Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

Vi leverer enkle og robuste protokoller til behandling af biopsi materiale af forskellige arter, embryoner af biomedicinske modelorganismer og prøver af andre organiske væv for at muliggøre digital volumen data generation med den højopløselige episkopiske mikroskopi metode.

Abstract

Vi leverer enkle protokoller til generering af digitale volumedata med HREM-metoden med højopløsnings-episkopisk mikroskopi. HREM kan forestille organiske materialer med volumener op til 5 x 5 x 7 mm 3 i typiske numeriske opløsninger mellem 1 x 1 x 1 og 5 x 5 x 5 μm 3 . Prøverne er indlejret i methacrylatharpiks og snittet på et mikrotom. Efter hvert afsnit indfanges et billede af blokoverfladen med et digitalt videokamera, der sidder på fotobåndet, der er forbundet med det sammensatte mikroskophoved. Den optiske akse passerer gennem et grønt fluorescerende protein (GFP) filterkube og er justeret med en position, hvor bockholderarmen hviler efter hver sektion. På denne måde produceres en serie af iboende justerede digitale billeder, der viser efterfølgende blokoverflader. Indlæser en sådan billedserie i tredimensionel (3D) visualiseringssoftware muliggør den øjeblikkelige konvertering til digitale volumedata, hvilket tillader virtuelle sEctioning i forskellige ortogonale og skrå planer og oprettelsen af ​​volumen og overfladede computermodeller. Vi præsenterer tre enkle, vævsspecifikke protokoller til behandling af forskellige grupper af økologiske prøver, herunder mus, chick, vagtel, frø og zebrafiskembryoer, humant biopsiemateriale, ubestrøget papir og hududskiftningsmateriale.

Introduction

Strukturel analyse af organiske og uorganiske materialer er det første skridt i at forstå deres fysiske egenskaber og funktion. Grundlaget for en sådan analyse er ofte todimensionale (2D) informationer opnået ved omhyggelig observation af histologiske sektioner med en række simple og sofistikerede billeddannelsesmetoder, der ekstraherer detaljer af vævarkitektur, cellemorfologi og topologi, molekylær sammensætning og biomekaniske egenskaber 1 , 2 , 3 . 2D-information er imidlertid ikke egnet til at undersøge rumligt komplekse arrangementer. Derfor er et stigende antal in vivo og ex vivo metoder, der tillader dannelsen af ​​digitale volumedata, etableret i de sidste årtier 4 og mange flere er under udvikling.

Det metodiske princip for de fleste volumedatagenereringsmetoder er dannelsen af ​​virtuelle stablerAf digitale billeder, der viser sektioner opnået ved virtuel eller fysisk sektion af et objekt. Hvis sektionsbillederne er korrekt justeret, skaber dette et volumen, der kan genopdeles i virtuelle sektionsplaner eller bruges til at oprette 3D overflade- og volumengengiverede modeller. Populære teknikker til visualisering af mennesker og større biologiske prøver er magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronemissionstomografi (PET) og single-photon emission computed tomography (SPECT). Små eksemplarer visualiseres som regel ved hjælp af mikromagnetisk resonansbilleddannelse (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiske sektionsbaserede metoder, konfokalmikroskopi og elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

En relativt ny volumen datagenereringsteknik, der producerer digitale data fra små prøver og histologiske vævsprøver, er HREM-metoden, som blev udviklet i tæt samarbejde med Tim Mohun 18 , 19 . Det er en simpel mikroskopbaseret teknik, der genererer digitale volumedata fra harpiksindlejret materiale, der er snittet på en mikrotome. Dataene lette detaljeret analyse af vævsarkitektur og celledistribution samt metrisk analyse af små funktioner på et mellemliggende lysmikroskopisk niveau.

HREM producerer stabler af iboende justerede digitale billeder, der vises som om optaget fra eOsinfarvede histologiske sektioner. Vævskontrast og dataopløsning i forhold til synsfeltet overstiger dataene produceret med μCT, μMRI og OPT, men er lavere end det, der kan opnås med konfokal, lysark og elektronmikroskopi 20 . I modsætning til sidstnævnte er HREM imidlertid i stand til at visualisere prøver med relativt store volumener på op til 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. En række nyere undersøgelser giver detaljerede karakteriseringer og sammenligninger af fordele og ulemper ved de enkelte billeddannelsesteknikker, og vi henviser af hensyn til objektivitet til dem for yderligere information om deres begrænsninger og potentielle anvendelsesområder 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Denne undersøgelse fokuserer på HREM billeddannelsesmetoden og sigter mod at giveMeget enkle protokoller til generering af HREM data fra et bredt spektrum af organiske materialer samt eksempler på deres anvendelse. Arbejdsstrømmen til oprettelse af HREM-data er enkel og gælder for alle materialer, der kan indlejres i methacrylatharpiks ( figur 1 ). Der er dog vævsspecifikke forskelle i prøvepræparation, der skal overvejes. Vi leverer derfor tre standardprotokoller til fremstilling af forskellige prøver. Indlejrings- og dataproduktionsprotokolstrin er ens for dem alle.

Protocol

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med etiske retningslinjer ved det medicinske universitet i Wien.

1. Prøveforberedelse

  1. Forberedelse af embryoner og embryonvæv (op til 5 x 5 x 5 mm 3 )
    1. Fiks embryoner eller dele af embryoerne i 4% PFA / PBS eller Bouins fixativ ved 4 ° C i mindst 16-24 timer under konstant rocking.
      BEMÆRK: Embryoner af flere arter og forskellige udviklingsstadier kan anvendes, såsom 48-h zebrafisk, 19 h kylling og vagtel, og også prenatale musembryoer, som blev anvendt her (se repræsentative resultater ). Prøverne blev høstet og overført til PBS ved stuetemperatur til scanning, inden de blev sat i fikseringsmiddel. Om nødvendigt, trim prøverne med mikro-saks eller skalpeller forud for fiksering for at passe ind i indlejringsformene.
    2. Fjern fiksativet og vask embryovævet i PBS ved 4 ° C under konstant rockinG i 24 timer (2-3 ændringer).
    3. Dehydrere prøverne i 70%, 80%, 90%, 96% ethanol ved 4 ° C i 2 - 3 timer hver. Placer rør, der indeholder prøverne på en rotator.
      BEMÆRK: For små prøver (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan den tid, en prøve hviler i hver ethanol, reduceres til 60 minutter. For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan den forlænges til 4 timer.
    4. Udfør følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker.
      1. Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for mere detaljer, se Materialebeskrivelse ). Rør dette i et bægerglas på en magnetisk omrøringsplade ved 4 ° C, indtil eosin og katalysator er fuldt opløst (2 - 3 timer).
      2. Placer prøverne i 12 - 24 timer i infiltrationsopløsningen. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 3 og 12h.
        BEMÆRK: Forlæng infiltrationstiden til 48 timer for store embryoner (> 1 cm kron / rump længde).
  2. Klargøring af vævsprover (op til 5 x 5 x 7 mm 3 )
    1. Fix vævene i 2% PFA / PBS indeholdende 4% carbolsyre ved 4 ° C i mindst 3 dage.
      BEMÆRK: Vævsprøve som følge af hud-, lever-, bugspytkirtlen, nyren, skjoldbruskkirtlen, hjerte-, striated muskel-, hjerne-, nerver- og tumormodeller fra flere neonatale og voksne mennesker, gnavere, svin, frugtfly og zebrafisk kan fastgøres i denne opløsning Og derefter behandlet til HREM billedbehandling (vi demonstrerer fastsættelse af prøverne, se repræsentative resultater ). Punk de vævsprøver med skalpeller, saks eller biopsi slag og direkte overføre dem til fikserende. Til fastgørelse af nervesvæv bruger 4% PFA / PBS.
    2. Fjern fiksativet og vask vævet under rindende vand i 3-6 timer.
    3. Dehydrere prøverne ved senere placeringIndgiv dem i 70%, 80%, 90%, 96% ethanol, blandet med 0,4 g eosin pr. 100 ml (2-3 h hver). Opbevar opløsningerne med prøver ved 4 ° C under konstant rocking eller på rotator.
      BEMÆRK: For små prøver (<2 x 2 x 2 mm 3 ) kan den tid, en prøve hviler i hver ethanol, reduceres til 60 minutter. For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan den forlænges til 4-8 timer.
    4. Udfør alle følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker.
      1. Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for flere detaljer, se tabel over materialer ). Rør et bægerglas på en magnetisk omrøringsplade ved 4 ° C, indtil eosinet og katalysatoren er fuldt opløst (2 - 3 timer).
      2. Anbring prøver i infiltrationsopløsning i 24 - 36 timer. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 3 og12 timer.
        BEMÆRK: For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) forlænges infiltrationstiden til 48 timer.
  3. Forberedelse af andet organisk materiale
    BEMÆRK: Trim hudsubstitutter og papir til den ønskede størrelse med almindelig sakse. Ingen fiksering er nødvendig.
    1. Spring over fiksering, vask og dehydreringstrin.
    2. Udfør alle følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker.
      1. Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for flere detaljer, se tabel over materialer ). Rør et bægerglas ved 4 ° C på en magnetisk omrøringsplade, indtil eosin og katalysator er fuldt opløst (2 - 3 timer).
      2. Anbring prøver i infiltrationsopløsning i 3-12 timer. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 1 og 2 - 4 timer.
      </ Li>

2. Embedding

BEMÆRK: Udfør alle trin under en kogeplade med beskyttelseshandsker.

  1. Forbered frisk infiltrationsopløsning som beskrevet ovenfor (trin 1.1.4.1). Tilsæt 4 ml opløsning B (for detaljer, se tabel over materialer ) til 100 ml infiltrationsopløsning for at forberede indlejringsopløsningen.
    BEMÆRK: Hvis der kræves præcis orientering af prøven i indlejringsformene, og for at indlejre flere prøver parallelt, sænk polymeriseringen af ​​stamopløsningen ved at sætte bægeret i et isbad.
  2. Brug støbekopperbræt (for detaljer, se Materialebeskrivelse ) med forme, der har et rutinemængde på 6 x 8 x 5 mm 3 eller 13 x 19 x 5 mm 3 eller tilpassede forme med mængder på op til 8 x 10 x 15 mm 3 ( figur 2 ).
  3. Fyld forme med indlejringsopløsning og overfør prøven ind i støbeformenen ske. Under overførslen skal du sikre, at prøven er fuldt dækket med indlejringsopløsning for at undgå luftindfangning.
    BEMÆRK: Dette kan gøres ved stuetemperatur, hvis det påbegyndes straks efter samling af prøverne og indlejringsopløsningen fra køleskabet.
    1. Orient prøven inde i formen ved hjælp af nåle eller tang.
    2. Så snart indlejringsopløsningen begynder at blive viskøs, skal du placere en blokholder (se Tabel af Materialer ) oven på formen og tilsæt indlejringsopløsning gennem blokholderens centrale hul, indtil blokholderens bund er dækket med 1 - 2 Mm af indlejringsopløsning.
    3. Tæt støbebeholderen ved at dække den med flydende paraffinvoks og vent til den er hærdet. Alternativt placeres en anden støbekopbakke opad på formstøbtbakken med prøver og forsegles den med tape til lufttæt.
  4. Lad blokke afslutte polymerisering ved at lagre de forseglede støbekopper bakker til 1 -2 dage ved stuetemperatur.
  5. Til efterpolymeriseringsbehandling placeres støbeformbakken med de polymeriserede blokke i en standard laboratorieovn og bages ved 70 - 80 ° C i mindst 1 til 2 dage, indtil de bliver mørkerøde. Saml bakkerne fra ovnen og fjern blokken fra formen.
    BEMÆRK: Bagning kan ske under normale miljøforhold. Dækstøbeskålbakken, som sikrer lufttæt forsegling i den første fase efter indlejring, kan fjernes for at muliggøre kontrol af farven af ​​harpiksen efter 10 timer. Umiddelbart efter bagning er harpiksen blød og blokkerne kan let fjernes fra støbebeholderen. Inden for 2 - 3 timer er de hårde og kan opbevares ved stuetemperatur i flere måneder.

3. Data Generation

BEMÆRK: HREM prototypen 18 , 25, der anvendes her, omfatter følgende elementer: (i) Roterende mikrotom med en blokholderDer stopper efter hver snit ved dens øverste vendepunkt. (Ii) Standard, ikke-disponibel mikrotomkniv, hårdmetal, profil D (for detaljer, se Materialebeskrivelse ). (Iii) Hoved af fluorescensforbindelsesmikroskop med objektivrevolver og en GFP-filterkube (excitation 470/40; emissionsfilter 525/50) i sin optiske akse. Den optiske akse er anbragt vinkelret på den friskskårne overflade af en blok monteret på mikrotomet og holdes af en indretning, der tillader op- og nedadgående bevægelse. (Iv) Motoriseret tværbord med mikrotome. Bordet kan forskydes i retning af den optiske akse og sideværts. (V) Digitalt videokamera fastgjort til fluorescerende forbindelsesmikroskop. (Vi) Monokrom lyskilde (470 nm). (Vii) Computer tilsluttet kameraet, med data generation software (for detaljer, se Materialebeskrivelse ).

  1. Procedure
    1. Angiv region af interesse.
      1. Brug standard laboratorium liGht kilde (se Tabel af materialer ) til at rette hvidt lys skråt til blokoverfladen.
      2. Identificer konturerne af det indlejrede materiale, som det projekterer til blokoverfladen. Angiv region af interesse og senere synsfelt på blokoverfladen ved hjælp af en pen eller knivblad.
        BEMÆRK: Dette trin er obligatorisk til at definere omfanget af synsfeltet inden sektionering.
    2. Definer synsfeltet.
      1. Monter harpiksblokken med prøve på mikrotomen.
      2. Flyt blokholderen til stoppositionen (øverste vendepunkt for blokholderens udflugt).
      3. Start digitalkameraet og data generation software, og erhverve et levende billede.
      4. Vælg en objektiv linse med en passende forstørrelse for at dække det område af interesse, der er angivet på blokoverfladen.
        BEMÆRK: Mål med forstørrelser 2.5X, 5X, 10X, 20X og numeriske aperturer mellem 0,07 og 0,40 bruges almindeligt. Flyt optikken opad og nedad og mikrotomen sideværts ved hjælp af det motoriserede tværbord, indtil interessepunktet matcher synsfeltet, der vises på computerskærmen.
    3. Fokus.
      1. Udfør trinvis trin manuel sektion, indtil de første strukturer i prøven bliver synlige.
      2. Arranger blokoverfladen i optikets fokusplan ved at flytte mikrotomet i retning af den optiske akse.
      3. Vælg sektionstykkelse; Snittykkelser fra 0,5 til 5 μm anbefales.
  2. Datagenerering og -behandling
    1. Start software rutine, der orkestrerer snitning og billedoptagelse. Følg den dokumenterede vejledning til billedoptagelsesprogrammet.
    2. Stop software rutine og sæt et skalereglid foran blokoverfladen, så snart prøven er fuldstændigt snittet.
    3. Optag et billede interaktivt for senere kalibreringtion.
      BEMÆRK: Dette skal gøres hver gang et mål anvendes i en nyligt arrangeret opsætning.
    4. Konverter billedserien til 8 bit gråskala billeder in.jpg format.
    5. Indlæs billedserien i 3D visualiseringssoftware og juster kontraster.
      BEMÆRK: Billedkonvertering og 3D-visualisering kan udføres med forskellige kommercielt eller frit tilgængelige standardpakker, som følger med den respektive software.

Representative Results

HREM genererer serie af iboende justerede digitale billeder med kontraster, der ligner billeder af hæmatoxylin / eosinfarvede histologiske sektioner. I modsætning til 2D-sektionsbilleder tillader stabler af HREM-billeder visualisering og analyse af vævsarkitektur, morfologi og topologi af et bredt udvalg af organiske materialer i 3D. Den høje kontrast letter ofte hurtig og simpel 3D-visualisering af lydgengivne computermodeller og semiautomatiske konturfund til generering af overfladegengiverede modeller.

HREM-dataens størrelse varierer afhængigt af kameraets mål, billedoptagelsestilstanden (8, 12, 16 bit, grå skala, farve) og antallet af enkeltbloksidebilleder. Mindre datasæt med 1.000 8-bit.jpg gråskala billeder på 2.048 pixels x 2.048 pixels har en størrelse på omkring 900 MB. Større datasæt med 3.000 8-bit.jpg gråskala billeder på 4.096 pIxel x 4.096 pixel har en mængde på ca. 20 GB.

De fremlagte protokoller er enkle og robuste, og i det sidste årti var de ansat til at generere HREM-data fra mange forskellige enheder. Protokolafsnit 1.1 blev optimeret til behandling af hele embryoner af biomedicinske modelorganismer med en længde på op til 1 cm og embryonvævsprover med en dimension på op til 5 x 5 x 5 mm 3 ; Vi anvendte denne metode til fremstilling af HREM-data af embryoner af følgende arter: mus ( Mus musculus) , kylling ( Gallus gallus ), zebrafisk ( Danio rerio ), vagtel ( Coturnix coturnix) , afrikansk klovn ( Xenopus laevis ), hest Equus ferus caballus ), milkweed bug ( Oncopeltus fasciatus ), krokodille ( Crocodylia ) og blæksprutte ( Octopus vulgaris ). Dataene for alle arter var af fremragende kvalitet ( fx figur 3 )

3 og anvendt til visualisering af vævsprøver af Hud, lever, bugspytkirtlen, nyren, skjoldbruskkirtel, hjerte, striated muskel, hjerne, nerver og tumormodeller høstet fra mennesker ( Homo sapiens ), mus ( Mus musculus ), rotter ( Rattus norvegicus ), svin ( Sus scrofa domestica ) ferret ( Mustela Furo ), frugtflyve ( Drosophila melanogaster ) og zebrafisk ( Danio rerio ). Mens resultaterne var fremragende med de fleste prøver ( fx Figur 4 , Animation 1 ) forblev de meget centrale dele af huden (med epidermier) og hjerneprøver større end 3 x 3 x 3 mm 3 ofte ufarvede på grund af utilstrækkelig penetration af eosin gennem Disse væv.

Protokol sEktion 1.3 blev optimeret til behandling af fibrøst organisk materiale og anvendt til visualisering af fiberarkitekturen af ​​belagt papir, ikke-belagt papir, nativt dermal substitutionsmateriale og stamceller-frøet dermal substitutionsmateriale. Disse prøver var nemme og hurtige at behandle. Dataene på det ikke-coatede papir og de fleste hudsubstitutter var af god kvalitet ( Figur 5 , Animation 2 ). Der opstod problemer ved behandling af det coatede papir, da det uorganiske materiale hindrede indtrængning af eosin. Et andet problem opstod ved behandling af hudsubstitutterne på basis af agar, fordi de blev delvist fordøjet af infiltreringsopløsningen.

figur 1
Figur 1: Workflow. Trin vist i de røde kasser kræver ændringer i overensstemmelse med stikprøveegenskaber. Trin i de grønne kasser er dem derEr ens i alle prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Tilpassede former. Forme kan tilpasses ved at skære et hul i den originale form, indsætte pæren af ​​en Pasteur pipette og forsegle den med modelleringsmateriale. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Eksempelvis visualiserede embryoer. (A, B) Musembryo høstet på embryonisk dag, E = 9,5. HREM sektionsbillede er vist i (A) (B) . (C) Virtuel sagittal sektion gennem en volumengengivet model af halsen af ​​et E15.5 musembryo. (D) Chick embryo ved Hamburger Hamilton (HH) fase 18. Overflademodel af armaturen i de kardiovaskulære komponenter kombineret med volumengengivelse af alle embryonvæv. Skalestænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Eksempelvis visualiserede Voksne Vævsprøver. (A) En del af et HREM sektionsbillede gennem en menneskelig nerve. Inlay viser en del af billedet mere detaljeret. (B) En del af en HREM sektion billede gennem svine leveren. Bemærk nuclei. (C) Del af et HREM sektionsbillede af humant lymfatisk væv. (D, E) Tykkelse af en menneskelig tommelplade. Volumen gengivet 3D-model af hele biopsien. (D) Overfladede modeller af arterier, vener og nerver foran en virtuel resektion gennem HREM data (E) . (F) Eksperimentel tumor i voksen musvæv. Volumen gengivet 3D-model foran tre virtuelle sektioner gennem HREM-data. Bemærk de nekrotiske dele (arrowheads). Skalestænger = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5
Figur 5: Eksempelvis visualiseret fibermateriale. (A, B) HREM sektion billede af ubelagt, brunt papir. (B) (A) . Bemærk fibrene og deres lumen. (C) HREM sektion af belagt papir. Bemærk, at fibrene forbliver ufarvede. (D) Volumengengivet model af indfødt dermal substitutionsmateriale. Bemærk de forskellige kaliber og form af fibrene. Skalestænger = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Film 1
Animation 1: Lydgengivelse af tykt hud af en menneskelig tommelstang. Størrelsen af ​​vævsblokken er ca. 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel størrelse er 1,07 x 1,07 x 2 um 3 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)


Animation 2: Volume Rendered Model af Native Dermal Substitute Material. Størrelsen af ​​prøven er ca. 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel størrelse er 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Discussion

HREM er en meget robust mikroskopisk metode, der er ideel til visualisering af et bredt spektrum af organiske materialer anvendt i biomedicin og industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 38 , 39 , 40 . Det kan anvendes som en eksklusiv billeddannelsesmodalitet, som i øjeblikket anvendes af DMDD-programmets mekanismer 41 , 42 43 , 44 eller som en integrerende del af multimodale billeddannelsesrørledninger 45 .

Et fuldt fungerende HREM-datagenereringsapparat kan samles fra konventionelle laboratoriekomponenter og omfatter et motoriseret mikrotom, mikroskop, motoriseret tværsnit og en computer med passende software 25 . Det er kritisk at bruge et mikrotome udstyret med en blokholder, der reproducerbart stopper efter hver sektion i en bestemt position og GFP filterkuber inde i den optiske vej. Imidlertid kan fuldt fungerende all inclusive-løsninger købes hos virksomheder som Indigo Scientific.

HREM står over for de samme begrænsninger som alle histologiske teknikker, bortset fra at ingen artefakter introduceres under sektion eller sektionsmontering. Der er imidlertid begrænsninger, som skyldes nødvendigheden af ​​at plette prøver før snitning ogFra embeddedmaterialets egenskaber. Penetration af eosin gennem hele prøven er påkrævet for at opnå tilstrækkelige vævskontraster; Meget tæt materiale, fedtvæv og anorganiske stoffer hindrer effektivt eosinindtrængning, og dette resulterer i ufarvet væv i midten af ​​genstandene. Brug af specielle fixativer hjælper pletter hudprøver, men der er stadig ingen ordentlig metode til fuldt ud at overvinde problemet. En anden begrænsning er, at harpikser, der blokerer højere end 2 cm, har tendens til at bryde under snitning. Dette kan delvist undgås ved at skære prøverne og behandle dele separat.

Korrekt positionering af små prøver eller prøver med uregelmæssige overflader i forme under indlejring er ofte problematisk. Omsætning af prøverne med agarose og behandling af agaroseblokkene som beskrevet i protokollen løser normalt dette problem 19 . En alternativ tilgang, som også hjælper, hvis blokke brydes under sektionenAt fjerne den allerede hærdede blok fra holderen og indlejre den på ny efter den beskrevne indlejringsprocedure.

Et typisk HREM datasæt omfatter 500 til 3.000 enkeltbilleder. Dens numeriske opløsning bestemmes af afstanden mellem de successive billeder ( dvs. af sektionstykkelse), karakteristikken for kameraets mål og egenskaberne af den anvendte optik. Vi anvendte snittykkelser mellem 1 μm og 5 μm og opnåede gode resultater, selv om de præsenterede protokoller ikke fuldstændigt eliminerer skinner fra artefakter 20 , 46 . Disse artefakter er forårsaget af intenstfarvede væv placeret dybt inde i blokken, hvilket resulterer i uskarphed af vævsinformation på blokfladerne ved.

Kameraerne havde måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixels 2 , 2.048 x 2.048 pixels 2 og 4.096 x 4.096 pixels 2 og var combiNed med objektiver med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X og 20X. Dette resulterede i numeriske pixelstørrelser mellem 0,18 x 0,18 μm 2 og 5,92 x 5,92 μm 2 , hvilket viste sig at være tilstrækkeligt til 3D analyse af vævarkitektur og celleformer og endog til visualisering af kerner. I betragtning af den høje numeriske opløsning skal andre cellelegemer også være synlige. Utilstrækkelige kontraster på grund af simpel eosinfarvning, og de optiske egenskaber af målene reducerer dramatisk muligheden for at diskriminere strukturer. Den maksimale sande rumlige opløsning af HREM-dataene, der tager højde for den numeriske blænde, er ca. 1 x 1 x 1 μm 3 og tillader derfor kun effektiv diskrimination af strukturer større end ca. 3 x 3 x 3 μm 3 .

Et fælles problem for alle digitale billedteknikker er afvejningen mellem størrelsen af ​​synsfeltet, som definerer den del af prøven, der kan visesD på kameraets mål og den numeriske opløsning af billedet. Jo større synsfelt, jo lavere er den maksimale mulige numeriske opløsning 46 . HREM-opsætningen, der anvendes her, tillader generering af HREM-data med et synsfelt mellem 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) vist i en numerisk opløsning på 0,18 x 0,18 μm 2 og 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25 x objektiv) vist i En numerisk opløsning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternative, kommercielle opsætninger kan give større synsfelter, men på bekostning af ægte opløsning. Ikke desto mindre giver de fremragende resultater, som det fremgår af de data, der vises på DMDD-programmets hjemmeside 47 .

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Tim Mohun for sine invalubale bidrag til udvikling af HREM og Petra Heffeter for at give prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Tags

Udviklingsbiologi Episkopisk billeddannelse 3D modellering embryo biopsi menneske mus kylling zebra fisk frø
High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter