Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Høyoppløselig episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkle og robuste protokoller for behandling og visualisering av organiske materialer

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC, Medical University of Vienna

Summary

Vi gir enkle og robuste protokoller for behandling av biopsi materiale av ulike arter, embryoer av biomedisinske modellorganismer og prøver av andre organiske vev for å tillate digital volumdatautvikling med den høyoppløste episkopiske mikroskopi-metoden.

Abstract

Vi gir enkle protokoller for å generere digitale volumdata med høyoppløselig episkopisk mikroskopi (HREM) -metode. HREM kan forestille organiske materialer med volumer opp til 5 x 5 x 7 mm 3 i typiske numeriske oppløsninger mellom 1 x 1 x 1 og 5 x 5 x 5 μm 3 . Prøver er innebygd i metakrylatharpiks og snittet på en mikrotome. Etter hver seksjon er et bilde av blokkoverflaten tatt med et digitalt videokamera som sitter på fotobussen som er koblet til det sammensatte mikroskophodet. Den optiske aksen passerer gjennom et grønt fluorescerende protein (GFP) filterkube og er justert med en posisjon hvor bockholderarmen hviler etter hver seksjon. På denne måten produseres en serie av iboende justerte digitale bilder, som viser etterfølgende blokkoverflater. Lasting av en slik bildeserie i tredimensjonal (3D) visualiseringsprogramvare muliggjør umiddelbar konvertering til digitale volumdata, noe som tillater virtuell sEctioning i ulike ortogonale og skråplaner og oppretting av volum og overflate gjengitte datamodeller. Vi presenterer tre enkle, vevsspesifikke protokoller for behandling av ulike grupper av økologiske prøver, inkludert mus, kylling, vaktel, frosk og zebrafiskembryoer, humant biopsiemateriale, ubelagt papir og hudutskiftningsmateriale.

Introduction

Strukturell analyse av organiske og anorganiske materialer er det første trinnet i å forstå deres fysiske egenskaper og funksjon. Grunnlaget for slike analyser er ofte todimensjonale (2D) opplysninger oppnådd ved nøye observasjon av histologiske seksjoner, med en rekke enkle og sofistikerte bildemetoder som trekker ut detaljer om vevarkitektur, cellemorfologi og topologi, molekylær sammensetning og biomekaniske egenskaper 1 , 2 , 3 . Imidlertid er 2D-informasjon ikke egnet for å undersøke romlig komplekse arrangementer. Derfor ble det etablert et økende antall in vivo og ex vivo metoder som tillater generering av digitale volumdata i de siste tiårene 4 og mange flere er under utvikling.

Det metodiske prinsippet for mest volumdatautviklingsmetoder er genereringen av virtuelle stablerAv digitale bilder som viser seksjoner oppnådd ved virtuell eller fysisk deling av et objekt. Hvis seksjonsbildene er riktig justert, oppretter dette et volum som kan omdisponeres i virtuelle delplaner, eller brukes til å lage 3D-overflater og volum gjengitte modeller. Populære teknikker for å visualisere mennesker og større biologiske eksempler er magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronutslippstomografi (PET) og single-photon emission computed tomography (SPECT). Små prøver blir vanligvis visualisert ved hjelp av mikromagnetisk resonansbilder (μMRI), optisk projeksjonstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologisk delingsbaserte metoder, konfokalmikroskopi og elektrontomografi 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

En relativt ny volumdatautviklingsteknikk, som produserer digitale data fra små prøver og histologiske vevsprøver, er HREM-metoden, som ble utviklet i nært samarbeid med Tim Mohun 18 , 19 . Det er en enkel mikroskopbasert teknikk, som genererer digitale volumdata fra harpiksinkonstruert materiale som er delt på en mikrotome. Dataene lette detaljert analyse av vevarkitektur og cellefordelinger, samt metrisk analyse av små funksjoner på et mellomliggende lysmikroskopisk nivå.

HREM produserer stabler av iboende justerte digitale bilder som vises som om de er tatt fra eOsin-farget histologiske seksjoner. Vevskontrast og dataoppløsning i forhold til synsfeltet overstiger dataene produsert med μCT, μMRI og OPT, men er lavere enn det som er mulig med konfokal, lysark og elektronmikroskopi 20 . I motsetning til sistnevnte er HREM imidlertid i stand til å visualisere prøver med relativt store volumer på opptil 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. En rekke nyere studier gir detaljerte karakteriseringer og sammenligninger av fordeler og ulemper ved de enkle bildeteknikkene og, for objektivitetens skyld, refererer vi til dem for ytterligere informasjon om deres begrensninger og potensielle anvendelsesområder 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Denne studien fokuserer på HREM imaging metode og tar sikte på å giVeldig enkle protokoller for å generere HREM-data fra et bredt spekter av organiske materialer, samt eksempler på deres anvendelse. Arbeidsflyten for å lage HREM-data er enkel og gjelder for alle materialer som kan legge seg inn i metakrylatharpiks ( figur 1 ). Likevel er det vevsspesifikke forskjeller i prøvepreparasjon, som må vurderes. Vi gir derfor tre standardprotokoller for å lage forskjellige prøver. Innfeltings- og datalagringsprotokollstrinnene er identiske for dem alle.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført i samsvar med etiske retningslinjer ved medisinske universitetet i Wien.

1. Prøveforberedelse

  1. Forbereder embryo og embryovev (opptil 5 x 5 x 5 mm 3 )
    1. Fiks embryoer eller deler av embryoene i 4% PFA / PBS eller Bouins fikseringsmiddel ved 4 ° C i minst 16-24 timer under konstant rocking.
      MERK: Embryoer av flere arter og ulike utviklingsstadier kan brukes, for eksempel 48-h sebrafisk, 19-h kylling og vaktel, og også prenatale musembryoer, som ble brukt her (se Representative resultater ). Prøven ble høstet og overført til PBS ved romtemperatur for staging, før de ble satt i fikseringsmiddel. Om nødvendig, trim prøvene med mikrosaks eller skalpeller før fiksering for å passe inn i de innebygde muggene.
    2. Fjern fiksativet og vask embryovevet i PBS ved 4 ° C under konstant rockinG i 24 timer (2-3 endringer).
    3. Dehydrer prøvene i 70%, 80%, 90%, 96% etanol ved 4 ° C i 2 - 3 timer hver. Plasser rør som inneholder prøvene på en rotator.
      MERK: For små prøver (<2 x 2 x 2 mm 3 ), kan tiden som et prøve hviler i hvert etanol reduseres til 60 minutter. For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan det forlenges til 4 timer.
    4. Utfør følgende infiltrasjonstrinn under en hette med vernehansker.
      1. Forbered infiltreringsløsningen ved å tilsette 1,25 g benzoylperoksid (mykgjørende katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml løsning A (for mer informasjon, se Materialetabell ). Rør dette i et beger på en magnetisk omrøringsplate ved 4 ° C til eosin og katalysator er fullstendig oppløst (2 - 3 timer).
      2. Plasser prøvene i 12 - 24 timer i infiltreringsløsningen. Hold det ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotasjon. Bytt infiltreringsløsning med fersk oppløsning etter 3 og 12h.
        MERK: Forlenge infiltrasjonstiden til 48 timer for store embryoer (> 1 cm krone / rump lengde).
  2. Klargjøre prøver av voksenvev (opptil 5 x 5 x 7 mm 3 )
    1. Fest vevet i 2% PFA / PBS som inneholder 4% karbolsyre ved 4 ° C i minst 3 dager.
      MERK: Vevsprøve som kommer fra hud-, lever-, bukspyttkjertel-, nyre-, skjoldbruskkjertel-, hjerte-, striated muskel-, hjerne-, nerver- og tumormodeller av flere nyfødte og voksne mennesker, gnagere, griser, fruktfluer og sebrafisk kan løses i denne løsningen Og deretter behandlet for HREM-bildebehandling (vi demonstrerer fastsetting av prøvene, se Representative Results ). Få tak i vevsprøver med skalpeller, saks eller biopsi slag og overfør dem direkte til fikseringsmiddel. For fiksering av nervesvev, bruk 4% PFA / PBS.
    2. Fjern fiksativet og vask vevet under rennende vann fra springen i 3-6 timer.
    3. Dehydrere prøvene ved senere plasseringDe inneholdt dem i 70%, 80%, 90%, 96% etanol, blandet med 0,4 g eosin per 100 ml (2-3 timer hver). Hold løsningene med prøver ved 4 ° C under konstant rocking eller på rotator.
      MERK: For små prøver (<2 x 2 x 2 mm 3 ), kan tiden som et prøve hviler i hvert etanol reduseres til 60 minutter. For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ), kan det forlenges til 4-8 timer.
    4. Utfør alle de følgende infiltrasjonstrinnene under en hette med vernehansker.
      1. Forbered infiltreringsløsningen ved å tilsette 1,25 g benzoylperoksid (mykgjørende katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml løsning A (for flere detaljer, se tabell over materialer ). Rør i et beger på en magnetisk omrøringsplate ved 4 ° C til eosinet og katalysatoren er fullstendig oppløst (2 - 3 timer).
      2. Plasser prøver i infiltreringsoppløsning i 24 - 36 timer. Hold det ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotasjon. Bytt infiltreringsoppløsning med fersk oppløsning etter 3 og12 timer.
        MERK: For store prøver (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) forlenge infiltrasjonstiden til 48 timer.
  3. Forbereder annet organisk materiale
    MERK: Trim hudsubstitutter og papir til ønsket størrelse med vanlig saks. Ingen fiksering er nødvendig.
    1. Hopp over fiksering, vask og dehydreringstrinn.
    2. Utfør alle de følgende infiltrasjonstrinnene under en hette med vernehansker.
      1. Forbered infiltreringsløsningen ved å tilsette 1,25 g benzoylperoksid (mykgjørende katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml løsning A (for flere detaljer, se tabell over materialer ). Rør i et beger ved 4 ° C på en magnetisk omrøringsplate til eosin og katalysator er fullstendig oppløst (2 - 3 timer).
      2. Plasser prøver i infiltreringsløsning i 3 - 12 timer. Hold det ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotasjon. Bytt infiltreringsløsning med fersk oppløsning etter 1 og 2 - 4 timer.
      </ Li>

2. Embedding

MERK: Utfør alle trinnene under en hette med vernehansker.

  1. Forbered fersk infiltreringsløsning som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.4.1). Tilsett 4 ml løsning B (for detaljer, se tabell over materialer ) til 100 ml infiltrasjonsløsning for å klargjøre innlejringsløsningen.
    MERK: Hvis det er nødvendig med presis orientering av prøven i embedded muggene, og for å tillate integrering av flere prøver parallelt, senk polymeriseringen av stamløsningen ved å sette begeret i et isbad.
  2. Bruk støpeskuffer (for detaljer, se Materialebeskrivelse ) med forme som har et rutinevolum på 6 x 8 x 5 mm 3 eller 13 x 19 x 5 mm 3 , eller tilpassede mugg med volumer på opptil 8 x 10 x 15 mm 3 ( figur 2 ).
  3. Fyll muggene med innebygd løsning og overfør prøven til mugg meden skje. Under overføringen sørger du for at prøven er fullstendig dekket med innebygd løsning for å unngå luftfangst.
    MERK: Dette kan gjøres ved romtemperatur, hvis det påbegynnes umiddelbart etter at prøvene og innfødningsoppløsningen er samlet fra kjøleskapet.
    1. Rør prøven inn i formen ved å bruke nåler eller tapper.
    2. Så snart embedding-løsningen begynner å bli viskøs, plasser du en blokkholder (se Materialetabell ) på toppen av formen og legg til innleggingsløsning gjennom det sentrale hullet til blokkholderen til blokken på blokkholderen er dekket med 1 - 2 Mm av innebygd løsning.
    3. Tørk støpeboksbrettet ved å dekke det med flytende parafinvoks og vent til det har herdet seg. Alternativt kan du plassere et andre støpeboksbrett opp-ned på støpeboksbrettet med prøver og forsegle det med klebebånd til lufttett.
  4. Tillat blokker for å fullføre polymerisasjonen ved å lagre de forseglede støpeboksene for 1 -2 dager ved romtemperatur.
  5. For etterpolymeriseringsbehandling, legg støpeboksene med polymeriserte blokkene i en standard laboratorieovn og bake ved 70 - 80 ° C i minst 1 til 2 dager til de blir mørkrøde. Samle skuffene fra ovnen og fjern blokkene fra formen.
    MERK: Baking kan gjøres under normale miljøforhold. Dekkstøpebakkbrettet, som sikrer lufttett tetning i den første fasen etter embedding, kan fjernes for å tillate kontroll av fargen på harpiksen etter 10 timer. Umiddelbart etter baking er harpiksen myk og blokkene kan lett fjernes fra støpebeholderen. Innen 2 - 3 timer er de harde og kan lagres ved romtemperatur i flere måneder.

3. Generering av data

MERK: HREM prototypen 18 , 25 som brukes her, omfatter følgende elementer: (i) Roterende mikrotom med en blokkholderSom stopper etter hvert kutt på sitt øvre vendepunkt. (Ii) Standard, ikke-disponibel mikrotomkniv, hardmetall, profil D (for detaljer, se Materialetabell ). (Iii) Leder av fluorescensforbindelsesmikroskop med objektiv revolver og en GFP-filterkube (eksitasjon 470/40; utslippsfilter 525/50) i sin optiske akse. Den optiske aksen er anordnet vinkelrett på den ferske kutte overflaten av en blokk montert på mikrotomenet og holdes av en anordning som tillater opp- og nedoverbevegelse. (Iv) Motorisert tverrbord som bærer mikrotomenet. Bordet kan forskyves i retning av den optiske aksen og lateralt. (V) Digitalt videokamera festet til fluorescerende sammensatte mikroskop. (Vi) Monokrom lyskilde (470 nm). (Vii) Datamaskin koblet til kameraet, med datagenereringsprogramvare (for detaljer, se Materialebeskrivelse ).

  1. Fremgangsmåte
    1. Angi regionen av interesse.
      1. Bruk standard laboratorium liGht kilde (se Materialetabell ) for å dirigere hvitt lys skråt til blokkoverflaten.
      2. Identifiser konturene til det innebygde materialet som det prosjekterer til blokkoverflaten. Angi området av interesse og senere synsfelt på blokkoverflaten ved hjelp av en penn eller knivblad.
        MERK: Dette trinnet er obligatorisk for å definere omfanget av synsfeltet før snitting.
    2. Definer synsfeltet.
      1. Fest harpiksblokken med prøve på mikrotomen.
      2. Flytt blokkholderen til stoppposisjonen (øvre vendepunkt for blokkholderens utflukt).
      3. Start digitalkameraet og datagenereringsprogramvaren, og kjøp et levende bilde.
      4. Velg en objektivlins, med en passende forstørrelse for å dekke området av interesse som er angitt på blokkoverflaten.
        MERK: Mål med forstørrelser 2.5X, 5X, 10X, 20X og numeriske åpninger mellom 0,07 og 0,40 brukes vanligvis. Flytt optikken opp og ned og mikrotomen sidelengs ved hjelp av det motoriserte tverrbordet til interessepunktet samsvarer med synsfeltet som vises på skjermen.
    3. Fokus.
      1. Utfør trinnvis manuell snitting til første struktur av prøven blir synlig.
      2. Ordne blokkoverflaten i fokusplanet til optikken, ved å flytte mikrotomen i retning av den optiske aksen.
      3. Velg seksjon tykkelse; Seksjonstykkelser fra 0,5 til 5 μm anbefales.
  2. Datagenerering og prosessering
    1. Start programvarerutine som orkestrerer snitting og bildeopptak. Følg den dokumenterte instruksjonen til bildeopptakingsprogramvaren.
    2. Stopp programvarerutinen og sett et skaleringsbilde foran blokkoverflaten så snart prøven er helt snittet.
    3. Ta et bilde interaktivt for senere kalibreringsjon.
      MERK: Dette må gjøres hver gang et mål brukes i en nyopprettet oppsett.
    4. Konverter bilde serien til 8 bit gråskala bilder in.jpg format.
    5. Legg bildeserien i 3D-visualiseringsprogramvare og juster kontraster.
      MERK: Bildekonvertering og 3D-visualisering kan gjøres med ulike kommersielle eller fritt tilgjengelige standardprogrammer, etter instruksjonene i den respektive programvaren.

Representative Results

HREM genererer serie av iboende justerte digitale bilder med kontraster som ligner på bilder av hematoksylin / eosin-farget histologiske seksjoner. I motsetning til 2D-seksjonsbilder tillater stabler av HREM-bilder visualisering og analyse av vevarkitektur, morfologi og topologi av et bredt utvalg av organiske materialer i 3D. Den høye kontrasten letter ofte hurtig og enkel 3D-visualisering av volum gjengitte datamodeller og semiautomatiske konturfunn for generering av overflatemargede modeller.

Størrelsen på HREM-data varierer i henhold til størrelsen på kameramålet, modusen for bildeopptak (8, 12, 16 bit, gråskala, farge) og antall enkeltblokkedeffbilder. Mindre datasett med 1000 8-bit.jpg gråskala bilder på 2.048 piksler x 2.048 piksler har en størrelse på ca 900 MB. Større datasett med 3 000 8-bit.jpg gråskala bilder på 4.096 pIxel x 4.096 piksler har volumer på omtrent 20 GB.

Protokollene som tilbys er enkle og robuste, og i løpet av de siste tiårene var de ansatt for å generere HREM-data fra mange forskjellige prøver. Protokoll seksjon 1.1 ble optimalisert for behandling av hele embryoer av biomediselle modellorganismer med en lengde på opptil 1 cm og embryovevsprover med en dimensjon på opptil 5 x 5 x 5 mm 3 ; Vi brukte denne metoden for å produsere HREM-data av embryoer av følgende arter: mus ( Mus musculus) , kylling ( Gallus gallus ), sebrafisk ( Danio rerio ), vaktel ( Coturnix coturnix) , Afrikansk klødd frosk ( Xenopus laevis ), hest Equus ferus caballus ), milkweed bug ( Oncopeltus fasciatus ), krokodille ( Crocodylia ) og blekksprut ( Octopus vulgaris ). Dataene for alle arter var av utmerket kvalitet ( f.eks . Figur 3 )

3 og anvendt til å visualisere vevsprøver av Hud, lever, bukspyttkjertel, nyre, skjoldbruskkjertel, hjerte, strikket muskel, hjernen, nerver og svulstmodeller høstet fra mennesker ( Homo sapiens ), mus ( Mus musculus ), rotter ( Rattus norvegicus ), svin ( Sus scrofa domestica ) ferret ( Mustela Furo ), fruktfluer ( Drosophila melanogaster ) og sebrafisk ( Danio rerio ). Selv om resultatene var gode med de fleste eksempler ( f.eks . Figur 4 , Animasjon 1 ), ble de svært sentrale delene av huden (med epidermis) og hjerneprøver større enn 3 x 3 x 3 mm 3 ofte uberørte på grunn av utilstrekkelig penetrasjon av eosin gjennom Disse vevene.

Protokoll sEksjon 1.3 ble optimalisert for behandling av fibrøst organisk materiale og anvendt for å visualisere fiberarkitekturen av belagt papir, ikke-belagt papir, naturlig dermal substitusjonsmateriale og stamceller-frøet dermal substituttmateriale. Disse prøvene var enkle og raske å behandle. Dataene på det ikke-belagte papiret og de fleste hudsubstitutter var av god kvalitet ( figur 5 , animasjon 2 ). Det oppstod problemer ved behandling av det belagte papiret, da det uorganiske materialet hindret penetrasjon av eosin. Et annet problem oppstod ved behandling av hudsubstitutter på grunnlag av agar fordi de ble delvis fordøyd av infiltreringsløsningen.

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt. Trinn som vises i de røde boksene krever endringer i henhold til utvalgskarakteristikker. Trinn i de grønne boksene er de somEr like i alle prøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Tilpassede former. Former kan tilpasses ved å kutte hull i den originale molden, sette inn en Pasteur-pipes pære og forsegle den med modelleringsmateriale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Eksempelvis visualiserte embryoer. (A, B) Musembryo høstet på embryonisk dag, E = 9,5. HREM-seksjonsbilde er vist i (A) (B) . (C) Virtuell sagittal seksjon gjennom en volum gjengitt modell av nakken på et E15.5 musembryo. (D) Chick embryo ved Hamburger Hamilton (HH) stadium 18. Overflate modell av armaturen i kardiovaskulære komponenter kombinert med volum gjengivelse av alle embryo vev. Skalestenger = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Eksempelvis visualiserte Voksne Vevsprøver. (A) Del av et HREM-seksjonsbilde gjennom en menneskelig nerve. Inlay viser en del av bildet mer detaljert. (B) Del av et HREM-seksjonsbilde gjennom svinelever. Legg merke til nuclei. (C) Del av et HREM-seksjonsbilde av humant lymfatisk vev. (D, E) Tykk hud på en menneskelig tommelplate. Volum gjengitt 3D-modell av hele biopsien. (D) Overflate gjengitte modeller av arterier, vener og nerver foran en virtuell reseksjon gjennom HREM data (E) . (F) Eksperimentell tumor i voksen musvev. Volum gjengitt 3D-modell foran tre virtuelle seksjoner gjennom HREM-data. Legg merke til de nekrotiske delene (pilehoder). Skalestenger = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Eksempelvis visualisert fibermateriale. (A, B) HREM-seksjonsbilde av ubelagt, brunt papir. (B) (A) . Legg merke til fibrene og deres lumen. (C) HREM-delen av belagt papir. Legg merke til at fibrene forblir ufarget. (D) Volum gjengitt modell av naturlig dermal substitutt materiale. Legg merke til kaliber og form av fibrene. Skalestenger = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1
Animasjon 1: Volum Rendered Modell av Tykk hud av en Human Thumb Pad. Størrelsen på vævsblokken er ca. 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel størrelse er 1,07 x 1,07 x 2 um 3 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)


Animasjon 2: Volum Rendered Modell av Native Dermal Substitute Material. Størrelsen på prøven er ca. 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel størrelse er 0,54 x 0,54 x 2 um 3 . Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Discussion

HREM er en svært robust mikroskopisk metode som er ideell for å visualisere et bredt spekter av organiske materialer som brukes i biomedisin og industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Det kan brukes som en eksklusiv avbildningsmodalitet, som for tiden brukes av DMDD-programmene 41 , 42 43 , 44 eller som en integrerende del av multimodale bildebehandlingsrørledninger 45 .

Et fullt fungerende HREM-datagenereringsapparat kan settes sammen fra konvensjonelle laboratoriekomponenter og omfatter et motorisert mikrotom, mikroskop, motorisert tverrbord og en datamaskin med passende programvare 25 . Det er kritisk å bruke en mikrotome utstyrt med en blokkholder som reproduserbart stopper etter hver seksjon i en definert posisjon og GFP filterkuber inne i den optiske banen. Fullstendig fungerende all inclusive-løsninger kan imidlertid kjøpes fra selskaper som Indigo Scientific.

HREM står overfor de samme begrensningene som alle histologiske teknikker, bortsett fra at ingen gjenstander blir introdusert under seksjon eller seksjonmontering. Imidlertid er det begrensninger, som skyldes nødvendigheten av å plette prøver før snitt ogFra egenskapene til det innebygde materialet. Penetrasjon av eosin gjennom hele prøven er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig vevskontrast; Meget tett materiale, fettvev og anorganiske stoffer hindrer effektivt eosinpenetrering, og dette resulterer i ufarget vev i midten av gjenstandene. Ved hjelp av spesielle fikseringsmidler hjelper flekk hudprøver, men det er fortsatt ingen riktig metode for å overvinne problemet fullt ut. En annen begrensning er at harpikser som blokkerer høyere enn 2 cm, har en tendens til å bryte under snitting. Dette kan delvis unngås ved å kutte prøver og behandle deler separat.

Korrekt plassering av små prøver eller prøver med uregelmessige overflater i formene under embedding er ofte problematisk. Dekker prøvene med agarose og behandler agaroseblokkene som beskrevet i protokollen, løser vanligvis dette problemet 19 . En alternativ tilnærming, som også bidrar til at blokkene går i stykkerPå å fjerne den allerede herdede blokken fra holderen og legge den inn på nytt ved å følge den beskrevne embedingsprosedyren.

Et typisk HREM datasett består av 500 til 3000 enkeltbilder. Dens numeriske oppløsning bestemmes av avstanden mellom de etterfølgende bildene ( dvs. av tykkelse av tykkelsen), karakteristikken til kameramålet og egenskapene til den anvendte optikken. Vi brukte seksjonstykkelser mellom 1 μm og 5 μm og oppnådde gode resultater, selv om de presenterte protokollene ikke helt eliminerer skinner fra artefakter 20 , 46 . Disse artefakter er forårsaket av intenst flekkete vev som ligger dypt inne i blokken, noe som resulterer i uskarphet av vevsinformasjon på blokkflatene ved.

Kameraene hadde måldimensjoner på 2.560 x 1.920 piksler 2 , 2.048 x 2.048 piksler 2 og 4.096 x 4.096 piksler 2 og var combiNed med objektivene på objektivet 1.25X, 2.5X, 5X, 10X og 20X. Dette resulterte i numeriske pikselstørrelser mellom 0,18 x 0,18 μm 2 og 5,92 x 5,92 μm 2 , som viste seg å være tilstrekkelig for 3D-analyse av vevarkitektur og celleformer, og til og med for visualisering av kjerner. Gitt den høye talloppløsningen, bør andre cellelegemer også være synlige. Utilstrekkelige kontraster på grunn av enkel eosinfarging, og de optiske egenskapene til målene reduserer dramatisk muligheten til å diskriminere strukturer. Den maksimale sanne romlige oppløsningen til HREM-dataene, som tar hensyn til numerisk blenderåpning, er ca. 1 x 1 x 1 μm 3 , og tillater derfor kun effektiv diskriminering av strukturer som er større enn ca. 3 x 3 x 3 μm 3 .

Et vanlig problem for alle digitale bildebehandlingsteknikker er avviket mellom størrelsen på synsfeltet, som definerer delen av prøven som kan visesD på kameraets mål og den numeriske oppløsningen til bildet. Jo større synsfelt, desto lavere er den maksimale talloppløsningen 46 . HREM-oppsettet som brukes her tillater generering av HREM-data med et synsfelt mellom 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) vist i en numerisk oppløsning på 0,18 x 0,18 μm 2 og 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25 x objektiv) vist i En numerisk oppløsning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternative, kommersialiserte oppsett kan gi større synsfelt, men på bekostning av sann oppløsning. Likevel gir de gode resultater, så tydelig fra dataene som vises på hjemmesiden til DMDD-programmet 47 .

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Tim Mohun for sine invalubale bidrag i utviklingen av HREM og Petra Heffeter for å gi prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6 x 8 x 5 mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13 x 19 x 5 mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life's processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy - current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD. , Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 125 Episkopisk avbildning 3D modellering embryo biopsi menneskelig mus kylling zebra fisk frosk
Høyoppløselig episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkle og robuste protokoller for behandling og visualisering av organiske materialer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B.,… More

Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter