Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك.

Abstract

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة لتوليد البيانات حجم الرقمية مع عالية الدقة ابيسكوبي المجهري (هريم) الأسلوب. هريم قادر على تصوير المواد العضوية مع وحدات التخزين تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في قرارات رقمية نموذجية بين 1 × 1 × 1 و 5 × 5 × 5 ميكرون 3 . يتم تضمين العينات في راتنج ميثاكريلات ومقسم على مشراح. بعد كل قسم يتم التقاط صورة من سطح كتلة مع كاميرا الفيديو الرقمية التي يجلس على فوتوتوب متصلا رئيس المجهر المركب. المحور البصري يمر عبر بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) مرشح مكعب ويتماشى مع الموقف، الذي الذراع بوك حامل يأتي للراحة بعد كل قسم. وبهذه الطريقة، يتم إنتاج سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها، وعرض الأسطح كتلة لاحقة. تحميل مثل هذه السلسلة صورة في ثلاثي الأبعاد (3D) برنامج التصور يسهل التحويل الفوري إلى البيانات حجم الرقمية، والتي تسمح الظاهرية قإكتينغ في مختلف الطائرات المتعامدة والمائلة وإنشاء حجم والسطحية نماذج الكمبيوتر المقدمة. نقدم ثلاثة بروتوكولات محددة، الأنسجة محددة لمعالجة مجموعات مختلفة من العينات العضوية، بما في ذلك الماوس والفرخ والسمان والضفدع والأجنة زيبرا الأسماك، والمواد خزعة الإنسان، ورقة غير مصقول ومواد استبدال الجلد.

Introduction

التحليل الهيكلي للمواد العضوية وغير العضوية هو الخطوة الأولى في فهم الخواص الفيزيائية والوظيفة. أساس هذا التحليل في كثير من الأحيان هو ثنائي الأبعاد المعلومات (2D) المكتسبة من قبل مراقبة دقيقة من الأقسام النسيجية، مع مجموعة متنوعة من أساليب التصوير بسيطة ومتطورة التي تستخرج تفاصيل بنية الأنسجة، مورفولوجيا الخلية والطوبولوجيا والتكوين الجزيئي والخصائص الميكانيكية الحيوية 1 ، 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن المعلومات 2D غير مناسبة للبحث الترتيبات المعقدة مكانيا. وبالتالي فإن عددا متزايدا من في الجسم الحي والطرق خارج الجسم الحي التي تسمح بإنشاء بيانات حجم الرقمية في العقود الأخيرة 4 وغيرها الكثير قيد التطوير.

المبدأ المنهجي لمعظم أساليب توليد البيانات حجم هو توليد مداخن الظاهريمن الصور الرقمية التي تعرض المقاطع المكتسبة عن طريق التقسيم الظاهري أو المادي للكائن. إذا تم محاذاة الصور القسم بشكل صحيح، وهذا يخلق وحدة تخزين، والتي يمكن إعادة المقطع في طائرات القسم الظاهري، أو استخدامها لخلق 3D سطح وحجم النماذج المقدمة. التقنيات الشائعة لتصور البشر وعينات بيولوجية أكبر هي التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (بيت) والتصوير المقطعي بالانبعاث أحادي الفوتون (سبيكت). وعادة ما تصور العينات الصغيرة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المغنطيسي (التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي الضوئي البصري (أوبت) والتصوير المقطعي البصري التماسك (أوكت) والتصوير المقطعي الضوئي (بات) والطرق القائمة على التقطيع النسيجي والمجهر البؤري والتصوير المقطعي بالإلكترون 5 و 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 .

وهناك طريقة جديدة نسبيا لتوليد البيانات الحجمية، والتي تنتج بيانات رقمية من العينات الصغيرة وعينات الأنسجة النسيجية هي طريقة هريم، الذي تم تطويره بالتعاون الوثيق مع تيم موهون 18 ، 19 . بل هو تقنية المجهر بسيطة تستند، الذي يولد البيانات حجم الرقمية من الراتنج جزءا لا يتجزأ من المواد التي مقطوع على مشراح. البيانات تسهيل تحليل مفصل لهندسة الأنسجة والتوزيعات الخلية وكذلك تحليل متري من الميزات الصغيرة على المستوى المجهري ضوء المتوسطة.

تنتج هريم مجموعات من الصور الرقمية المحاذاة بطبيعتها والتي تظهر كما لو تم التقاطها من eأوسين أقسام نسيجية ملطخة. تباين الأنسجة ودقة البيانات فيما يتعلق مجال الرؤية تتجاوز تلك التي تنتجها مع μCT، μMRI، والأراضي الفلسطينية المحتلة، ولكن أقل من ذلك يمكن تحقيقه مع متحد البؤر، ورقة ضوء والمجهر الإلكتروني 20 . ومع ذلك، وعلى النقيض من هذا الأخير، هرم قادر على تصور العينات مع كميات كبيرة نسبيا تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في الجودة النسيجية. وهناك عدد من الدراسات الحديثة توفر خصائص مفصلة ومقارنات من مزايا وعيوب تقنيات التصوير واحد و، من أجل الموضوعية، نشير إلى تلك لمزيد من المعلومات بشأن القيود والمجالات المحتملة من التطبيقات 4 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 .

وتركز هذه الدراسة على طريقة التصوير هرم ويهدف إلى توفيروبروتوكولات بسيطة جدا لتوليد البيانات هرم من مجموعة واسعة من المواد العضوية، فضلا عن أمثلة لتطبيقها. سير العمل لإنشاء بيانات هرم بسيطة ويسري على جميع المواد التي يمكن تضمينها في راتنج ميثاكريلات ( الشكل 1 ). ومع ذلك هناك اختلافات محددة الأنسجة في إعداد العينة، التي تحتاج إلى النظر فيها. ولذلك فإننا نقدم ثلاثة بروتوكولات القياسية لإعداد عينات مختلفة. التضمين وخطوات بروتوكول توليد البيانات متطابقة لكل منهم.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية في جامعة فيينا الطبية.

1. إعداد العينة

  1. إعداد الأجنة والأجنة الجنين (تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 )
    1. إصلاح الأجنة أو أجزاء من الأجنة في 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني أو تثبيتي بوين في 4 درجات مئوية لمدة 16-24 ساعة على الأقل تحت هزاز مستمر.
      ملاحظة: الأجنة من عدة أنواع ومراحل تنموية مختلفة يمكن استخدامها، مثل الزرد 48 ساعة، 19-h الفرخ والسمان، وكذلك الأجنة الماوس قبل الولادة، والتي استخدمت هنا (انظر ممثل النتائج ). تم حصاد العينات ونقلها إلى برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة للتدريج، قبل وضعها في تثبيتي. إذا لزم الأمر، وتقليم العينات مع مقص الصغيرة أو مشرط قبل التثبيت لتناسب قوالب التضمين.
    2. إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة الجنين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية تحت روكين ثابتز لمدة 24 ساعة (2-3 تغييرات).
    3. تجفف العينات في 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية لمدة 2 - 3 ساعات لكل منهما. وضع أنابيب تحتوي على عينات على المدورة.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (<2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. للعينات الكبيرة (> 5 × 5 × 5 مم 3 )، يمكن تمديده إلى 4 ساعات.
    4. تنفيذ الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية.
      1. إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك هذا في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح).
      2. وضع العينات لمدة 12-24 ساعة في حل تسلل. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و 12ح.
        ملاحظة: تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة للأجنة الكبيرة (> 1 سم تاج / طول رمي).
  2. إعداد عينات الأنسجة الكبار (تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 )
    1. إصلاح الأنسجة في 2٪ بفا / برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ حمض الكربوليك في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام على الأقل.
      ملاحظة: عينة الأنسجة الناجمة عن الجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم من العديد من حديثي الولادة والبالغين البشر والقوارض والخنازير والذباب الفاكهة، وأسماك حمار وحشي يمكن أن تكون ثابتة في هذا الحل ومن ثم معالجتها للتصوير هرم (نحن إثبات تثبيت العينات؛ انظر ممثل النتائج ). استئصال عينات الأنسجة مع المباضع، مقص أو اللكمات الخزعة ونقلها مباشرة إلى تثبيتي. لتثبيت استخدام الأنسجة العصبية 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني.
    2. إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة تحت تشغيل مياه الصنبور لمدة 3-6 ح.
    3. يذوى العينات من قبل مكان لاحقفي 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول، مختلطة مع 0.4 غرام يوزين لكل 100 مل (2 - 3 ساعات لكل منهما). الحفاظ على الحلول مع العينات في 4 درجات مئوية تحت هزاز مستمر أو على المدورة.
      ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (<2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. لعينات كبيرة (> 5 × 5 × 5 مم 3 )، ويمكن تمديدها إلى 4-8 ح.
    4. تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية.
      1. إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح).
      2. وضع عينات في محلول تسلل لمدة 24 - 36 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و12 ح.
        ملاحظة: للحصول على عينات كبيرة (> 5 × 5 × 5 مم 3 ) تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة.
  3. إعداد المواد العضوية الأخرى
    ملاحظة: تقليم بدائل الجلد والورق إلى الحجم المطلوب مع مقص العادية. لا حاجة إلى تثبيت.
    1. تخطي خطوات التثبيت والغسيل والجفاف.
    2. تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية.
      1. إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب في 4 درجات مئوية على لوحة التحريك المغناطيسي حتى يوزين ومحفز يتم حلها تماما (2 - 3 ح).
      2. عينات مكان في حل تسلل لمدة 3-12 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 1 و 2 - 4 ح.
      </ لى>

2. التضمين

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية.

  1. إعداد حل تسلل جديدة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4.1). إضافة 4 مل سولوتيون B (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) إلى 100 مل حل تسلل لإعداد الحل التضمين.
    ملاحظة: إذا كان التوجه الدقيق للعينة في قوالب التضمين مطلوب والسماح لتضمين عدة عينات في موازاة ذلك، وإبطاء البلمرة من الحل الأسهم عن طريق وضع الكأس في حمام الجليد.
  2. استخدام صواني كوب صب (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) مع قوالب وجود حجم روتيني من 6 × 8 × 5 مم 3 أو 13 × 19 × 5 مم 3 ، أو قوالب مخصصة مع وحدات تخزين تصل إلى 8 × 10 × 15 ملم 3 ( الشكل 2 ).
  3. ملء قوالب مع حل التضمين ونقل العينة في القالب باستخدامملعقة. أثناء النقل ضمان أن العينة مغطاة بالكامل مع تضمين الحل لتجنب محاصرة الهواء.
    ملاحظة: يمكن القيام بذلك في درجة حرارة الغرفة، إذا بدأت مباشرة بعد جمع العينات وحل التضمين من الثلاجة.
    1. توجيه العينة داخل القالب باستخدام الإبر أو ملقط.
    2. حالما يبدأ الحل التضمين يصبح لزج، وضع حامل كتلة (انظر جدول المواد ) على رأس القالب وإضافة حل التضمين من خلال الثقب المركزي لحامل كتلة حتى يتم تغطية قاعدة حامل كتلة مع 1 - 2 مم من حل التضمين.
    3. ختم علبة صب صب من خلال تغطيتها مع السائل البارافين الشمع وانتظر حتى تصلب. بدلا من ذلك وضع علبة كوب صب الثانية رأسا على عقب على علبة كوب صب مع عينات وختم عليه مع شريط لاصق للهواء واقية.
  4. السماح كتل لإنهاء البلمرة عن طريق تخزين صواني كأس صب مختومة ل 1 -2 أيام في درجة حرارة الغرفة.
  5. بالنسبة إلى معالجة ما بعد البلمرة، ضع صواني الكوب الصب مع الكتل المبلمرة في فرن مختبر معياري وقم بخبزها عند 70 - 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن يوم واحد إلى يومين حتى تصبح حمراء داكنة. جمع الصواني من الفرن وإزالة الكتل من القالب.
    ملاحظة: يمكن أن يتم الخبز في ظل الظروف البيئية العادية. علبة كؤوس صب الصب، التي تضمن ختم الهواء في المرحلة الأولى بعد التضمين، يمكن إزالتها للسماح لفحص لون الراتنج بعد 10 ساعة. مباشرة بعد الخبز، الراتنج لينة والكتل يمكن إزالتها بسهولة من علبة صب صب. في غضون 2 - 3 ساعات هم من الصعب ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.

3. توليد البيانات

ملاحظة: يتضمن النموذج هرم 18 ، 25 المستخدمة هنا العناصر التالية: (1) مشراح دوار مع حامل كتلةالذي يتوقف بعد كل قطع في نقطة تحول العليا. (2) القياسية، غير القابل للتصرف مشراح سكين، المعادن الصلبة، الشخصية D (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). (إي) رئيس المجهر مضان مجمع مع مسدس موضوعي و غفب مرشح مكعب (الإثارة 470/40، فلتر الانبعاثات 525/50) في محورها البصري. يتم ترتيب المحور البصري عمودي على سطح قطع حديثا من كتلة شنت على مشراح ويقف من قبل الجهاز الذي يسمح الحركة صعودا وهبوطا. (4) الجدول عبر الآلية بمحرك مشراح. يمكن تحويل الجدول في اتجاه المحور البصري وأفقيا. (v) كاميرا فيديو رقمية تعلق على المجهر المركب الفلورسنت. (6) مصدر الضوء أحادي اللون (470 نانومتر). '7' الحاسوب المتصل بالكاميرا، مع برمجيات لتوليد البيانات (للاطلاع على التفاصيل، انظر جدول المواد ).

  1. إجراء
    1. حدد المنطقة التي تهمك.
      1. استخدام مختبر القياسية لي(انظر جدول المواد ) لتوجيه الضوء الأبيض بشكل غير مباشر إلى سطح الكتلة.
      2. تحديد الخطوط العريضة للمادة المضمنة كما أنها مشاريع لسطح الكتلة. تشير إلى المنطقة ذات الاهتمام ومجال الرؤية في وقت لاحق على سطح كتلة باستخدام القلم أو شفرة حلاقة.
        ملاحظة: هذه الخطوة إلزامية لتحديد مدى مجال الرؤية قبل التقسيم.
    2. تحديد مجال الرؤية.
      1. جبل كتلة الراتنج مع عينة على مشراح.
      2. نقل حامل كتلة إلى موقف وقفها (نقطة تحول العليا من رحلة حامل كتلة).
      3. بدء تشغيل الكاميرا الرقمية وبرامج توليد البيانات، والحصول على صورة حية.
      4. اختيار عدسة موضوعية، مع التكبير المناسب لتغطية منطقة الاهتمام المشار إليها على سطح الكتلة.
        ملاحظة: الأهداف مع التكبير 2.5X، 5X، 10X، 20X والفتحات الرقمية بين 0.07 و 0.40 تستخدم عادة. نقل البصرية صعودا وهبوطا ومشراح أفقيا باستخدام الجدول الصليب الآلية حتى تتطابق المنطقة ذات الاهتمام مع مجال الرؤية المعروضة على شاشة الكمبيوتر.
    3. التركيز.
      1. أداء خطوة بخطوة دليل سيكتيونينغ حتى الهياكل الأولى من العينة تصبح مرئية.
      2. ترتيب سطح كتلة في مستوى التركيز من البصرية، عن طريق تحريك مشراح في اتجاه المحور البصري.
      3. اختيار سمك القسم. ويوصى سمك القسم من 0.5 إلى 5 ميكرون.
  2. توليد البيانات ومعالجتها
    1. بدء البرنامج الروتيني الذي ينظم التقسيم والتقاط الصور. اتبع التعليمات الموثقة من برامج التقاط التصوير.
    2. وقف البرامج الروتينية ووضع شريحة التحجيم أمام سطح كتلة بمجرد أن مقطوع تماما العينة.
    3. التقاط صورة تفاعلية للحصول على معايرة في وقت لاحقنشوئها.
      ملاحظة: يجب أن يتم ذلك في كل مرة يتم استخدام الهدف في ترتيب رتبت حديثا.
    4. تحويل سلسلة الصورة إلى 8 بت الصور الرمادي مقياس in.jpg.
    5. تحميل سلسلة صورة في برنامج التصور 3D وضبط التناقضات.
      ملاحظة: يمكن أن يتم تحويل الصورة والتصور 3D مع مختلف البرامج التجارية أو المتاحة بحرية حزم البرمجيات القياسية، وفقا للتعليمات من البرنامج المعني.

Representative Results

هريم يولد سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها مع تناقضات مماثلة لصور الهيماتوكسيلين / يوسين أقسام النسيجية الملون. على عكس الصور القسم 2D، مداخن من الصور هريم تسمح لتصور وتحليل بنية الأنسجة، التشكل، وطوبولوجيا مجموعة واسعة من المواد العضوية في 3D. التباين العالي في كثير من الأحيان يسهل التصور 3D سريعة وبسيطة من نماذج الكمبيوتر التي تم تقديمها حجم ونتائج كفاف شبه التلقائي لتوليد نماذج سطح المقدمة.

يختلف حجم البيانات هرم وفقا لحجم الهدف الكاميرا، ووضع التقاط الصور (8، 12، 16 بت، مقياس الرمادية واللون) وعدد من الصور كتلة واحدة الوجه. مجموعات بيانات أصغر من 1000 8-bit.jpg صور مقياس رمادي من 2،048 بكسل × 2،048 بكسل حجمها حوالي 900 مب. مجموعات بيانات أكبر من 3000 8-bit.jpg الصور مقياس رمادي من 4،096 ص بكسل × 4،096 بكسل لديها حجم ما يقرب من 20 غيغابايت.

البروتوكولات المقدمة هي بسيطة وقوية، وخلال العقد الماضي، كانوا يعملون لتوليد بيانات هرم للعديد من العينات المختلفة. تم تحسين القسم بروتوكول 1.1 لمعالجة الأجنة كاملة من الكائنات الحية النموذجية الطبية مع طول يصل إلى 1 سم وعينات الأنسجة الجنين مع بعد تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 ؛ استخدمنا هذه الطريقة لإنتاج بيانات هرم من الأجنة من الأنواع التالية: الفأر ( موس موسولوس) ، فرخ ( غالوس غالوس )، زيبرا فيش ( دانيو ريريو )، السمان ( كوترنيكس كوترنيكس) ، الضفدع الأفريقي المخلب ( زينوبوس ليفيس ) إكوس فيروس كابالوس )، علة اللبن ( أونكوبيلتوس فاسياتوس )، التمساح ( كروكوديليا )، والأخطبوط ( الأخطبوط فولغاريس ). وكانت بيانات جميع الأنواع ذات نوعية ممتازة (على سبيل المثال ، الشكل 3 )

أس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> تم تحسين القسم بروتوكول 1.2 لمعالجة عينات الأنسجة والأنسجة البالغة بأبعاد تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 ، وتستخدم لتصوير عينات الأنسجة من والجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم التي تحصد من البشر ( هومو سابينز ) والفئران ( موس موسولوس ) والجرذان ( راتوس نورفيجيكوس ) والخنازير ( سوس سكروفا دوميستيكا ) فيريت ( مستيلا فورو )، ذبابة الفاكهة ( ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر )، والأسماك زيبرا ( دانيو ريريو ). في حين كانت النتائج ممتازة مع معظم العينات (على سبيل المثال ، الشكل 4 ، الرسوم المتحركة 1 )، الأجزاء المركزية جدا من الجلد (مع البشرة) وعينات الدماغ أكبر من 3 × 3 × 3 مم 3 في كثير من الأحيان بقيت غير ملوثين بسبب عدم كفاية اختراق يوسين من خلال هذه الأنسجة.

البروتوكول sوكان الأمثل 1.3 إكتيون لمعالجة المواد العضوية الليفية وتستخدم لتصور بنية الألياف من الورق المطلي، ورقة غير مصقول، المواد بديلا الجلد الأصلي والخلايا الجذعية المصنفة الجلد المواد بديلا. وكانت هذه العينات سهلة وسريعة لمعالجة. كانت البيانات من الورق غير المصقول ومعظم بدائل الجلد ذات نوعية جيدة ( الشكل 5 ، الرسوم المتحركة 2 ). حدثت مشاكل في معالجة الورق المطلي، عندما أعاقت المواد غير العضوية اختراق يوزين. حدثت مشكلة أخرى عند معالجة بدائل الجلد على أساس أجار لأنها هضمت جزئيا من قبل حل تسلل.

شكل 1
الشكل 1: سير العمل. الخطوات المعروضة في الصناديق الحمراء تتطلب تعديلات وفقا لخصائص العينة. الخطوات في الصناديق الخضراء هي تلك التيهي مماثلة في جميع العينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: قوالب مخصصة. قوالب يمكن تكييفها عن طريق قطع حفرة في القالب الأصلي، وإدراج لمبة من ماصة باستور وختم ذلك مع المواد النمذجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: الأجنة تصور بشكل غير عادي. (A، B) الجنين الماوس تحصد في يوم الجنينية، E = 9.5. تظهر صورة قسم هريم في (A) (B) . (C) قسم سهمي الظاهري من خلال حجم نموذج المقدمة من الرقبة من جنين الماوس E15.5. (D) الجنين الفرخ في هامبورجر التنموية هاميلتون (ه) المرحلة 18. نموذج السطح من لومينا من مكونات القلب والأوعية الدموية جنبا إلى جنب مع حجم تقديم جميع أنسجة الجنين. مقياس الحانات = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: عينات الأنسجة الكبار تصور بشكل غير عادي. (A) جزء من صورة قسم هرم من خلال العصب البشري. ترصيع يظهر مقطع من الصورة بمزيد من التفصيل. (B) جزء من صورة قسم هرم من خلال الكبد الخنازير. لاحظ nuclei. (C) جزء من صورة قسم هرم من الأنسجة اللمفاوية البشرية. (D، E) جلد سميك من لوحة الإبهام الإنسان. حجم المقدمة نموذج 3D من الخزعة بأكملها. (D) نماذج سطح المقدمة من الشرايين والأوردة والأعصاب أمام استئصال الظاهري من خلال بيانات هرم (E) . (F) الورم التجريبي في الأنسجة الماوس الكبار. حجم تقديم نموذج 3D أمام ثلاثة أقسام افتراضية من خلال بيانات هريم. لاحظ أجزاء نخرية (السهام). مقياس الحانات = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: المواد الليفية المرئية بشكل غير عادي. (A، B) هريم صورة القسم من غير مصقول، ورقة البني. (ب) ترونغ> يظهر قسم من (A) . لاحظ الألياف وتجويفها. (C) قسم هريم من الورق المطلي. لاحظ أن الألياف لا تزال غير ملوثين. (D) حجم تقديم نموذج من المواد البدلة الجلد الأصلي. لاحظ عيار مختلف وشكل من الألياف. الحانات مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيلم 1
الرسوم المتحركة 1: حجم المقدمة نموذج من الجلد السميك من وسادة الإبهام الإنسان. حجم كتلة الأنسجة حوالي 4.2 × 2.7 × 2.7 مم 3 . حجم فوكسل هو 1.07 × 1.07 × 2 ميكرون 3 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

كلاس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> فيلم 2
الرسوم المتحركة 2: حجم تقديم نموذج من المواد الأصلية الجلد البديل. حجم العينة حوالي 1.2 × 0.85 × 0.4 مم 3 . حجم فوكسل هو 0.54 × 0.54 × 2 ميكرون 3 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

هريم هو طريقة مجهرية قوية للغاية التي هي مثالية لتصور مجموعة واسعة من المواد العضوية المستخدمة في الطب الحيوي والصناعة 18 و 21 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ، 38 ، 39 ، 40 . ويمكن استخدامه كطريقة تصوير حصرية، كما تستخدم حاليا من قبل آليات اضطرابات النمو (دمد) برنامج 41 ، 42 43 ، 44 ، أو كجزء تكاملي من خطوط الأنابيب التصوير المتعدد الوسائط 45 .

ويمكن تجميع جهاز توليد البيانات هرم يعمل بشكل كامل من مكونات المختبر التقليدية ويضم مشراح الآلية، المجهر، طاولة الصليب الآلية، وجهاز كمبيوتر مع البرامج المناسبة 25 . فمن الأهمية بمكان لاستخدام مشراح مجهزة حامل كتلة التي تتكاثر بشكل متكرر بعد كل قسم في موقف محدد ومكعبات مرشح غفب داخل المسار البصري. ومع ذلك، يمكن شراء حلول شاملة تماما من شركات مثل إنديجو سسينتيفيك.

يواجه هرم نفس القيود مثل جميع التقنيات النسيجية، إلا أنه لا يتم إدخال أي القطع الأثرية أثناء التقسيم أو قسم التركيب. ومع ذلك، هناك قيود، والتي تنتج عن ضرورة وصمة عار العينات قبل التقسيم ومن خصائص مادة التضمين. مطلوب اختراق يوزين من خلال العينة بأكملها للحصول على تناقضات الأنسجة كافية. مواد كثيفة جدا، والأنسجة الدهنية والمواد غير العضوية تعيق بشكل فعال يوزين الاختراق وهذا يؤدي إلى الأنسجة غير ملوثين في وسط الكائنات. باستخدام مثبتات خاصة يساعد على وصمة عار عينات الجلد، ولكن لا يزال هناك أي طريقة مناسبة للتغلب على المشكلة تماما. هناك قيود أخرى هي أن الراتنجات التي تمنع أعلى من 2 سم تميل إلى كسر أثناء التقسيم. ويمكن تجنب ذلك جزئيا عن طريق قطع العينات وأجزاء المعالجة بشكل منفصل.

تحديد المواقع الصحيحة من العينات الصغيرة أو العينات مع الأسطح غير النظامية في القوالب أثناء التضمين غالبا ما يكون إشكالية. تغطي العينات مع الاغاروز وتجهيز كتل الاغاروز كما هو موضح في البروتوكول عادة ما يحل هذه المسألة 19 . نهج بديل، الذي يساعد أيضا إذا كتل كسر خلال سكتيعلى إزالة كتلة صلبة بالفعل من حاملها وتضمينها من جديد، بعد إجراء التضمين وصفها.

وتتألف مجموعة بيانات نموذجية هرم من 500 إلى 3000 صورة مفردة. يتم تحديد قرارها العددي عن طريق المسافة بين الصور المتعاقبة ( أي ، من خلال سمك القسم)، وخاصية الهدف الكاميرا، وخصائص البصريات المستخدمة. استخدمنا سمك القسم بين 1 ميكرون و 5 ميكرون وحققت نتائج جيدة، على الرغم من أن البروتوكولات المقدمة لا القضاء تماما مشرقة من التحف 20 ، 46 . وتنتج هذه التحف عن طريق الأنسجة الملطخة بشكل مكثف تقع في عمق كتلة، مما أدى إلى طمس معلومات الأنسجة على أسطح كتلة من قبل.

كانت الكاميرات تستهدف أبعاد 2،560 × 1،920 بكسل 2 ، 2،048 × 2،048 بكسل 2 ، و 4،096 × 4،096 بكسل 2 وكانت كومبينيد مع 1.25X، 2.5X، 5X، 10X، و 20X العدسات الموضوعية. وأدى هذا إلى أحجام بكسل رقمية بين 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 5.92 × 5.92 ميكرون 2 ، والتي أثبتت أنها كافية لتحليل 3D من بنية الأنسجة والأشكال الخلية، وحتى لتصور نوى. ونظرا لارتفاع القرار الرقمي، يجب أن تكون عضيات الخلايا الأخرى مرئية كذلك. تناقضات غير كافية بسبب تلطيخ يوسين بسيطة، والخصائص البصرية للأهداف يقلل بشكل كبير من إمكانية التمييز الهياكل. القرار المكاني الحقيقي الأقصى للبيانات هرم، الذي يأخذ في الاعتبار الفتحة الرقمية، هو تقريبا 1 × 1 × 1 ميكرون 3 ، وبالتالي يسمح فقط التمييز الفعال للهياكل أكبر من حوالي 3 × 3 × 3 ميكرون 3 .

وهناك مشكلة مشتركة لجميع تقنيات التصوير الرقمي هو التبادل بين حجم مجال الرؤية، والذي يحدد جزء من العينة التي يمكن عرضهاd على هدف الكاميرا، والقرار الرقمي للصورة. وكلما كان مجال الرؤية أكبر، كلما انخفض القرار الرقمي الأقصى 46 . يسمح الإعداد هرم المستخدمة هنا توليد بيانات هرم مع مجال الرؤية بين 0.74 × 0.74 مم 2 (20X الهدف) عرضها في قرار رقمي 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 12.12 × 12.12 مم 2 (1.25X الهدف) المعروضة في وهو قرار رقمي 2.96 × 2.96 ميكرون 2 . يمكن للمجموعات البديلة والمتجانسة أن توفر مجالات أوسع من وجهات النظر، ولكن على حساب الحل الحقيقي. ومع ذلك، فإنها توفر نتائج ممتازة، كما يتضح من البيانات المعروضة على الصفحة الرئيسية لبرنامج دمد 47 .

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

المؤلفين أشكر تيم موهون لمساهماته إنفالوبال في تطوير هرم والبتراء هفيتر لتقديم العينات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 125، إبيسكوبيك، والتصوير، 3D، النمذجة، الجنين، خزعة، الإنسان، والفأر، والفرخ، والأسماك زيبرا، الضفدع
عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter