цифровых технологий визуализации является компромисс между размером поля зрения, который определяет часть образца, который может отображатьсяD на цели камеры и числовое разрешение изображения. Чем больше поле зрения, тем ниже максимально возможное числовое разрешение 46 . Используемая здесь настройка HREM позволяет генерировать данные HREM с полем обзора между 0,74 x 0,74 мм 2 (объектив 20X), отображаемым с числовым разрешением 0,18 x 0,18 мкм 2 и 12,12 x 12,12 мм 2 (объектив 1,25X), отображаемый в Числовое разрешение 2,96 x 2,96 мкм 2 . Альтернативные, коммерциализированные настройки могут обеспечить большие поля зрения, но ценой истинного разрешения. Тем не менее, они обеспечивают отличные результаты, о чем свидетельствуют данные, представленные на домашней странице программы DMDD 47 .

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Тиму Мохун за его вклад в разработку HREM и Петру Хеффетер за предоставление образцов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Tags

Биология развития выпуск 125 епископство визуализация 3D моделирование эмбрион биопсия человек мышь цыпленок рыба зебры лягушка
Епископская микроскопия высокого разрешения (HREM) - Простые и надежные протоколы для обработки и визуализации органических материалов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter